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Artigo de método

Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion

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DOI:

10.3791/52681

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9 de abril de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

Neste artigo

Resumo

C. elegans é um modelo útil para estudar os efeitos do etanol no comportamento. Apresentamos um ensaio comportamental que quantifica os efeitos do etanol na velocidade de locomoção de vermes rastejantes; tanto a sensibilidade inicial quanto o desenvolvimento de tolerância funcional aguda ao etanol podem ser medidos com este ensaio.

Resumo

Os transtornos por uso de álcool são uma preocupação significativa de saúde pública, para a qual existem poucas estratégias de tratamento eficazes. Uma dificuldade que atrasou o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes é a relativa falta de compreensão das bases moleculares dos efeitos do etanol no comportamento. O nematoda, Caenorhabditis elegans (C. elegans), fornece um modelo útil para gerar e testar hipóteses sobre os efeitos moleculares do etanol. Aqui, descrevemos um ensaio que foi desenvolvido e usado para examinar os papéis de genes particulares e fatores ambientais nas respostas comportamentais ao etanol, nas quais a locomoção é a saída comportamental. O etanol causa uma depressão aguda da rastejamento em uma superfície de ágar de maneira dependente da dose. Os efeitos são dinâmicos; animais expostos a uma alta concentração demonstram uma forte depressão inicial do rastejamento, referida aqui como sensibilidade inicial, e então recuperam parcialmente a velocidade de locomoção apesar da presença contínua do medicamento. Esta plasticidade comportamental induzida pelo etanol é referida aqui como o desenvolvimento de tolerância funcional aguda. Este ensaio tem sido usado para demonstrar que esses dois fenótipos são distintos e geneticamente separáveis. O ensaio de locomoção simples descrito aqui é adequado para examinar os efeitos de manipulações genéticas e ambientais nessas respostas comportamentais agudas ao etanol em C. elegans.

Introdução

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Os transtornos por uso de álcool (AUD) são generalizados e produzem sérios problemas de saúde, sociais e econômicos. Nos humanos, a suscetibilidade a desenvolver um AUD é fortemente influenciada tanto pela genética quanto pelo ambiente1,2. Um forte preditor fisiológico de potencial de abuso é o nível inicial de resposta (LR) ao álcool (etanol) que é exibido por bebedores inexperientes3-5. Este fenótipo LR é influenciado por componentes genéticos e não genéticos6. Determinar os mecanismos moleculares que influenciam a LR ao etanol é um objetivo importante do estudo dos comportamentos de resposta ao etanol.

O nematódeo, Caenorhabditis elegans, tem sido cada vez mais utilizado como um modelo para estudar os efeitos do etanol no comportamento7-9. Há forte conservação molecular na maquinaria da função do sistema nervoso entre vermes e mamíferos, e vários genes que demonstraram influenciar a LR ao etanol em vermes também demonstraram influenciar a LR ao etanol em mamíferos10-16, e foram implicados na suscetibilidade ao abuso em humanos17-19.

O etanol intoxica os vermes, o que se reflete em uma diminuição da velocidade de locomoção. Vários laboratórios diferentes desenvolveram ensaios comportamentais que diferem de várias maneiras, por exemplo, o comportamento de locomoção que eles estudam (rastejamento versus natação11,12,14,20,21) ou na composição das soluções nas quais os ensaios são realizados (meio de crescimento de nematódeos versus solução salina de Dent20,22). Curiosamente, esses ensaios diversos produziram perfis de dose-resposta um pouco diferentes para os efeitos do etanol. Esses resultados apontaram para diferenças importantes nos comportamentos subjacentes de rastejamento e natação9,23, bem como para um papel da variável ambiental osmolaridade nas respostas ao etanol20, e destacaram a importância de descrever os detalhes experimentais dos vários ensaios.

