Artigo de método

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

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DOI:

10.3791/52675

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4 de maio de 2015

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1Department of Neurology and Neurotherapeutics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neurological Surgery, Washington University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o pré-condicionamento hipóxico repetitivo ou breves exposições à hipóxia sistêmica que reduzem os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica após oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Ele também detalha a quantificação dupla do volume do infarto e da ruptura da barreira hematoencefálica após o AVC para avaliar a eficácia da proteção neurovascular.

Resumo

Modelos animais experimentais de acidente vascular cerebral são ferramentas inestimáveis ​​para a compreensão do AVC e desenvolvendo estratégias de tratamento mais eficazes. Um protocolo de 2 semanas para o pré-condicionamento repetitivo hipóxica (RHP) induz a proteção a longo prazo contra a lesão do sistema nervoso central (SNC) em um rato modelo de acidente vascular cerebral isquêmico focal. RHP consiste em 9 exposições estocásticos a hipoxia, que variam em termos de duração (2 ou 4 h) e intensidade (8% e 11% de O 2). RHP reduz os volumes de enfarte, barreira sangue-cérebro (BBB) ​​uma ruptura, e a resposta inflamatória pós-derrame durante semanas após a última exposição a hipoxia, sugerindo uma indução de longo prazo de um fenótipo do SNC de protecção endógena. A metodologia para a quantificação dual de volume do enfarte e a certificação perturbação é eficaz na avaliação da protecção neurovascular em ratinhos com RHP ou outros neuroprotectores putativos. Camundongos adultos machos Swiss Webster foram pré-condicionados por RHP ou exposições de duração equivalente a 21% de O (ou seja, sala de ar). A oclusão da artéria 60 min transitória cerebral média (tMCAO) foi induzida duas semanas após a última exposição hipóxica. Tanto a oclusão e reperfusão foram confirmados por transcraniana dopplerfluxometria a laser. Vinte e duas horas após a reperfusão, Azul de Evans (EB) foi administrado por via intravenosa através de uma injecção na veia da cauda. 2 horas mais tarde, os animais foram sacrificados por overdose e secções do cérebro foram corados com isoflurano 2,3,5- cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). Os volumes de enfarte foram então quantificadas. Em seguida, EB foi extraído do tecido ao longo de 48 horas para determinar BBB interrupção após tMCAO. Em resumo, RHP é um protocolo simples, que pode ser replicado, com um custo mínimo, para induzir protecção endógena neurovascular a longo prazo de uma lesão acidente vascular cerebral em ratos, com o potencial de translação para outros estados de doença pró-inflamatórias baseados em CNS e sistémicas.

Introdução

Como a principal causa de incapacidade em adultos e a quarta principal causa de morte, acidente vascular cerebral é um dos estados patológicos mais debilitantes que afectam a população adulta dos Estados Unidos. 1 Os modelos animais de acidente vascular cerebral permitir a investigação experimental de novos métodos de reduzir a lesão isquémica e melhorar a recuperação pós-acidente vascular cerebral. Uma nova avenida para tal investigação translacional é pré-condicionamento. Pré-condicionamento é o uso intencional de um estímulo não prejudicial para reduzir a lesão a partir de uma subsequente e mais grave, ferimento. 2 o pré-condicionamento hipóxica foi mostrado para produzir alterações pleiotrópicos no cérebro que fornecem protecção contra derrame em tanto in vivo e in vitro . 3 No entanto, uma única exposição à hipóxia só oferece neuroproteção de curto prazo, induzindo menos de 72 horas de tolerância contra a isquemia em ratos adultos. 4 Mesmo depois de quatro semanas de 14 horas exposição diária à hipóxia hipobárica, Lin et al. found neuroproteção que só foi sustentado por uma semana. 5 hipóxico pré-condicionamento repetitivo (RHP) é caracterizada por variações estocásticos em frequência, duração e intensidade da exposição hipóxia. Em contraste com um desafio único de pré-condicionamento, RHP induz um fenótipo cerebroprotective que dura até oito semanas em ratinhos. 6 RHP redução dos volumes de enfarte, barreira sangue-cérebro (BBB) ​​uma ruptura, inflamação vascular, e a diapedese de leucócitos para semanas após a última exposição hipóxica . RHP especificamente redução da inflamação no cérebro isquémico por redução de células T, monócitos, e populações de macrófagos, mantendo ao mesmo tempo as populações de células B no hemisfério isquémico. 7 Na verdade, RHP induziu um fenótipo imunossupressora em ratos antes de qualquer lesão do SNC, incluindo acidente vascular cerebral. As células B tratadas com RHP isolados a partir de ratos saudáveis ​​tratados com RHP exibiram um fenótipo anti-inflamatório único, com uma regulação negativa tanto de apresentação de antigénio e produção de anticorpos. Oredução global nos mecanismos imunes adaptativas pró-inflamatórios faz RHP uma excelente metodologia para induzir imunossupressão endógena para não só as doenças inflamatórias do SNC-específicos, mas também lesões ou doenças sistémicas modelos que incluem uma patologia pró-inflamatória.

