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Artigo de método

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

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DOI:

10.3791/52665

1 de maio de 2015

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

As células humanas mieloma múltiplo (MM) requerem o microambiente favorável de células mesenquimais e componentes da matriz extracelular para a sobrevivência e proliferação. Nós estabelecemos um modelo vivo de embriões em frango com células de mieloma e mesenquimais humanas enxertados para estudar os efeitos de medicamentos contra o câncer no crescimento do tumor, invasão e angiogênese.

Resumo

O mieloma múltiplo (MM), uma doença maligna de células plasmáticas, permanece incurável e novas drogas são necessárias para melhorar o prognóstico dos pacientes. Devido à ausência do microambiente do osso e factores de crescimento auto / parácrina células MM humanos são difíceis de cultivar. Portanto, existe uma necessidade urgente de estabelecer adequada in vitro e em sistemas de cultura in vivo para estudar a acção de novas terapias em culas do MM humanos. Aqui é apresentado um modelo para crescer as células de mieloma múltiplo humano num ambiente 3D complexo in vitro e in vivo. Linhas celulares de MM OPM-2 e meio RPMI-8226 foram transfectadas para expressar o transgene GFP e foram cultivadas na presença de células mesenquimais humanas e de colagénio do tipo I como matriz esferóides tridimensionais. Além disso, os esferóides foram enxertados sobre a membrana corioalantóica (CAM) de embriões de galinha e o crescimento do tumor foi monitorizado por meio de microscopia de fluorescência estéreo. Ambos os modelos permitem o estudo do romance dru terapêuticogs em um ambiente 3D complexo e a quantificação da massa de células de tumor após a homogeneização dos enxertos em um GFP-ELISA específicos do transgene. Além disso, as respostas angiogénicas do hospedeiro e a invasão de células tumorais para o tecido hospedeiro subjacente pode ser monitorizado diariamente por um microscópio estéreo e analisadas por coloração imuno-histoquímica contra células humanas de tumor (Ki-67, CD138, vimentina) ou células hospedeiras murais cobrindo vasos sanguíneos (desmina / ASMA).

Em conclusão, o sistema onplant permite estudar o crescimento de células MM e angiogénese num ambiente 3D complexo e permite o rastreio de novos compostos terapêuticos que visam a sobrevivência e proliferação das células do MM.

Introdução

O mieloma múltiplo (MM) é caracterizado pela proliferação de plasmócitos malignos na medula óssea, lesões ósseas e imunodeficiência 1. Embora novas opções de tratamento, como inibidores de proteassoma (bortezomibe) e drogas imunomoduladoras (pomalidomida e lenalidomida), estejam disponíveis, o MM ainda permanece uma malignidade incurável com um prognóstico sombrio 2. O mau prognóstico pode ser explicado pela extraordinária heterogeneidade dos clones de células MM que contribui para respostas variáveis à terapia, em particular sob tratamento prolongado e pressão de seleção de clones MM 3.

O teste pré-clínico de novos medicamentos e suas combinações in vitro e in vivo é uma etapa crítica e demorada para o desenvolvimento futuro de medicamentos. Assim, modelos in vivo úteis de MM são necessários para obter uma melhor compreensão da biologia da doença e permitir a descoberta de novos medicamentos. Na verdade, os melhores modelos de xenotransplante para neoplasias hematológicas e terapêuticas são camundongos imunodeficientes, como os camundongos imunodeficientes combinados graves (SCID) 4-7, os camundongos diabéticos não obesos / SCID (NOD / SCID) 8,9 ou os camundongos NOD / SCID nocaute para β-microglobulina 10,11.

Embora os modelos murinos de MM humano em alguns aspectos possam se assemelhar ao fenótipo da doença humana, os camundongos imunodeficientes são endogâmicos, portanto, simulam apenas uma resposta individual a um medicamento e os custos são muito altos. Devido à imunossupressão, os animais requerem condições especiais de manutenção e o enxerto de MM humano em camundongos requer de 6 semanas a 2 meses 9,12, a menos que as células sejam enxertadas diretamente na medula óssea usando um procedimento tecnicamente exigente com menores taxas de sobrevivência animal 7,13. Portanto, novos métodos usando modelos organoides baseados em células-tronco 14, engenharia de tecidos 15 ou modelos sofisticados de cultura de células 3D 16 foram estabelecidos. Eles competirão em um futuro próximo com experimentos clássicos em animais para testes pré-clínicos de drogas, mas não podem substituir os testes de toxicidade sistêmica em organismos vivos.