Um ensaio para medir os efeitos agudos do etanol no comportamento de rastejamento é apresentado aqui. Este ensaio tem sido amplamente utilizado para estudar as influências genéticas e ambientais na LR ao etanol8,10,20,24,25. O fenótipo LR em mamíferos é um composto de pelo menos dois componentes, sensibilidade inicial ao etanol e tolerância funcional aguda ao etanol26,27. Nos vermes, o fenótipo LR tem sido demonstrado ser separável em esses dois componentes através do uso deste ensaio comportamental. As influências de manipulações genéticas e ambientais em ambos os fenótipos podem ser examinadas usando este único ensaio. Importantemente, esses dois fenótipos são geneticamente separáveis.

```

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Protocolo

1. Passos para executar no dia anterior ao ensaio

  1. Escolha L4 vermes palco para meio de crescimento nematóide fresco (NGM) placas semeadas com um gramado de OP50 E. coli e cultura-los em 20 CO / N. Cada condição de ensaio requer 10 vermes; escolher um excesso de vermes para permitir O perda de vermes / N.
    1. Apenas animais de ensaio que são adultos do primeiro dia; muitos mutantes crescer a uma velocidade mais lenta do que o tipo selvagem. Ajuste o tempo de colheita para as estirpes que têm atrasos de desenvolvimento, de modo que todos os animais testados são adultos do primeiro dia.

2. Passos a executar no dia do ensaio

  1. Preparação para o ensaio:
    1. Realizar ensaios em unseeded 60 x 15 milímetros placas NGM padrão. Seque todas as placas para ser usado em 37 ° C durante 2 horas, com tampas de folga. Para cada ensaio experimental, use quatro placas NGM secas; estes serão a 0 mm e 400 mm placas de ensaio etanol e suas placas de aclimatação de acompanhamento.
      NOTA:A utilização de placas NGM é importante aqui; diferenças na composição dos blocos, em particular, a sua osmolaridade, pode afectar fortemente a resposta à dose de etanol no comportamento, isto é devido, pelo menos em parte, a alterações na quantidade de etanol acumulada pelos animais 20. Agar NGM é de 160 mOsm.
    2. Após a secagem, pesar cada uma das placas NGM unseeded para ser utilizado no ensaio e tomar nota do peso. Determinar o volume de meio em placas com base no peso de uma placa vazia. Para aproximar a conversão do peso do agar, para o volume, assumir que os meios de comunicação pesa o mesmo que um volume igual de água.
      NOTA: Os resultados mais consistentes foram encontrados com media NGM que desidratadas suficientemente que um volume original de 10 ml tem um volume de pós-secagem entre 8,3-8,9 ml. Uma alternativa para o tempo de secagem é de 2 horas para secar até que as placas atingem esta gama de volume para explicar as diferenças em incubadoras.
    3. Derreta 4 anéis de cobre (diâmetro interno de 1.6 cm) para a superfície de cada uma das placas de agir como currais para os diferentes genótipos ou grupos de tratamento de worms.Grasp cada anel com uma pinça, e o calor de uma chama (em um forte chama de um queimador de Bunsen funciona bem) para cerca de 3 seg. Colocar imediatamente o anel em uma placa enquanto ainda mantém o anel com a pinça para impedi-lo de "salto".
      1. Certifique-se de que o anel assenta plana contra a superfície do agar, pressionando suavemente com a pinça em vários pontos no anel. Ao colocar o anel, ter o cuidado de deixar espaço para mais três anéis.
      2. Derreter os três anéis adicionais de cobre na superfície da placa, tendo o cuidado de colocá-los o mais próximo possível um do outro, de modo que todos os quatro estarão no campo de visão da câmara.
        NOTA: Fazendo uma boa vedação com o agar é essencial para manter os vermes nos anéis durante o ensaio. Anéis que pular na chapa não são susceptíveis de fazer a vedação correta com o agar epode scar o agar, que permite que os vermes de toca e interfere com a visualização dos vermes.
      3. Para cada placa de ensaio preparar uma placa de acompanhamento "aclimatação", que deve ser seco e não inoculada e não receberá qualquer etanol. Coloque quatro anéis de cobre sobre estas placas.
    4. Rotular o fundo das placas ao lado de cada anel com a estirpe sem-fim para ser usado no anel, tendo o cuidado para não escrever no campo de visão do próprio anel. Combinar as etiquetas na placa de ensaio com a sua placa de aclimatação que o acompanha.