RHP reduz tanto o volume de enfarte e certificação interrupção na sequência de uma oclusão transiente da artéria cerebral média (tMCAO). Os modelos animais de acidente vascular cerebral, tais como a tMCAO comumente usados, melhorar dramaticamente a compreensão da patofisiologia de acidente vascular cerebral, bem como a concepção de Neurotherapeutics mais eficazes. Primeiro desenvolvido por Koizumi et al., Em 1986, o procedimento tMCAO 8 é um método amplamente utilizado de induzir acidente vascular cerebral em roedores e um dos métodos preferidos para a investigação de inflamação após a reperfusão. Como os métodos para tMCAO evoluir, o uso mais recente de filamentos revestidos com silicone reduzir ainda mais o risco de hemorragia subaracnóide em comparação com outros modelos 9,10 </ Sup> e melhorar a confiabilidade, embora, infelizmente tMCAO muitas vezes produz uma grande variação de volumes de infarto. 11-13 A maioria desses estudos delinear regiões infarto em seções cerebrais coronais por coloração com cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC), considerado um padrão-ouro para infarto quantificação, pois é uma maneira simples e barata de produzir resultados reproduzíveis vivas. TTC serve como um substrato de desidrogenases presentes na mitocôndria. Quando fatias de cérebro são expostos à solução de TTC, TTC é tomado selectivamente em células vivas, onde o seu produto de redução não-solúvel, formazano, precipita-se para uma cor vermelho escuro em mitocôndrias viáveis. Por causa da disfunção mitocondrial no tecido isquémico, este tecido permanece branco, permitindo a diferenciação do tecido danificado e saudável. 14

RHP também reduz a certificação perturbação no hemisfério isquêmico. 6 Portanto, a dupla quantificação da integridade BBB dentro da mesma bchuvas como o volume de enfarte baseada em TTC 15 determinações iria fornecer informações úteis sobre a eficácia plena da protecção endógena, e as relações causais entre potenciais BBB perturbações e infarto em animais tratados e não tratados. O afluxo de sangue periférico através de uma certificação interrompido, secundária a acidente vascular cerebral, aumenta populações de leucócitos, citocinas pró-inflamatórias, estresse oxidativo, edema vasogênico e transformação hemorrágica no hemisfério isquêmico, finalmente, aumentar as taxas de infecção e mortalidade em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico 16,17. Um método comum de medir a certificação ruptura em modelos animais é através de quantificação de azul de Evans (EB) vazamento de corante no cérebro. 15,18-21 EB liga-se selectivamente a albumina do soro, uma proteína globular (PM = 65 kDa) que não atravessa a certificação em animais não lesionados. 22 Seguindo acidente vascular cerebral isquémico, EB se infiltra no cérebro, e fluoresce a 620 nm, permitindo a medição da densidade óptica within o parênquima ferido perfundidos. 22 A densidade óptica é directamente proporcional à permeabilidade da BHE quando EB foi lavada para fora da vasculatura cortical post mortem por perfusão transcardíaca. Com o processamento imediato dos cérebros TTC-corada em animais com a administração EB, tanto o volume do enfarte e a certificação perturbação pode ser quantificada de forma eficaz. Deve notar-se, no entanto, que a lesão neuronal e a certificação perturbação não são processos concomitantes no cérebro pós-AVC, 23,24 de modo que a selecção de tempo de sacrifício é uma consideração importante.

O protocolo que se segue detalha a RHP método, o método tMCAO para induzir uma oclusão arterial temporária que modela oclusões da artéria cerebral média em pacientes humanos, os métodos histológicos e para a determinação dupla neuronais e vasculares terminais lesão do derrame. TTC mede a morte celular e danos nos tecidos cumulativo, o que permite a quantificação de um enfarte vol globalume, enquanto EB prevê a quantificação dos danos hemisférica BBB.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da UT Southwestern Medical Center, que age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde política (NIH) para uso animal experimental.