O embrião de galinha já demonstrou ser um organismo adequado para xenotransplante de células e tecidos humanos devido à falta de resposta imune adaptativa até a eclosão 17-19. Além disso, cada embrião de galinha reflete uma reação individual a drogas aplicadas ou células tumorais devido à diversidade genética dentro da população de galinhas. A membrana corioalantóide (CAM) é um sistema bem estabelecido para estudar a angiogênese tumor-dependente 20-22. Quando os tumores sólidos são enxertados no CAM, eles exibem muitas características dos cânceres in vivo, incluindo proliferação, invasão, angiogênese e metástase 23-27.

Com base na experiência anterior de nosso grupo com modelos de xenoenxerto CAM20,26,27, foi estabelecido um modelo MM humano que combina a vantagem de um sistema de cultura 3D humano com o modelo de embriões de galinha em desenvolvimento ex ovo. Este sistema modelo MM permite o monitoramento em tempo real da progressão do crescimento do MM, quantificação da massa celular e testes pré-clínicos de drogas.

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Protocolo

De acordo com o direito austríaco, e do Gabinete do Laboratório Animal Welfare dos EU Public Health Service embriões de aves não são considerados como animais vertebrados vivos até hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare providenciou orientações escritas neste domínio (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm e Publicação NIH Nº .: 06-4515).

1. celular Cultura e Lentivirus Transfection

  1. Cultura linhas celulares MM OPM-2, meio RPMI-8226 e as células estaminais mesenquimais humanas a partir de medula óssea em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal de vitelo e 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e glutamina 2 mM na presença de 5% de CO2 a 37 ° C.
  2. Transfectar 5 x 10 6 células HEK 293FT com mistura de ADN virai de embalagens (9 g) e 3 ug pLenti6 / V5 dest eGFP vector através da utilização de 30 ul de reagente de transfecção lipossómica e meio de transfecção (10 mL). Remover o meio de transfecção após 12 h eadicionam-se 10 ml de meio DMEM com 10% de soro de bezerro de bovino e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA).
  3. Após 5 dias, recolher sobrenadantes de células HEK293FT após a centrifugação das células de natação (1000 xg, 5min). Determinar título viral por PCR em tempo real como descrito noutros locais 28.
  4. Transfectar 1 x 10 6 culas de MM com partículas lentivirais eGFP (1 x 10 5) partículas em uma placa de 24 poços em meio de crescimento completo. Após 3 dias, iniciar o processo de selecção por adição de 2 ug / ml de blasticidina para o meio de cultura. Para o lentivírus eGFP disponível comercialmente, utilizar 500 ug / ml de neomicina.
  5. Após 2 semanas de selecção, aglomerados de células que expressam eGFP MM irá aparecer; coletar células por centrifugação (1000 x g, 5 min) e expandi-los como OPM-2 eGFP e RPMI-8226 sublinhas eGFP para experimentos (seção 2 e 3).

2. 3D-Multiple Myeloma Modelo Esferóide

  1. Solução de colágeno tipo I Frio e 10 x DMEM oN gelo.
  2. Misture 10/01 Volume de 10 x meio DMEM em matriz de colágeno; adicionar NaOH (0,2 N) para neutralizar a solução de colagénio ácida a um valor de pH de 7,4; loja de colágeno / solução médio no gelo.
  3. Misture linhas celulares MM transgênicos (OPM-2 eGFP ou RPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferóide,) com células humanas mesenquimais (50.000 células / esferóide, ou seja, queda de 30 mL).
  4. Centrifugar mistura de células em tubos de 15 ml (1.000 xg, 5min), adicione a mistura de colagénio preparado frio (1 mL) ao sedimento de células e misturar bem (1000 uL com ponta).
  5. Imediatamente pipeta 30 ul da mistura de colagénio / célula (com ponta 100 ul) numa placa de 24 poços em filme de parafina estéril e permitir mistura célula / colagénio para polimerizar durante 30 minutos a 37 ° C (ver Figura 1A).
  6. MM esferóides de sobreposição com meio de cultura contendo 1 mL de 1, 10 e 100 nM bortezomib (ver Figura 1B).
  7. Após 72 horas de incubação a 37 ° C, esferóides de documentos porestereomicroscopia de fluorescência (ver Figura 1C).
  8. Transferir cada esferóide pelo uso de fórceps com maxilas lisas de largura num tubo de reacção para a medição de GFP (ver Figura 1D).

