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Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

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DOI:

10.3791/52685

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17 de abril de 2015

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve uma abordagem automatizada de seleção de tamanho de gel para purificar fragmentos de DNA para sequenciamento de próxima geração. A tecnologia Ranger fornece automação completa de todo o processo de carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados, permitindo bibliotecas de sequenciamento de última geração de alto rendimento e alta qualidade.

Resumo

O sequenciamento de próxima geração de amostras ambientais pode ser desafiador devido à quantidade e qualidade variáveis de DNA nessas amostras. Bibliotecas de DNA de alta qualidade são necessárias para obter os melhores resultados do sequenciamento de próxima geração. Amostras ambientais, como água, podem ter baixa qualidade e quantidades de DNA, bem como contaminantes que co-precipitam com o DNA. Os processos mecânicos e enzimáticos envolvidos na extração e preparação da biblioteca podem danificar ainda mais o DNA. A seleção do tamanho do gel permite a purificação e recuperação de fragmentos de DNA de um tamanho definido para aplicações de sequenciamento. No entanto, essa tarefa é uma das etapas mais demoradas no fluxo de trabalho de preparação da biblioteca de DNA. O protocolo descrito aqui permite a automação completa do carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados.

Neste estudo, descrevemos uma abordagem de alto rendimento para preparar bibliotecas de DNA de alta qualidade a partir de amostras de água doce que podem ser aplicadas também a outras amostras ambientais. Usamos uma abordagem indireta para concentrar células bacterianas de amostras ambientais de água doce; O DNA foi extraído usando um kit de extração de DNA disponível comercialmente, e as bibliotecas de DNA foram preparadas usando um protocolo comercial baseado em transposon. Fragmentos de DNA de 500 a 800 pb foram selecionados em tamanho de gel usando a Ranger Technology, uma estação de trabalho de eletroforese automatizada. O sequenciamento das bibliotecas de DNA selecionadas por tamanho demonstrou melhorias significativas no comprimento da leitura e na qualidade das leituras de sequenciamento.

Introdução

Metagenômica envolve o sequenciamento de todo o material genético em uma amostra para caracterizar as comunidades microbianas presentes. É um processo complexo e caro que envolve a conversão de ácidos nucléicos extraídos em bibliotecas de DNA, seguida de sequenciamento de última geração. Bibliotecas de alta qualidade são essenciais para a saída máxima de dados e análises metagenômicas precisas. Amostras ambientais, como amostras de água, muitas vezes representam desafios significativos para a geração de bibliotecas de alta qualidade, devido às baixas quantidades de DNA que também podem ser degradadas1-3 e à presença de inibidores da PCR4-6.

Bibliotecas de alta qualidade consistem idealmente em segmentos mais longos de DNA dentro de uma faixa estreita de comprimentos. Para maximizar a quantidade de dados úteis gerados por execução de sequenciamento, o comprimento do DNA na biblioteca deve ser pelo menos tão longo quanto o comprimento máximo de leitura do método de sequenciamento que está sendo usado. Ao usar uma tecnologia de sequenciamento por síntese, como o Illumina MiSeq, o tamanho dos fragmentos de DNA afeta a eficiência com que os clusters são gerados na célula de fluxo. Por exemplo, quando uma biblioteca contém fragmentos de DNA mais curtos e mais longos, os mais curtos serão super-representados nos dados de sequenciamento7,8. Em contraste, uma biblioteca com fragmentos de DNA de tamanho semelhante será proporcionalmente representada nos dados de sequenciamento. Muitos kits de preparação de bibliotecas usam métodos baseados em ligação para adicionar adaptadores aos fragmentos de DNA e a seleção de tamanho é necessária para remover dímeros adaptadores que não contêm uma inserção9,10. Existem vários métodos11,12 para conseguir isso, mas a técnica que dá os resultados mais consistentes é a separação eletroforética do DNA seguida pela recuperação dos comprimentos desejados de DNA13,14. Esse processo pode ser realizado manualmente para um pequeno número de amostras, mas quando confrontado com o processamento de centenas de amostras, são necessárias soluções automatizadas. As plataformas atualmente disponíveis para seleção automatizada do tamanho do gel são de baixo rendimento e novas plataformas são necessárias para processar um grande número de amostras para sequenciamento. A tecnologia Ranger pode ser integrada às estações de trabalho de manuseio de líquidos existentes para permitir o uso de eletroforese em gel de agarose para seleção de tamanho e fins analíticos em uma escala que satisfaça o ambiente de alto rendimento de hoje.

