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Artigo de método

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

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DOI:

10.3791/52665

1 de maio de 2015

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

As células humanas mieloma múltiplo (MM) requerem o microambiente favorável de células mesenquimais e componentes da matriz extracelular para a sobrevivência e proliferação. Nós estabelecemos um modelo vivo de embriões em frango com células de mieloma e mesenquimais humanas enxertados para estudar os efeitos de medicamentos contra o câncer no crescimento do tumor, invasão e angiogênese.

Resumo

O mieloma múltiplo (MM), uma doença maligna de células plasmáticas, permanece incurável e novas drogas são necessárias para melhorar o prognóstico dos pacientes. Devido à ausência do microambiente do osso e factores de crescimento auto / parácrina células MM humanos são difíceis de cultivar. Portanto, existe uma necessidade urgente de estabelecer adequada in vitro e em sistemas de cultura in vivo para estudar a acção de novas terapias em culas do MM humanos. Aqui é apresentado um modelo para crescer as células de mieloma múltiplo humano num ambiente 3D complexo in vitro e in vivo. Linhas celulares de MM OPM-2 e meio RPMI-8226 foram transfectadas para expressar o transgene GFP e foram cultivadas na presença de células mesenquimais humanas e de colagénio do tipo I como matriz esferóides tridimensionais. Além disso, os esferóides foram enxertados sobre a membrana corioalantóica (CAM) de embriões de galinha e o crescimento do tumor foi monitorizado por meio de microscopia de fluorescência estéreo. Ambos os modelos permitem o estudo do romance dru terapêuticogs em um ambiente 3D complexo e a quantificação da massa de células de tumor após a homogeneização dos enxertos em um GFP-ELISA específicos do transgene. Além disso, as respostas angiogénicas do hospedeiro e a invasão de células tumorais para o tecido hospedeiro subjacente pode ser monitorizado diariamente por um microscópio estéreo e analisadas por coloração imuno-histoquímica contra células humanas de tumor (Ki-67, CD138, vimentina) ou células hospedeiras murais cobrindo vasos sanguíneos (desmina / ASMA).

Em conclusão, o sistema onplant permite estudar o crescimento de células MM e angiogénese num ambiente 3D complexo e permite o rastreio de novos compostos terapêuticos que visam a sobrevivência e proliferação das células do MM.

Introdução

O mieloma múltiplo (MM) é caracterizado pela proliferação de plasmócitos malignos na medula óssea, lesões ósseas e imunodeficiência 1. Embora novas opções de tratamento, como inibidores de proteassoma (bortezomibe) e drogas imunomoduladoras (pomalidomida e lenalidomida), estejam disponíveis, o MM ainda permanece uma malignidade incurável com um prognóstico sombrio 2. O mau prognóstico pode ser explicado pela extraordinária heterogeneidade dos clones de células MM que contribui para respostas variáveis à terapia, em particular sob tratamento prolongado e pressão de seleção de clones MM 3.

O teste pré-clínico ....

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Protocolo

De acordo com o direito austríaco, e do Gabinete do Laboratório Animal Welfare dos EU Public Health Service embriões de aves não são considerados como animais vertebrados vivos até hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare providenciou orientações escritas neste domínio (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm e Publicação NIH Nº .: 06-4515).

1. celular Cultura e Lentivirus Transfection

  1. Cultura linhas celulares MM OPM-2, meio RPMI-8226 e as células estaminais mesenquimais humanas a partir de medula óssea em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal de vitelo e 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml d....

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Resultados

Na análise in vitro de compostos alvo em 3D mieloma múltiplo ensaios esferóides

Devido à limitação da cultura de culas do MM in vitro humanos primários estabelecemos novos modelos in vitro de cultura 3D para linhas celulares MM humanos que utilizam uma matriz extracelular e crescimento de células mesenquimais humanas primárias de suporte a partir de medula óssea (Figura 1A, B). Linhas celulares MM transgênico EGFP permitir.......

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Discussão

O desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para refractário MM requer menos demorado e caro sistemas in-vivo para avaliar a sensibilidade de culas de MM humano para drogas. Até à data, poucos sistemas in vivo estão disponíveis para a avaliação pré-clínica de novas terapias anti-mieloma. Todos eles têm as suas limitações para o rastreio em larga escala de bibliotecas de compostos 29.