    5. Calcula-se a quantidade de etanol a 100% para adicionar a cada placa de ensaio de modo a que a concentração final é de 0 mM ou 400 mM de etanol (em peso por volume). Para cada experiência (n = 1), haverá um 0 mM e 400 uma placa de etanol mM; placas de aclimatação não receber etanol. Adicionar o etanol, pipetando-o em torno da superfície da placa. Use filme de laboratório para selar a placa e permitir que se equilibre no cimo da bancada durante 2 horas.
    6. Quando tiver decorrido 1,5 horas, começa a etapa de aclimatação de ensaio, passo 2.2.
  2. Realizar ensaio locomoção: As placas de ensaio
    1. Transferir cuidadosamente 10 vermes de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre sobre a placa de aclimatação. Remova qualquer alimento que é visível no agar neste momento raspando suavemente com a pick worm. Variar a ordem em que os grupos experimentais são colocados sobre as placas através de ensaios experimentais de modo a que as mesmas estirpes não são colocados nas placas na mesma ordem em todos os ensaios.
      NOTA: O objectivo é o de transferir os animais para a placa com quantidades mínimas de alimentos, porque se o alimento sobre a placa de aclimatação é transferido para a placa de ensaio os vermes vai agregar em redor dos alimentos e o efeito da droga sobre a locomoção vai ser obscurecida.
    2. Tenha cuidado para não quebrar a superfície do agar com a escolha, pois isso permitirá que os vermes de toca e pode atrapalhar o ensaio. Incubar os vermes à TA durante 30 min.
    3. Certifique-se que há um intervalo adequado entre as iniciações de cada placa. Um experimentador experiente pode mover-se 40 animais, 10 / anel para 4 anéis em <1,5 min, mas qualquer intervalo de até 2 min é aceitável. O ensaio padrão tem gravar filmes em 10-12 min e 30-32 min de exposição tanto para 0 mM e 400 mM de etanol.
    4. Iniciado a placa de aclimatação para a exposição 0 mM e a placa de aclimatação para a exposição de 400 mM a cerca de 2 min e 30 seg para além de permitir a poupança do primeiro arquivo de filme antes do segundo filme deve começar.
    5. Após o período de aclimatação de 30 minutos, transferir os vermes das placas de aclimatação para as placas de ensaio. Transfira os vermes para as placas de ensaio (0 mm ou 400 mm) de etanol na mesma ordem em que foram adicionados à placa de aclimatação, mantendo o controle do tempo entre as conclusões de cada placa. Selar a placa com película de laboratório para minimizar a perda de etanol a vaporização.
    6. Usi, um movimento de escavar com uma picareta verme fina gumes achatada para coletar vermes em cima da pick achatada. Executar a transferência de vermes a partir da placa não inoculada aclimatação à placa de ensaio, sem a utilização de bactérias, o que é comumente utilizados na transferência de vermes, uma vez que ajuda a colar o sem-fim para a retirada.
      NOTA: A velocidade em que os animais são transferidos para esta etapa é muito importante, porque as primeiras vermes sobre a placa será exposta a etanol mais tempo do que os últimos vermes adicionados à placa, e pontos de tempo anteriores podem apresentar alguns efeitos dependentes do tempo. Esta é a principal razão para a rotação que as estirpes são colocados sobre uma primeira placa através de experiências em replicado.
  3. Execute Locomotion Ensaio: As filmagens
    1. Use uma combinação de microscópio / câmera que permite a gravação simultânea de todos os quatro anéis no campo de visão (aproximadamente 42x42 mm 2 quadrado), como um objetivo 0,5x microscópio, ampliação de 0,8x e uma câmera com um 2048x2048 7,481; m CCD pixel.
    2. Utilize uma iluminação uniforme em todo o campo de vista, que ajuda no reconhecimento de objecto no passo limiar de intensidade (ver abaixo). A "x3" backlight 3 funciona bem.
    3. Imagem os vermes em uma placa posicionada do lado media para cima (tampa para baixo), o que gera contraste que se perde quando se utiliza a luz de fundo em comparação com um microscópio tradicional transmitida fonte de luz.
    4. Prepare o software de análise de imagem para capturar filmes lapso de tempo dos vermes em movimento. Defina o software para capturar 12 bits imagens em escala de cinza a cada 1 s, como um filme de 2 min (120 frame). Para reduzir o tamanho do ficheiro de saída, mantendo a resolução de imagem suficiente, utilizar um modo de bins de 2x2 para capturar imagens 1024x1024 pixels.