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Protocolo

1. Coleta de Água e Filtração

  1. Coletar amostras de água doce de vários sites (Figura 1). Passe amostras através de uma série de filtros: filtro de 1 um, 0,2 um filtro, e de 30 kDa de corte de filtro de fluxo tangencial para sistematicamente eucariótica separada, partículas de tamanho bacterianas e virais, respectivamente.
    Nota: Apenas a purificação e análise do material recuperado nos filtros de 0,2 um (bactérias de vida livre) é descrito neste relatório, mas estratégias semelhantes podem ser usadas para outras partículas recuperadas a partir dos filtros.

2. Concentração bacteriana, ADN Extracção e Purificação

  1. Remover o filtro de membrana de 0,2 um (s) a partir do sistema de filtração de água (diagrama esquemático, Figura 2). Dobre o filtro de 0,2 um disco ao meio e coloque-o em um tubo de 50 ml com o lado aberto para cima. Adicionar 5 ml de solução tamponada com fosfato (PBS 1x) e 0,01% de Tween, pH 7,4 emo tubo. Se mais do que um filtro é utilizado durante o processo de empregar um tubo diferente por filtro. Tubo (s) de loja com filtro a 4 ° C até serem processadas. Caso contrário, vá para o passo 2.2.
  2. Remover o filtro de membrana de 0,2 um a partir do tubo de 50 ml com uma pinça estéril. Ponto de filtro (s) em uma placa de Petri (deixar o tampão PBS no tubo).
    1. Com uma pinça estéril e tesoura estéril, cortou o filtro em pequenas tiras (1 cm x 1 cm). Desinfetar pinça e tesouras por imersão em 70% isopropanol, limpando com uma superfície descontaminante DNA e enxaguar com água ultrapura do tipo 1 entre as diferentes amostras.
  3. Colocar o filtro de corte em tiras de volta para o mesmo tubo de 50 ml. Adicionar 10 ml de 1x PBS e 0,01% de Tween, pH 7,4 para o filtro, de modo que há um total de 15 mL de tampão no tubo de 50 ml.
  4. Adicione 6 esferas de tungstênio limpo (3 mm de diâmetro) para cada tubo de 50 ml, cobrir o tubo com Parafilm e vortex vigorosamente durante 20 min (use 50 ml tubos adaptador vortex). Se multiple filtros são processados ​​a partir de uma amostra, e transferência da piscina todo o homogeneizado para um tubo limpo de 50 ml. Centrifugar os tubos a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C.
  5. Ressuspender o sedimento de células bacterianas e alíquotas (~ 1 ml) em aliquotas de 1,7 ml tubos de microcentrífuga. Note-se que haverá cinco microtubos por amostra.
  6. Girar os tubos de microcentrífuga a 10000 xg durante 10 min, e remover a maior parte do sobrenadante para baixo de ~ 200 ul marca.
  7. Armazenar as amostras a -80 ° C, ou prosseguir para extrair ADN bacteriano usando um kit de isolamento de ADN comercialmente disponíveis de acordo com as instruções do fabricante. Durante a utilização de bactérias de extracção de ADN PBS ou água como um controlo negativo de extracção, e E. coli como controlo positivo extracção.
  8. Como o DNA de vários tubos estão a ser extraídos, piscina sub-alíquotas paralelas a partir de uma mesma amostra em um tubo de 2 ml. Em seguida, conduzir uma precipitação S / N usando uma solução composta por 0,1volumes de acetato de sódio 3M, 2 volumes de etanol a 100%, e 5 uL de 5 ug / ul acrilamida linear. Misturar bem e armazenar amostras a -80 ° C.
  9. Centrifuga-se a velocidade máxima (17000 xg) durante 30 min a 4 ° C. Lavar pelete com 1 ml de etanol a 70% arrefecido com gelo, ar seco numa câmara de biosegurança para não mais do que 5 minutos e ressuspender o sedimento de ADN em 34 ul de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
    Nota: acrilamida linear irá ajudar a visualizar sedimento de DNA após a precipitação S / N.
  10. Determinar a quantidade de ADN e de qualidade utilizando uma alta sensibilidade do ensaio de quantificação de ácidos nucleicos fluorescente e um espectrofotómetro microvolume, respectivamente, seguindo as instruções do fabricante (ver o quadro de Materiais).
    Nota: Se várias amostras são preparadas na hora, um ensaio nucleico fluorescente ultrasensitive ácido para quantificar dsDNA e baseado em placa fluorometer / espectrofotômetro pode ser usado em seu lugar.