1. Pré-condicionamento repetitivo Hypoxic

  1. Projete quatro medidores de vazão em reguladores de gás e anexar a câmaras de indução 15 L padrão com tubos de PVC para permitir que o gás comprimido a partir do oxigênio (O 2) tanques a fluir para as câmaras através de uma porta de entrada. Veja Equipamentos e Materiais para mais detalhes sobre o design personalizado.
  2. Divida ratos em dois grupos: Pré-condicionamento repetitivo Hypoxic (RHP) do Grupo, que recebem exposições a 8% e 11% O 2, eo grupo controle, que recebem exposições de O 2 (ar ambiente) 21% simultaneamente. Ver Tabela 1 para as variações de frequência, intensidade (8 e 11% de O2 ou 21% de O2) e duração (2 ou 4 horas) exposições de RHP.
  3. Remova a tampa do filtro de topo de cada gaiola e colocar a gaiola, com comida e água garrafas intactas, nas câmaras ligadas às suas respectivas Ó 2 tanques. Feche e prenda a tampa da câmara.
    1. Abrir a válvula de gás principal para os tanques e definir o fluxo inicial para cada câmara de indução de 2 L por min (LPM) para os primeiros 5 minutos de exposição. Reduzir a taxa de fluxo a 1 LPM para o restante da exposição.
    2. No final da exposição, para reduzir o fluxo para 0 LPM e fechar a válvula de gás para os tanques.
    3. Abra as tampas de câmara e substituir o filtro de topo da tampa em cada gaiola. Coloque as gaiolas em habitação padrão até a próxima exposição hipóxica.
  4. Spray para baixo cada câmara de indução com NPD (Steris) ou um desinfectante / desinfetante equivalente após cada utilização.
  5. Expor ambos 21% e RHP ratinhos, ao mesmo tempo do dia ao longo de duas semanas, como descrito na Tabela 1.