    5. Grave filmes. Começar a gravar um filme 120-frame da primeira placa (0 mM etanol) 10 min após o último vermes foram colocados nessa placa. Salve o arquivo de filme.
    6. Grave a segunda placa (400 mM de etanol). Repita esse processo paraambas as placas com início 30 minutos após a última vermes foram colocados sobre a primeira placa (0 mM de etanol) para capturar os pontos 30-32 min de tempo para cada exposição.
      NOTA: Aguarde o tempo suficiente para salvar os arquivos de imagem depois de cada sessão de captura antes de começar a gravação do próximo prato a ser analisado.
    7. Para futuro à prova de filmes arquivados e permitir que esses filmes sejam abertas e analisadas por outros programas de software de imagem de código aberto de domínio público, como ImageJ 28, converter uma cópia de cada filme para 8-bit 256 arquivos TIFF em escala de cinzento.
      NOTA: O software de análise de imagem descrito aqui usa um formato de arquivo proprietário.
  4. Análise de filmes usando software ImagePro.
    1. Uma vez capturado, analisar os filmes usando Imagem-Pro Plus software ou seu equivalente.
      NOTA: Uma variedade de outros softwares de seguimento de objectos está disponível que foi usado com sucesso para controlar múltiplos C. elegans de uma só vez 29 e talsoftware poderia razoavelmente substituir o descrito aqui como as etapas de identificação objeto são baseadas em princípios semelhantes. O método descrito refere-se a versões com software Image Pro Plus 6,0-6,3 e 7.0, as versões mais recentes de Imagem-Pro Plus software podem ter pequenas diferenças.
    2. Analisar filmes nos segmentos 2-min (120 frame). Em primeiro lugar, aplica um filtro para as imagens para achatar o fundo e aumentar o contraste dos objectos de vermes. Selecione o filtro da seguinte forma: Menu> Processos> Filtros> Acessórios> Nivelar: Parâmetros: Fundo = escuro; Recurso Largura = 20 Pix.
    3. Re-salvar os filmes após a etapa de filtragem, mas sempre manter o filme original em sua forma não filtrada.
      1. Analisar a locomoção dos animais em cada anel separadamente com uma região circular de interesse (ROI) que está colocado e dimensionado para se sobrepor com o anel de cobre. Identificar e acompanhar os vermes com o Menu> Medida> Track Objetos ... comando; Isso traz a Rastreamento Djanela Tabela ata. O botão Opções de controle permite faixas específicas a serem excluídos e limitar quaisquer artefatos experimentais.
    4. Sob a guia Auto Tracking, use os seguintes parâmetros: Pista Parâmetros: limite de velocidade (raio de busca) = 400 mm / frame, limite de Aceleração = Auto, comprimento total mínimo pista = 400 mm, tipo de movimento predominante = caótico; Objetos em parâmetros faixas: Permitir faixas parciais = yes, Min comprimento = 21 frames, Acompanhando profundidade previsão = 1 quadro.
    5. Para iniciar o processo de rastreamento, clique no Encontrar Todos os rastreia automaticamente o botão de função para abrir a caixa de diálogo de Contagem / opções de tamanho e a caixa de diálogo Rastreamento. Selecione a opção Manual para a Seleção faixa de intensidade na caixa de diálogo Contagem / Size, que fornece o passo importante limiar que usa a intensidade da escala de cinzentos do worm pixels para destacar um objeto verme para análise e ignorar os mais leves de fundo pixels.
      1. Ajuste o sli limiar de intensidadeders (um para definir o limite superior, um para definir o limite inferior) para criar um intervalo inclusivo que destaca todos os objetos escuros. A gama de 0-1,500 em uma escala de 0-4,095 é um bom ponto de partida para a sintonia fina.
      2. Aplicar um filtro de tamanho de excluir objectos que são maiores e menores do que um único objecto sem-fim, tal como o anel de cobre e quaisquer detritos nas placas. Definir dois parâmetros de tamanho para fazer isso que cobrir tamanhos para vermes individuais em uma variedade de posturas com a medida> Selecionar Medidas item de menu na caixa de diálogo Opções de Contagem / Tamanho. (Intervalo Área: 28,000-120,000 mm 2 e gama Perimeter: 600-2,500 mm).
