No seguinte protocolo, descrevemos um modo muito simples para isolar armadilhas de Neutrófilos extracelulares (NETS) a partir de sangue total humano utilizando reagentes prontamente disponíveis. Em seguida, demonstram como os NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão in vitro com células cancerosas.
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Artigo de método
Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neutrófilos extracelulares Armadilhas (NETS), foram recentemente identificadas como parte do arsenal antimicrobiano da neutrófilo. Para além do seu papel no combate às infecções, investigação recente demonstrou que eles podem ser envolvidos em muitos outros processos de doença, incluindo a progressão do cancro. Isolando NETs purificadas é um elemento crucial para permitir que o estudo dessas funções.
Neste vídeo, demonstramos um método simplificado de célula livre isolamento NET a partir de sangue humano utilizando reagentes facilmente disponíveis. Isolado NET pode então ser utilizado para a coloração de imunofluorescência, blotting ou vários ensaios funcionais. Isto permite uma avaliação das suas propriedades biológicas na ausência dos potenciais efeitos de confusão dos próprios neutrófilos.
Uma técnica de separação por gradiente de densidade é utilizada para isolar os neutrófilos a partir de sangue completo de dadores saudáveis. Isolado neutrófilos são então estimulados por forbol 12-myrsiState 13-acetato (PMA) para induzir NETosis. Os neutrófilos activados são então descartados, e um estoque NET livre de células é obtida.
Em seguida, demonstram como NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão com células de cancro do pulmão humano A549. O estoque NET é utilizado para revestir os poços de uma cultura de células de 96 poços da placa S / N, e depois de se assegurar a formação de uma monocamada NET adequada no fundo dos poços, CFSE rotulados células A549 são adicionados. As células aderentes são quantificados utilizando um microscópio de fluorescência Nikon TE300. Em alguns poços, 1000U DNAse1 é adicionado 10 minutos antes da contagem de degradar NET
Introdução
Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETs) são recém-descoberto elementos derivadas de neutrófilos compostas de cadeias de DNA extracelular decoradas por centenas de proteínas e histonas. Eles são segregadas por neutrófilos no contexto da infecção e inflamação seguintes estímulos específicos e eles foram reconhecidos inicialmente fazer parte dos mecanismos de defesa contra as infecções de neutrófilos. Eles foram mostrados primeiro a promover a captura de vários invasores microbianos, incluindo bactérias, vírus e fungos 1-3. Aprisionando do micróbio, então, levar a sua destruição tanto diretamente pelo proteínas associadas a NET 3,4 e indir....
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Protocolo
NOTA: Todas as experiências foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas institucionais locais.
Desenho 1. Sangue
- Através venipucture antecubital, coletar 14 tubos de sangue de voluntários saudáveis em top verde tubos (heparina) e inverta cada tubo antes de se estabelecer em gelo. Recolha de sangue dentro de 10-15 min de experiência para garantir um rendimento óptimo de neutrófilos.
2. Neutrophil Isolamento de Sangue Total
- Lave cada tubo superior verde do sangue com 5 ml de PBS sem Ca e Mg para diluir o sangue. Em cada uma de 4 x 50 ml tubos cónicos, adicionar 15 ml de Meio....
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Resultados
Realização bem sucedida de um ensaio de adesão estático com NET requer revestimento adequada dos poços com uma monocamada de NET antes da adição de células de cancro (Figura 1). Todos os passos subsequentes deve ser feito com cuidado para não perturbar essa camada. Quando uma camada adequada de NET é formada, espera-se ver as células cancerosas significativa adesão às NET como pode ser visto na Figura 2A e 2C. Este efeito é abolida pela adição de DNAse1, que degrada NET.......
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Discussão
O protocolo de isolamento Armadilha de Neutrófilos Extracelular demonstrado neste vídeo combina diferentes técnicas utilizadas na literatura para o isolamento dos neutrófilos e de formação NET. Ele simplifica um processo bastante complexo e variável e oferece uma maneira muito confiável e replicável para isolar NETs livres de células purificadas com menos etapas do que outros protocolos. Além disso, reagentes prontamente disponíveis são empregados adicionando à simplicidade protocolos e reduzindo significativamente o se.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Paul Kubes por sua orientação e orientação que foram fundamentais na construção deste trabalho.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (PBS), modificada, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio | Wisent | 311-425-CL | |
| Meio de separação de linfócitos (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Cloridrato de dextrano (pó) | Spectrum | DE130 | 6% A solução de dextrano é feita suplementando PBS com Ca e Mg com 6% de pó de dextrano |
| Meio RPMI-1640 com L-glutamina | Wisent | A solução de 350-000-CL | 3% RPMI é feita suplementando RPMI com 3% de soro fetal bovino |
| BD Pharm Lyse Lysing tampão | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Placa de cultura de tecidos Integrid com grade de 20 mm (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
Referências
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al.
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Reimpressões e permissões