3. Preparação de ADN da biblioteca

  1. Normalizar o ADN genómico bacteriano extraído de amostras de água a uma concentração de ~ 0,2 ng / mL.
  2. Enzimaticamente fragmento de um nanograma de ADN bacteriano usando um método baseado em transposões (tagmentation). Adicionar sequências de adaptador e de índice para DNA fragmentado seguindo as instruções do fabricante. Objecto tagmented amostras a 12 ciclos de PCR, como indicado nas instruções do fabricante, no ponto em que os índices de sequenciação são incorporados.

4. Automated Gel Seleção Tamanho

  1. Ir padrão pós-PCR passo de limpeza descrito nas instruções do fabricante (Ver Tabela de Materiais). Tamanho selecione amostras pós-PCR diretamente usando uma plataforma automatizada de seleção de tamanho com base em gel.
    1. Adicionar 3,5 uL de tampão de carga para cada amostra.
    2. Seguindo o protocolo do fabricante, carregar as amostras para a estação de trabalho electroforese, especificando um tamanho alvo-selecção de 500-800 pb, num extracto de 300 uldo volume de iões, utilizando um pré-moldado de 1,5% de agarose a cassete.
    3. Concentra-se o material resultante em bruto (300 uL) para baixo para 25 ul por precipitação com etanol.
      Nota: Como alternativa, use a estação de trabalho de eletroforese para automatizar concentração para um maior número de amostras através de placa de filtro e tubo de vácuo.
      1. Precipitar o volume de eluição em bruto utilizando 0,1 volumes de acetato de sódio 3M, 2 volumes de etanol a 100% e 5 uL de 5 ug / ul acrilamida linear. Misture bem, coloque as amostras a -80 ° CO / N. Centrifugar as amostras a 17.000 xg durante 30 min.
      2. Rejeitar sobrenadante e prosseguir a lavagem sedimento de DNA com 1 mL de etanol gelado a 70%.
      3. Centrifugar as amostras novamente a 17.000 xg durante 30 min, os sobrenadantes descartar, ar seco, e finalmente ressuspender pelota de ADN em 25 ul de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
  2. (Opcional) Use 1 ml de tamanho bibliotecas de DNA selecionado com a plataforma de seleção de tamanho de gel automatizado para fazer um cincodiluição -fold usando uma solução tampão de Tris-EDTA, pH 8,0. Analisar bibliotecas utilizando um instrumento de eletroforese capilar baseada em chip para analisar a qualidade de dsDNA de acordo com as instruções do fabricante.

5. Biblioteca Normalização e Sequencing

  1. Prossiga para normalizar amostras utilizando contas de normalização de biblioteca (incluído no kit de preparação biblioteca baseada transposon), conforme descrito no guia de preparação do fabricante.
    1. Alternativamente, bibliotecas de dsDNA medir utilizando um ensaio de quantificação de ácido nucleico de alta sensibilidade fluorescente, seguido por agrupamento em proporções equimolares até atingir uma concentração final de 2 nM dsDNA. Avance para desnaturar bibliotecas utilizando 10 ul de bibliotecas reunidas e 10 ul de NaOH 0,2 N, incubar durante 5 min à TA. Diluir bibliotecas desnaturados utilizando tampão de hibridação (incluída com o kit de preparação à base de transposão) para um volume final de 1 ml e a concentração de 23:05.
  2. Amostra de cargas em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração, seguindo os protocolos de seqüenciamento padrão do fabricante.