      3. Se uma estirpe mutante é significativamente menor ou maior do que outros animais na chapa a ser analisado, ampliar a gama de configurações de filtro para reconhecimento de objetos para acomodar os diferentes tamanhos das cepas primeiro antes de rastreamento de animais, para que as configurações não precisam ser alteradas meados de análise.
    6. Concluir o processo de rastreamento clicando em Continuar na caixa de diálogo Rastreamento. Visualmente comparar as faixas de saída com o progresso de cada verme no filme para garantir que cada verme é representada a menos que haja uma razão válida para excluí-lo com base nas definições de filtros automáticos. Exclua manualmente faixas que foram produzidos pela presença de objetos não-worm confirmaram que atenderam aos critérios de filtro de tamanho.
    7. Use o software para calcular a velocidade de cada verme entre cada quadro (distância percorrida para o baricentro de um objeto por 1 segundo entre os quadros) e exibir a velocidade média para cada faixa e da velocidade média de todas as faixas para a população de vermes na anel de cobre. Considere esta média final para ser n = 1 em termos de ensaios experimentais. Exportar os dados para um programa de planilha para análises estatísticas e arquivamento de dados.
    8. Uma vez que os dados foram registrados para o primeiro toque na placa, mova o ROI para o próximo anel erepita o processo de rastreamento, sem alterar qualquer um dos parâmetros.
    9. Calcular a velocidade relativa de locomoção por meio de:
    10. Velocidade relativa (%) = tratada (400 mm) Velocidade / não tratada (0 mm) Velocidade x 100.
      NOTA: Diferentes manipulações genéticas, muitas vezes altera a taxa de locomoção basal dos animais. A fim de determinar o efeito do etanol sobre a velocidade de locomoção dos animais e para ser capaz de comparar estes efeitos em diferentes genótipos ou condições, calcular uma velocidade relativa.

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Resultados

Os dados representativos (Figura 1) de vários genótipos diferentes e seus controles pareados são apresentados 8,24; dados foram escolhidos especificamente que as diferenças de destaque nos animais testados. O grau de efeito de 10 min de exposição é considerada a sensibilidade inicial de uma estirpe, que é mostrada nos eixos esquerda na Figura 1B-G. Estirpes mutantes com uma maior velocidade relativa do que o controlo em 10 minutos são considerados como sendo resistentes etano...

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Discussão

A neurobiologia simples e ferramentas genéticas disponíveis em C. elegans fazer o sem-fim um excelente modelo para estudar as bases moleculares dos efeitos do etanol sobre o comportamento. Aqui, nós descrevemos um ensaio que foi utilizado para identificar vários mediadores moleculares e ambientais da resposta comportamental aguda para ethanol 8,10,20,24,25. Este método permite a diferenciação e análise simultânea de dois fenótipos diferentes comportamento de resposta etanol, sensibilidade inicial e o...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Estes estudos foram apoiados por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alcoolismo e Abuso de Álcool: R01AA016837 (JCB) e P20AA017828 (AGD e JCB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
C. elegans strainsCaenorhabditis Genetics Center
Placas de Petri de 60 x 15 mm, com três ventilaçõesGreiner Bio-One628161Outras marcas de placas servirão.
Ágar NGMVáriosNaCl (3 g/L), ágar (17 g/L), peptona (2,5 g/L), 1 ml de colesterol (5 mg/ml em etanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
FórcepsVáriospor exemplo, Fisher Scientific #10300
Incubadora a 37 °CVáriosPara secar o ágar
Balança digitalVáriosPara determinar pesos de placas e volume de ágar
Anéis de cobrePlumbmasterSTK#35583 (48 rosca de tampa vedante)Anéis de cobre com 1,6 cm de diâmetro interno e 1,8 cm de diâmetro externo
Etanol 100%Vários
Parafilm MBemisPM996
Câmera CCDQImagingRET-4000R-F-M-12Esta câmera tem um grande campo de visão.
Estereomicroscópio com montagem C e objetivo 0,5XLeicaMZ6Modelo descontinuado, M60 é o equivalente atual.
Fonte de luzSchottA08923Iluminação de fundo de 7,6 x 7,6 cm para iluminação uniforme em todo o campo de visão
Software de imagem e rastreamentoMedia CyberneticsImagePro-Plus v6.0-6.3Versões mais recentes do software têm funções de rastreamento.

Referências

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