3. 3D do mieloma múltiplo Xenoenxerto Modelo no CAM

  1. Incubar ovos de galinha em uma incubadora de ovos de aves especial a 37 ° C e 70% de humidade durante três dias.
  2. Em seguida, abertas e ovos embriões de transferência para esterilizados com etanol, quadrada, de 10 cm de pesagem de plástico de cultura de células com barcos placa da tampa e incubar "ex ovo" para mais de seis dias, de modo que o CAM é capaz de desenvolver (ver Figura 2A).
  3. Solução de colagénio de tipo I Frio e 10 x DMEM em gelo, mistura 1/10 de volume de 10 x em meio DMEM matriz de colagénio, adiciona-se NaOH (0,2 N) para neutralizar a solução de colagénio ácida a um valor de pH de 7,4; loja de colágeno / solução médio no gelo.
  4. Misture linhas celulares de MM transgénico (OPM-eGFP ou 2RPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferóide,) com células mesenquimais humanas (50.000 células / esferóide).
  5. Centrifugar as células em tubos de 15 ml (1.000 xg, 5 minutos, para cada composto de teste um frasco), adicionar 1 mL de mistura de colagénio preparada a frio com o fármaco (a concentração de trabalho pretendida) à pelete de células e misturar bem (1000 uL com ponta).
  6. Coloque colagénio gotas (30 ul cada) em parafilme em um patê 6 bem durante 30 min para permitir que a polimerização da matriz extracelular, a 37 ° C.
  7. Transferência "onplants" do passo 3.6 com a utilização de uma pinça para a superfície da CAM não tratada (2 cm de distância do embrião) de embriões de galinha de 9 dias de idade (4 onplants para cada embrião de frango, ver Figura 2B)
  8. Após 5 dias de crescimento in vivo em uma incubadora de ovos a 37 ° C e 70% de humidade, xenoenxertos de documentos por estereomicroscopia de fluorescência (ver figura 2C). Euthanize embriões de galinha por hipotermia a 4 ° C no frigorífico durante 5 h.
  9. Remover xenografts com tecido CAM subjacente por uma tesoura oftálmica e forceps com grandes mandíbulas planas. Use-os para a medição da GFP (seção 4, veja a Figura 2D) ou para análise imuno-histoquímica dos vasos sanguíneos e / ou invadindo células tumorais (Seção 5).

4. Quantificação de Proteína eGFP por ELISA

  1. Transferir cada esferóide MM ou xenoenxerto excisada em 0,5 ml de tampão RIPA contendo inibidores de protease / ml 200 ug.
  2. Homogeneizar esferóide / xenoenxerto com um homogeneizador de tecidos em gelo.
  3. Execute três congelamento / descongelamento ciclos em nitrogênio líquido e 37 ° C banho de água.
  4. Centrifugar homogeneizado a 4 ° C durante 20 min (12.000 g) e os sobrenadantes da loja.
  5. Diluir as amostras de 1:20 em tampão de ensaio (200 ul) de o kit de ELISA. Medir-níveis GFP GFP por um kit de ELISA comercial utilizando anticorpos anti-GFP biotinilados, de acordo com o protocolo do fabricante.

5. Immunohistochemical Análise de vasos sanguíneos e invadindo células tumorais

  1. Fix xenoenxertos excisado com área CAM em paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C.
  2. Coloque xenoenxertos fixos em cassetes de embebimento e transferi-los para uma estação de incorporação de tecido com uma série crescente álcool graduado (50%, 70%, 80%, etanol a 95%, xileno e parafina; cada passo 60 min).
  3. Xenoenxertos de secção (5 ^ m) através da utilização de um micrótomo rotativo de bancada. Coza secções de parafina em lâminas de vidro O / N a 56 ° C.
  4. Desparafinar secções por uma série de álcoois graduados diminuindo a água duplamente destilada (xilol, 95%, 80%, 70%, etanol a 50%, água bidestilada; cada passo 10 min).
  5. Executar a recuperação de antigénio em um banho de água (95 ° C, 20 min) com uma solução de recuperação de antigénio (citrate- tampão, pH 7,0, volume 100 ul).
  6. Bloquear a actividade da peroxidase endógena com 100 ul de 3% de H 2 O 2 / metanol durante 30 min.
  7. Seções bloco em PBS contendo10% de soro fetal de vitelo durante 45 min (volume 100 ul).
  8. Mancha durante 1 h com 100 uL de anticorpo primário (1 ug / ml) diluído em PBS contendo 1% de soro de vitelo fetal, à TA.
  9. Após lavagem três vezes em PBS, incubar durante 1 hora com o anticorpo secundário biotinilado (0,1? G / ml) em PBS contendo 1% de soro de vitelo fetal, à TA.
  10. Após lavagem três vezes em PBS realizar a reacção de cor por a solução de avidina / (DAB) de substrato-biotina complexo (ABC) e o diaminobenzidina de acordo com as instruções do fabricante.
  11. 5.11. Parar a reacção por transferência de secções de água duplamente destilada, de contraste com hematoxilina e montar secções com um meio de montagem sintético.