2. TransientMédio oclusão da artéria cerebral (tMCAO)

  1. Veja a discussão para mais detalhes sobre o tempo de acidente vascular cerebral após a exposição RHP final.
  2. Prepare um local de trabalho cirurgia asséptica. Local de trabalho envolvente limpo com 70% de etanol ou um desinfetante equivalente e autoclave todas as ferramentas cirúrgicas.
    1. Configure o instrumento Laser Doppler Fluxometria (LDF) para medir mudanças relativas no fluxo sanguíneo cerebral (CBF). Ligue o bloco de aquecimento a 37 ° C. Ligue o incubador a 34 ° C.
  3. Anestesiar ratos com uma breve exposição a uma mistura de 4% de isoflurano / 70% de NO2 / 30% de O 2 em uma pequena câmara de indução. Confirme anestesia adequada levemente beliscar a pata. Se o rato retirar a sua pata, devolver o mouse para a câmara de indução e continuar exposição isoflurano.
  4. Retirar ratos da câmara indução da anestesia e inserir rapidamente o nariz do rato no cone do nariz. Abra o fluxo de gás para o cone de nariz, fechando o fluxo para os anestesia câmara de indução.
    1. Sem alterar o NÃO 70% 2/30% de O 2 da mistura de gases, corrigir isoflurano a 1,8% como a dose de manutenção durante o resto do procedimento. A respiração deve permanecer lento e regular durante todo o procedimento, mas se a respiração torna-se rápida e superficial, aumentar a dose isoflurano. A dose de manutenção pode variar entre equipamentos de fabrico e de animais utilizados na experiência.
  5. Usando um microshaver, raspar o cabelo na região temporal entre o canto do olho e a orelha, bem como na linha média ventral do pescoço. Remover o excesso de pele e aplicar lubrificante ocular com uma mecha de algodão estéril para manter as córneas de secar durante o processo. Limpe a área de incisão com compressas embebidas em álcool e cotonete providone-iodo com um cotonete estéril para manter condições assépticas.
  6. Administrar analgésicos de acordo com as orientações cirúrgicas de roedores.
  7. Realizar uma incisão através da pele temporal entre o olho e a orelha.Exponha o músculo temporal. Usando micro-tesouras cirúrgicas, corte o ligamento do músculo temporal no cume temporal, dentro da área de estrias músculo branco.
    1. Suavemente empurrar a massa muscular, lateralmente, com uma pinça para visualizar a artéria cerebral média (MCA) através do crânio. Após a incisão do músculo temporal, a área pode se encher de sangue. Gentilmente use um cotonete para estancar qualquer sangramento potencial.
    2. Alvo a ponta da sonda LDF para a área de MCA. Grave o navio escolhido como esta área varia entre os camundongos.
    3. Segure o LDF no lugar e nivelada com o crânio até que um fluxo de células vermelhas do sangue estável é ler e gravar esse valor como a CBF linha de base. FSC da linha de base ideal numa fluxometria por laser Doppler são> 600 de fluxo, mas isto pode variar com o fabricante. Se basal CBF é <400 do fluxo, o fluxo de gravação é mais provável de uma veia próxima, ou uma colocação incompleta da sonda ao longo do vaso-alvo.
  8. Depois de base CBF é estabelecida, repositino rato, de modo que o pescoço fique exposta. Apoiar a sua cabeça e manter o mouse sob anestesia constante do cone do nariz.
  9. Faça uma incisão na linha média ventral, logo abaixo da mandíbula até a clavícula.
    1. Utilizando uma pinça, sem corte dissecar tudo fáscia superficial para expor a artéria carótida comum esquerda (CCA). Separa-se a CCA de tecido conjuntivo e do nervo vago.
    2. Permanentemente ligar o CCA com uma sutura de seda 6.0. Coloque a sutura ligadura como proximal quanto possível para permitir espaço suficiente para ocluir colocação filamento.
    3. Loop e vagamente amarrar um segundo fio de seda 6,0 em torno do CCA distal à sutura oclusão. Ter cuidado para não obstruir a artéria como o filamento de oclus vai subsequentemente ser enfiada através da carótida.
    4. Use um 8 x 2 milímetros luz micro serrafine braçadeira areterial para prender o CCA distal à sutura de seda vagamente amarrado. Levante cuidadosamente a CCA com uma pinça e fazer uma pequena incisão longitudinal, como proximal à sutura liga�o da comopossível com 3 milímetros Vannas.
    5. Um fio de 12 milímetros de silício revestido de nylon de calibre 6.0 oclus filamento através da incisão de introduzir o lúmen da artéria, e depois fazê-la avançar alguns mm. Genericamente apertar o segundo fio de seda em torno da ponta solta do filamento de oclus para garantir o fluxo de sangue não empurrar o filamento fora do CCA e remover o grampo arterial.
    6. Na primeira bifurcação da CCA na artéria carótida interna (ACI) e na artéria carótida externa (ACE), passe o filamento de oclusão no braço direito do primeiro bifurcação para entrar no ICA.Advance o filamento oclusão 9-10,5 mm depois a segunda sutura de seda na artéria carótida interna esquerda (ICA).
    7. Pouco depois de entrar no ICA, avançar o filamento de oclusão para o ramo esquerdo na segunda bifurcação entre o ICA ea artéria pterogopalantine (PPA). Visualização do PPA é improvável assim proceder até sentir uma leve resistência com colocação integral do filamento oclusão.O levantamento do ICA com uma pinça pode ajudar o filamento para enfiar mais facilmente no ramo esquerdo da segunda birfurcation. Aperte o segundo fio de seda.
    8. Vire o mouse de modo a incisão através da MCA é visível. Com o equipamento LDF, confirmar que a CBF é bloqueado através de leituras do FDL. A oclusão de sucesso é uma redução> 80% da linha de base a partir de CBF.
    9. Aperte completamente e dê um duplo nó do segundo fio de seda em torno do filamento oclusão quando a posição correta é alcançada. Se necessário, empurre ligeiramente em ou puxe o filamento de oclusão para alcançar critérios CBF para uma oclusão bem sucedida (por exemplo, redução> 80% da linha de base CBF).
    10. Feche a abertura do pescoço e da cabeça com suturas de nylon 6.0.
  10. Colocar em ratos a 34 ° C incubadora para a duração da oclusão. Comprimento recomendado de oclusão é de 60 min, mas isso varia por idade, diferenças dependentes da estirpe de anatomia vascular cerebral, 25 e a extensão da injury desejado (leve, moderada, grave). Certifique-se de que os animais recuperar a consciência dentro de minutos saindo de anestesia.
  11. Re-anestesiar os animais com isoflurano, conforme descrito no passo 2.3, 5 minutos antes do final do período de oclusão pré-definido, a incisão no couro cabeludo e confirmar que a perfusão MCA é ainda reduzido utilizando leituras transcranianas LDF. Se o FSC não é suficientemente reduzida (por exemplo, <20% da linha de base CBF), a MCA reperfundido em algum momento durante a oclusão e o rato deve ser impedida de continuar a experimentação.
  12. Abra a incisão na linha média do pescoço e vagamente amarrar um terceiro fio de seda em torno do CCA, distai em relação à segunda sutura de seda mas proximal à bifurcação CCA para assegurar que a artéria carótida externa (ECA) vai permanecer viável após o filamento é removido.
    1. Cortar ou desatar o nó que prende o filamento de oclusão (ie, segundo fio de seda) e retirar o filamento oclusão lentamente. Uma vez removido, a fechar rapidamenteterceiro fio de seda ao redor do CCA para minimizar o refluxo de sangue do ICA. Dê um duplo nó desta sutura e fechar a incisão com suturas de nylon 6.0.
    2. Reposicionar o mouse para quantificar o nível de CBF após 5 min de reperfusão. Reperfusão bem sucedida é geralmente definido como um CBF de> 50% da linha de base CBF, mas, como acontece com o fluxo de oclusão, os investigadores podem estabelecer o seu próprio critério. Se os animais exibem um CBF abaixo de 50% da sua linha de base, é provável que o MCA é 'permanentemente' ocluído, e representa, portanto, um outro critério de exclusão do estudo.
    3. Feche as duas incisões com suturas de nylon 6.0. Fornecer solução salina, anestésico (lidocaína), antibióticos e de acordo com as diretrizes de roedores. No entanto algumas pequenas doses de antibióticos (3 mg / kg de minociclina) foram encontrados para ser neuroprotector percurso de seguimento 26.
  13. Depois de recobrar a consciência na incubadora aquecida após a cirurgia, lugar camundongos em uma gaiola limpa, estéril. Fornecer foo umedecidod ou suplementos nutricionais hidratação gel alimentares e uma placa de Petri de água como os animais têm uma mobilidade restrita após acidente vascular cerebral. Monitorar os animais de perto durante a recuperação para a dor pós-operatória excessiva e morte.