Os melhores modelos atuais para células MM humanos são altamente ratos imunodeficientes 7,13,30 e e.......

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes

Agradecimentos

Os autores querem agradecer à Sra. Cornelia Heis por sua excelente assistência técnica em imuno-histoquímica e preparação de embriões de galinha. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Austríaco para a Ciência (FWF Grant No. P19552) e pela União Europeia (EU FP7 project Optatio No: 278570).

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células RPMI-8226DSMZACC 9STR perfiladas
OPM-2 célulasDSMZACC 50STR perfiladas
Células-tronco mesenquimais humanas PromoCellPC-C-12974
HEK293FT células InvitrogenR700-07
RPMI1640 Sigma MédioSoro Fetal Bovino AldrichR0883
  HyCloneThermoScientificSH30070.03
L-Glut- Pen- Solução StrepSigmaG6784
DMEM MediumGibco31966
NEAALife SciencesM7145
Transfection Medium/Opti-MEM eGFP Gibco51985
GeneCopoeiaLPP-EGFP-LV105Partículas virais prontas para uso
pLenti6/V5Dest6 vetor eGFPInvitrogenPN 35-1271dos autores
Mix de embalagem ViralpowerTM InvitrogenP/N 35-1275
Reagente de transfecção/ Lipofectamin 2000Invitrogen11668-027
BlasticidinaInvitrogenR210-01
NeomicinaBiochromA2912
Tipo de colágeno1  Cauda de ratoBD Biosciences354236
pó DMEMLife TechnologiesArt.Nr. 10338582
plitidepsinaPharmamar
bortezomibLKT Lab., Inc.B5871
SPF-ovos de galinha brancosCharles RiverFertilizados  ovos de galinha Leghorn  brancos
Barcos de pesagem de plásticoneoLabArt.Nr. 1-1125para cultura ex-ovo
Quadrado de Petridish (Tampas)SimportD210-16para cultura ex-ovo
Tampão RIPA (10x)Sinalização Celular#9806
Protease Comprimidos InibidoresRoche11 836 170 001
Mini GFP ELISA
Cell Biolabs, Inc.AKR-121
Histocette IISimportM493-6
PFA  37%Roth7398.1
DPBSLonzaBE17-512F
Etanol AbsolutoNormapur20,821,321
Roti-HistolRothArt.Nr.6640.4
ParaplastSigmaA6330
Lâminas de Microscópio SuperFrostR. Langenbrinck Art.-Nr.
Trabalho- u. Medizintechnik03-0060
DakoCytomation Tampão de Lavagem 10xDakoCytomationCódigo-Nr.
S 3006
Solução de Recuperação de Alvo (10x)  pH 6,1Código DAKO-Nr.
S 1699
H2O2Merck
m-a-hu ASMA clone 1A4DAKOM0851
m-a-hu CD138 clone MI15DAKOM7228
m-a-hu Vimentin clone V9DAKOM0725
m-a-hu Desmin clone D33DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  clone MIB-1   DAKO  M7240
cabra biotinilada - anti-rato IgGVector Laboratories Inc.BA-9200
Vectastain Elite ABC KitVector Laboratories Inc.# PK-6100
Conjunto de Tablet FAST DAB.Sigma Biochemicals# D4293
Mayer' s solução de haemalaunMerck1,092,490,500
Roti HistokittRothArt.Nr.6638.2
Micrótomo rotativo de bancadaThermo Electron, Shandon Finesse ME+
Estação de incorporação de tecidosLeica, TP1020
Incubadora de OvosGrumbach BSS160
Microscópio de fluorescência estéreo equipado com uma câmera digital conectada (Olympus E410) e luz fria flexível Olympus, SZX10
Ultra Turrax HomogeneizadorIKA T10
Partículas lentivirais

Referências

  1. Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
  2. Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
  3. Prideaux, S. M., Conwa....

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Modelo de Embri o de GalinhaAn lise do Crescimento TumoralMedi o da Express o de GFPEnxerto de Membrana CorioalantoideMicroscopia de Fluoresc ncia Estereosc picaColora o Imunohistoqu micaQuantifica o por GFP ELISAC lulas Mesenquimais HumanasMatriz de Col geno Tipo I