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Resultados

Na análise in vitro de compostos alvo em 3D mieloma múltiplo ensaios esferóides

Devido à limitação da cultura de culas do MM in vitro humanos primários estabelecemos novos modelos in vitro de cultura 3D para linhas celulares MM humanos que utilizam uma matriz extracelular e crescimento de células mesenquimais humanas primárias de suporte a partir de medula óssea (Figura 1A, B). Linhas celulares MM transgênico EGFP permitir...

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Discussão

O desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para refractário MM requer menos demorado e caro sistemas in-vivo para avaliar a sensibilidade de culas de MM humano para drogas. Até à data, poucos sistemas in vivo estão disponíveis para a avaliação pré-clínica de novas terapias anti-mieloma. Todos eles têm as suas limitações para o rastreio em larga escala de bibliotecas de compostos 29.

Os melhores modelos atuais para células MM humanos são altamente ratos imunodeficientes 7,13,30 e e...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes

Agradecimentos

Os autores querem agradecer à Sra. Cornelia Heis por sua excelente assistência técnica em imuno-histoquímica e preparação de embriões de galinha. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Austríaco para a Ciência (FWF Grant No. P19552) e pela União Europeia (EU FP7 project Optatio No: 278570).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células RPMI-8226DSMZACC 9STR perfiladas
OPM-2 célulasDSMZACC 50STR perfiladas
Células-tronco mesenquimais humanas PromoCellPC-C-12974
HEK293FT células InvitrogenR700-07
RPMI1640 Sigma MédioSoro Fetal Bovino AldrichR0883
  HyCloneThermoScientificSH30070.03
L-Glut- Pen- Solução StrepSigmaG6784
DMEM MediumGibco31966
NEAALife SciencesM7145
Transfection Medium/Opti-MEM eGFP Gibco51985
GeneCopoeiaLPP-EGFP-LV105Partículas virais prontas para uso
pLenti6/V5Dest6 vetor eGFPInvitrogenPN 35-1271dos autores
Mix de embalagem ViralpowerTM InvitrogenP/N 35-1275
Reagente de transfecção/ Lipofectamin 2000Invitrogen11668-027
BlasticidinaInvitrogenR210-01
NeomicinaBiochromA2912
Tipo de colágeno1  Cauda de ratoBD Biosciences354236
pó DMEMLife TechnologiesArt.Nr. 10338582
plitidepsinaPharmamar
bortezomibLKT Lab., Inc.B5871
SPF-ovos de galinha brancosCharles RiverFertilizados  ovos de galinha Leghorn  brancos
Barcos de pesagem de plásticoneoLabArt.Nr. 1-1125para cultura ex-ovo
Quadrado de Petridish (Tampas)SimportD210-16para cultura ex-ovo
Tampão RIPA (10x)Sinalização Celular#9806
Protease Comprimidos InibidoresRoche11 836 170 001
Mini GFP ELISA
Cell Biolabs, Inc.AKR-121
Histocette IISimportM493-6
PFA  37%Roth7398.1
DPBSLonzaBE17-512F
Etanol AbsolutoNormapur20,821,321
Roti-HistolRothArt.Nr.6640.4
ParaplastSigmaA6330
Lâminas de Microscópio SuperFrostR. Langenbrinck Art.-Nr.
Trabalho- u. Medizintechnik03-0060
DakoCytomation Tampão de Lavagem 10xDakoCytomationCódigo-Nr.
S 3006
Solução de Recuperação de Alvo (10x)  pH 6,1Código DAKO-Nr.
S 1699
H2O2Merck
m-a-hu ASMA clone 1A4DAKOM0851
m-a-hu CD138 clone MI15DAKOM7228
m-a-hu Vimentin clone V9DAKOM0725
m-a-hu Desmin clone D33DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  clone MIB-1   DAKO  M7240
cabra biotinilada - anti-rato IgGVector Laboratories Inc.BA-9200
Vectastain Elite ABC KitVector Laboratories Inc.# PK-6100
Conjunto de Tablet FAST DAB.Sigma Biochemicals# D4293
Mayer' s solução de haemalaunMerck1,092,490,500
Roti HistokittRothArt.Nr.6638.2
Micrótomo rotativo de bancadaThermo Electron, Shandon Finesse ME+
Estação de incorporação de tecidosLeica, TP1020
Incubadora de OvosGrumbach BSS160
Microscópio de fluorescência estéreo equipado com uma câmera digital conectada (Olympus E410) e luz fria flexível Olympus, SZX10
Ultra Turrax HomogeneizadorIKA T10
Partículas lentivirais

Referências

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Modelo de Embri o de GalinhaAn lise do Crescimento TumoralMedi o da Express o de GFPEnxerto de Membrana CorioalantoideMicroscopia de Fluoresc ncia Estereosc picaColora o Imunohistoqu micaQuantifica o por GFP ELISAC lulas Mesenquimais HumanasMatriz de Col geno Tipo I