3. Evans Blue (EB) Injecção

  1. Injectar EB 22 horas após a reperfusão e deve circular na corrente sanguínea, durante 2 horas antes do sacrifício e coloração TTC.
  2. Adicione uma solução injectável EB (EB 2% em solução salina) e misturar suavemente à temperatura ambiente. Filtrar a solução através de papel de filtro ou empurrar através de um filtro de 0,2 um ligado a uma pequena seringa para remover não dissolvido EB e armazenar à temperatura ambiente.
  3. Prepara-se o valor de EB necessário para a injecção (4 ml / kg de peso corporal) Desenhar a quantidade desejada de corante para uma seringa de insulina de 0,3 cc com uma agulha de calibre 29 e assegurar que a solução é à temperatura ambiente
    1. Contenha mouse usando restrainer fundo plano. Segurar a cauda de modo que a veia lateral é uppmais exterior. Veias laterais estão localizados em cada lado da linha central da cauda. Manter a ponta da cauda para manter constante o rato para injecção.
    2. Insira a agulha na veia, aproximadamente, 3,5 mm, tomando cuidado para não perfurar a veia. Confirmar que a agulha está na veia recuando na seringa e à procura de sinais de sangue.
    3. Injectar todo o corante ao longo de 1 min. Se a solução vai para dentro da veia deve haver resistência mínima como a pressão é aplicada à seringa. Confirme administração venosa sistêmica bem sucedida de EB por uma mudança de cor imediato na cauda, ​​membros e olhos do mouse.
    4. Retire a agulha da cauda e gentilmente aplicar pressão utilizando gaze limpa, a fim de parar o sangramento.
  4. Começar a cronometragem quando a pele do rato fica azul. Permitir que a EB para circular durante 2 horas para penetrar a BBB enfraquecida.