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Resultados

Concentração DNA, e Avaliação da Qualidade

As concentrações de DNA bacterianas, variou de 0,01-0,11 ng ​​/ ml por amostra de água dos diferentes sítios de bacias (Tabela 1). O ADN isolado a partir de uma fracção bacteriana teve 260/280 e 260/230 A rácios de 1,4 a 1,8 e 0,3 a 1,6, respectivamente. Enquanto alguns dos rácios Um 260/230 foram relativamente baixos, não foi observada inibição aparente na biblioteca preparada e out...

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Discussão

A presença de dímeros de adaptador e aglomeração de pequenas dimensões de inserção preferencialmente sendo sequenciados em plataformas atuais representam uma diminuição nos rendimentos utilizáveis ​​e subutilização da capacidade do equipamento 15. A utilização de métodos de batimento grânulos combinados com uma abordagem baseada no transposão para preparar bibliotecas podem resultar em mais de cisalhamento de ADN em comparação com os outros métodos de extracção de 4,5. No entanto, todos os métodos ...

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Divulgações

Jared R. Slobodan e Matthew J. Nesbitt tanto deter ações da Coastal Genomics, uma empresa British Columbia propriedade privada oferecendo a tecnologia Ranger.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Genome BC, Genome Canada e Coastal Genomics. Os autores agradecem a Kirby Cronin e Michael Chan por sua ajuda na coleta e processamento de amostras. Também gostaríamos de agradecer a Thea Van Rossum e à Dra. Fiona Brinkman pela assistência em bioinformática.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bomba peristáltica Masterflex P/S 1400 SeriesThermo Scientific 1400-1620
0,2 µ m Supor MembraneVWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Esferas de carboneto de tungsténio 3 mm (200)Qiagen69997
Álcool isopropílico 70%Jedmon Products825751Healthcare Plus
DNA awayVWR7010Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Sistema de purificação de água Milli-QFisher ScientificZMQS6VF0YMerck Millipore. Este sistema foi descontinuado.
20x PBS pH 7.5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher chemicals
Adaptador de vórtice para 2 (50  ml) VWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (Modelo G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
Centrífuga BeckmanRaeyco Lab Equipment Systems Management LtdModelo J-6B
PowerLyzer Powersoil Kit de isolamento de DNAVWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
Adaptador de vórtice para 24 tubos (1,5-2 ml)VWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Centrífuga Microfuge 18Beckman Coulter367160
Nimbus Select com Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01Inclui a estação de trabalho de manuseio de líquidos e Ranger Tech integrado (hardware de eletroforese)
Kit de reagentesRanger Coastal GenomicsCG-10600-150-12-21Inclui buffer de carregamento e
Álcool etílico (anidro)Álcoois comerciaisP016EAANGreenfield Etanol
Acetato de sódioSigma-AldrichS2889-250G
Acrilamida linear (5  mg/ml)Life TechnologiesAM9520Ambion
Eppendorf centrífuga refrigeradaRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Buffer EB (250 ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 EspectrofotômetroThermo ScientificND-1000
Qubit fluorômetroLife TechnologiesQ32857Invitrogen. Este produto foi descontinuado.
Kit de ensaio Qubit dsDNA HSLife TechnologiesQ32854Invitrogen
Reagente de DNA de alta sensibilidadeAgilent Technologies5067-4626
Chips de DNA de alta sensibilidadeAgilent Technologies5067-4626
Agilent 2011 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938B
Nextera XT kit de preparação de amostras de DNAIlluminaFC-131-1024
Kit de índice Nextera XTIlluminaFC-131-1001
Kit de reagentes MiSeq v2 (500 ciclos)IlluminaMS-102-2003
Sistema MiseqIlluminaSY-410-1003
Estação de trabalho

Referências

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