4. 2,3,5 Trifeniltetrazólio Chloride (TTC) Coloração

  1. Perfusão e coloração TTC deve ocorrer 24 horas após a reperfusão.
  2. Prepara-se uma solução de TTC a 2% antes do tempo de sacrifício designado. Adicionar 10 g de pó de TTC a 500 ml de 0,01 M de fosfato tamponado salino (PBS), pH 7,4. Aquece-se a solução a 37 ° C em banho de água para facilitar a solubilização da TTC. CUIDADO: Pó TTC e solução são uma pele, pulmão e irritante para os olhos. Use equipamento de proteção pessoal adequado durante o manuseio destes materiais.
    1. Uma vez que o pó se dissolva completamente, transferir imediatamente para uma garrafa, tampa em papel alumínio, e armazenar a 4 ° C. TTC e tecido manchado com TTC são sensíveis à luz.
  3. Em 24 horas após tMCAO e 2 horas após a administração EB, sacrificar o animal com uma dose excessiva de isoflurano em uma pequena câmara de indução. Perfusão deve começar imediatamente após sacricice a fim de minimizar autólise que começa na ausência de oxigênio após a morte.
  4. Garantir rapidamente o animalem uma plataforma de isopor com antebraços fixados pelas patas. Cortar uma incisão lateral através da parede abdominal de linha média, logo abaixo da caixa torácica. Cuidadosamente cortar através do diafragma para expor o coração.
    1. Iniciar a bomba de perfusão em 5 ml de caudal / min com uma seringa de 60 cc cheio com gelo frio PBS 0,01 M e ligado a um medidor de 27 infusão alado agulha. Colocar a ponta da agulha de cerca de 0,5 cm para o ventrículo esquerdo do coração e cortar o átrio direito. Progressivamente sangue venoso diluída deve fluir para fora do átrio durante a perfusão até que o sangue venoso parece incolor. Transcardialmente perfundir 30 ml de 0,01 M de solução salina tamponada de fosfato (PBS) através do coração.
  5. Adicionar 5 ml de solução de TTC em frascos de cintilação de 20 transparentes.
  6. Imediatamente após a perfusão, decapitar os animais e dissecar o cérebro usando uma tesoura pequena e uma espátula, se necessário. Examinar os cérebros para excluir os animais que sofreram hemorrha subaracnóidege no Círculo de Willis, secundária à colocação de sutura. Verifique se o hemisfério contralateral à MCA ocluído parece pálido, sem vazamento perceptível EB ou edema.
  7. Despeje PBS em uma matriz cérebro acrílico projetada para tornar 1,0 mm de espessura cortes coronais de um cérebro de camundongo. Coloque o cérebro, o lado dorsal para cima, na matriz e imediatamente despeje PBS sobre o cérebro. Mantenha o cérebro úmido.
    1. Remover os bulbos olfativos através da inserção de um aço inoxidável de 0,21 milímetros de espessura de lâmina para dentro do segundo compartimento do lado rostral da matriz.
    2. Remover o cerebelo através da inserção de uma lâmina na quarta ranhura do lado caudal da matriz.
    3. Inserir uma lâmina na ranhura meio das ranhuras restantes na matriz. Insira as lâminas restantes, de maneira uniforme que atravessa o tecido remanescente para garantir a distribuição mais uniforme de tecido durante o corte.
    4. Uma vez que todas as lâminas terem sido inseridos, é de 1 a 2 gotas de PBS para o cérebro para humedecer.
    5. Remover a lâminas um de cada vez a partir da matriz começando com a região rostral. Mantenha os primeiros sete fatias para análise TTC após tMCAO. Utilize uma pequena espátula para transferir cuidadosamente as fatias a partir da lâmina para o frasco TTC-cheia.
  8. Depois de todas as seções estão no frasco, a tampa e coloque em um banho de água morna até que as seções virar rosa. Rode cuidadosamente o frasco no banho, se necessário, para evitar a secção de sobreposição, o que poderia levar a coloração desigual. Em seguida, elimine o TTC e despeje a solução de paraformaldeído a 4% para o frasco para cobrir seções do cérebro para terminar a reacção química TTC.
  9. Providenciar imediatamente as seções sobre um limpo 1 "x 3" lâmina de vidro e orientar as seções de rostral para caudal.
    1. Quando as seções são organizadas no slide, digitalizar o slide usando um scanner padrão. Defina a resolução em um mínimo de 600 dpi para análise de imagem. Certifique-se de incluir o nome do animal e uma régua métrica na imagem digitalizada.
    2. Vire o slidee digitalizar o lado de trás para garantir que todos os dados são coletados.

5. Infarct Volume Quantificação

  1. Quantificar o volume de enfarte, usando um software de análise de imagem padrão (por exemplo, ImageJ).
  2. Digitalizar imagens com uma resolução elevada (por exemplo, 600 dpi), para análise adequada. Corte de imagens. Padronizar a escala para todas as imagens usando a régua métrica incluídos na imagem digitalizada.
  3. Calcular o volume total do hemisfério contralateral com a seguinte fórmula. Repetir esta fórmula para calcular o volume total do hemisfério ipsilateral.
    Soma de hemisfério contralateral total de cada fatia de espessura x fatia
  4. Calcular o volume de enfarte indirecta. . Controle de edema ipsilateral do traço, usando o saudável, hemisfério contralateral como controle 27 Use a seguinte fórmula para calcular o volume de enfarte indireta:
    O volume total de hemisfério contralateral -
    (Volum totale do hemisfério ipsilateral -média volume de 3 medições de infarto)

6. Barreira sangue-cérebro (BBB) ​​Integridade Quantificação

  1. Para se preparar para EB quantificação, primeiro pesar 2,5 polegadas pesar barcos. Grave o peso e rotular dois pesar barcos para cada animal: uma para o hemisfério ipsilateral e uma para o hemisfério contralateral.
  2. Depois de digitalizar as seções TTC-coradas, bissetriz cada seção com uma lâmina de barbear descartável em hemisférios ipsilateral e contralateral. Coloque os hemisférios ipsilateral de todas as sete seções em um barco pesar e registar a sua massa. Repita o procedimento para hemisfério contralateral.
  3. Transferir imediatamente os barcos de peso a um conjunto forno por 56 ° C durante 48 horas.
  4. Pesar as secções secas. Transferir ambos os hemisférios em separadas tubos de 1,5 ml de microcentrífuga.
    1. Calcular a quantidade de formamida necessária para cada hemisfério (8 ml / g de tecido seco), e adicionar ao respectivo microcentrifuge tubos. Formamida é sensível à luz e cobrir todas as amostras tratadas com formamida em folha a partir deste ponto em diante.
    2. Transferir os tubos de microcentrífuga para um incubadora ajustada a 56 ° C durante mais 48 h.
  5. Após o 48 horas, Pipeta fora o sobrenadante azul em um outro conjunto de tubos de microcentrífuga rotulado. Empurrar o tecido para o fundo do tubo para maximizar o volume de sobrenadante extraído. Mantenha os tubos de sobrenadante e dispor de todo o tecido.
  6. Preparar diluições em série de EB exponenciais em formamida para a curva padrão. Incluir um em branco (formamida apenas) e, em seguida, 10 soluções exponenciais de 0,125 ug / ml através de 64 ug / ml de EB em formamida.
    1. Pipetar 300 uL das diluições feitas para a curva padrão para uma placa de 96 poços. Pipetar 300 l do sobrenadante em cavidades correspondentes.
    2. Medir a absorvância num espectrofotómetro a 620 nm.
    3. Comparar a curva padrão das diluições EB com a absorvância of as amostras de sobrenadante. A densidade óptica é directamente proporcional à integridade da BBB.
    4. Assumir a densidade óptica do hemisfério contralateral como o fundo e usar a fórmula (ipsilateral contralateral-) / contralateral para determinar a mudança de dobragem. Para mais detalhes sobre a análise estatística ver Martin et al, 2010. 18.

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Resultados

Este estudo incluiu 25 ratinhos Swiss Webster machos que tinham 10 semanas de idade no início da randomização em RHP (n = 10) ou 21% de O 2 (n = 15) grupos. Duas semanas após a exposição final RHP, procedimentos cirúrgicos foram realizados, com grupos cegos e contrabalançadas entre os dias. Seguindo tMCAO, um rato morreu durante a recuperação pós-operatória e um rato foi excluído do estudo porque não cumpria o critério de reperfusão CBF. Ambos os ratos foram excluídos do grupo O 2 de 21%...

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Discussão

Uma única exposição à hipóxia sistêmica (ou seja, 2 horas de 11% O 2) em camundongos "transitoriamente" protege o cérebro de tMCAO, 29 ou seja, a resposta epigenética ao desafio hipóxico pré-condicionamento é de curta duração, eo fenótipo linha de base é restaurada dentro dias. Apresentações repetitiva do estímulo pré-condicionamento hipóxico alargar drasticamente a duração do fenótipo neuroprotector. 6 Muitos estudos têm demonstrado que a frequência, amplitude e duraç...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecimentos especiais ao laboratório Gidday por seu trabalho no desenvolvimento do protocolo RHP, bem como ao Neuro-Models Facility (UTSW) por sua assistência nas cirurgias tMCAo. Este trabalho foi apoiado por doações da American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS) e Fundação de Pesquisa de Paralisia Espástica do Distrito de Illinois-Eastern Iowa da Kiwanis International (JMG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Medidores de vazão, reguladoresVetEquip, IncPedido especialQuatro medidores de vazão são conectados a um tubo de PVC flexível de 6,0 mm que se conecta à porta de entrada em cada câmara de indução com um conector fêmea de plástico. Esses medidores de vazão são aparafusados a uma barra de metal de 6,5" x 1" x 1". Esta barra de metal é aparafusada a um manômetro MI-246-P com uma saída DISS. Este manômetro e equipamento medidor de vazão pode ser conectado a cada novo cilindro de gás com uma chave inglesa.
21% O2 tanqueAirGasOX USP200
11% O2 tanqueAirGasPedido
8% O2 tanque Pedidode AirGas
15 L câmaras de induçãoVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Moor Instruments sonda de 0,8 mm de diâmetro moorVMS-LDF1-HP 
Iluminador de Alta IntensidadeMicroscópio Estéreo Zoom NikonNI-150
 NIkonSMZ800Outros microscópios cirúrgicos podem ser usados. 
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationDescontinuadoA substituição recomendada é o PhysioSuite com Monitoramento de Temperatura RightTemp e Controle Homeotérmico (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator IncubatorStromberg's2362-ENosso modelo é o 2362N. 2362E é um modelo posterior e inclui um termostato eletrônico.
V010 Sistema de anestesiaVetEquip901807Inclui: mangueira de oxigênio de alta pressão de dez pés, estrutura, medidor de vazão, conjunto de descarga de oxigênio, vaporizador, circuito de respiração, câmara, narizes, tubulação de evacuação de gases residuais e dois filtros VapoGuard
250 ml de isoflurano Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Aparador Sem Fio Andis #23905Lâminas de substituição estão disponíveis na Andis (#23995)
Betadine Fisher Scientific19-898-867 
Q-tipsVários vendedores Número de catálogo não disponível 
Almofadas de GazeFisher Scientific67622
Campo cirúrgicoFisher ScientificGM300 
Suturas de Seda Look/Div Surgical SpecialtiesSP115
Suturas de NylonLook/Div Surgical SpecialtiesSP185
Durmont #5 fórceps (2) Ferramentas de Belas Ciências 11251-3545°
Tesoura CirúrgicaFerramentas de Ciência Fina14028-10
3 mm VannasKent Scientific CorporationINS600177Hartman
Hemostats Ferramentas Científicas Finas13002-10
Filamentos de Oclusão PedidoEspecialidadeda Universidade de WashingtonOs filamentos são revestidos com silicone na Universidade de Washington e fornecidos às instalações da UTSW por uma taxa.
Evans BlueSigma AldritchE2129-10G
 Sigma AldritchWHA1001150150 mm, círculos, Grau 1 
Barcos de PesagemFisher Scientific02-202-1012.5" de diâmetro
0.9% Injeção de Cloreto de Sódio USP Baxter Pharmaceutics 2B1321
Seringa de insulina de 0,3 cc com agulha de 29 gaugeBecton Dickinson Labware309301
Flat bottom restrain Braintree Scientific FB  M2.0" diâmetro
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7.4Fisher ScientificBP399-20
Banho-mariaVários vendedores Número de catálogo não disponível Os tubos de cintilação com TTC podem ser mantidos manualmente em água morna corrente como alternativa ao banho-maria.
Placa de isoporVários vendedores Número de catálogo não disponível 
Kit de Seringa GrandePumpSystems IncP-SYRKIT-LG
Bomba de PerfusãoPumpSystems IncNE-300 
Seringa de 60 ccFisher ScientificNC9203256
conjunto de infusão alada de calibre 27Kawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
frasco de cintilação de 20 mlFisher Scientific50-367-126
Espátula de aço inoxidávelFisher Scientific14-373-25A
Alto acrílico 1.0 mm cérebro de camundongo, coronalCellPoint Científico Número de catálogo não disponível 
Lâminas de aço inoxidável de 0,21 mm, 25 pkCellPoint Scientific Número de catálogo não disponível As lâminas de criostato reutilizáveis são uma alternativa barata.
4% de paraformaldeídoSanta Cruz BiotechnologySC-281692
Lâminas de microscópio Superfrost Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Vários vendedores Número de catálogo não disponível Outros scanners comerciais são adequados para esta etapa do protocolo.
ImagemJ National Institute of HealthNúmero do catálogo não disponível 
Balança AnalíticaMettler ToledoXSE 205U
Forno Compacto de Precisão   Thermo Scientific 
tubos de microcentrífuga de 1,7 ml (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
FormamidaFisher ScientificBP228-100
Placas de 96 poçosFisher Scientific07-200-9
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Número de catálogo não disponível 
especialespecial de Papel de Filtro PR305225M

Referências

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
  3. Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
  4. Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
  5. Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
  6. Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
  7. Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22(2014).
  8. Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  9. Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
  11. Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561(2013).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
  14. Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
  15. Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
  16. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
  17. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
  18. Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
  19. Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
  20. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
  21. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019(2012).
  22. Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
  23. Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
  24. Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
  25. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
  26. Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7(2004).
  27. Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
  28. Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517(2010).
  29. Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
  30. Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
  31. Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065(2013).
  32. Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
  33. Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
  34. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
  35. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  36. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  37. Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
  38. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  39. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  40. Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
  41. Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
  42. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  43. Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
  44. Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
  45. Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
  46. Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
  47. Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
  48. Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
  49. Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).

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