O objetivo deste protocolo é para isolar as células endoteliais que revestem os vasos linfáticos humanos quisto-como malformação linfática e foreskins usando células activadas por fluorescência (FACS). Cultura de células subsequente e expansão destas células permite um novo nível de sofisticação experimental para estudos genéticos, proteomic, funcionais e diferenciação celular.
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Artigo de método
Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Do sistema linfático, como linfedema primário, malformações linfáticas e tumores linfáticos são condições raras que causam morbidade significativa, mas pouco se sabe sobre a sua biologia. Isolamento de células altamente puros humanas endoteliais linfáticas (LECs) a partir de tecido doente e saudável iria facilitar estudos sobre o endotélio linfático em níveis genéticos, moleculares e celulares. Prevê-se que estas investigações podem revelar alvos para novas terapias que podem mudar o manejo clínico dessas condições. Um protocolo descrevendo o isolamento de prepúcio humano LECs e células endoteliais linfáticas malformação linfática LM (LECs) é apresentada. Para obter uma única suspensão de células do tecido foi triturada e tratada enzimaticamente usando colagenase e dispase II II. A suspensão de célula única resultante foi, em seguida, marcadas com anticorpos para o aglomerado de diferenciação (CD) marcadores CD34, CD31, Factor de Crescimento Endotelial Vascular-3 (VEGFR-3) e podoplanin. Staicélulas viáveis nidas foram classificados em um separador de células activado por fluorescência (FACS) para separar o CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 população Pos Pos podoplanin LM LEC de outro endoteliais e células não endoteliais. Os LM LECs ordenados foram cultivadas e expandidas em frascos revestidos com fibronectina para uso mais experimental.
Introdução
Uma das principais funções do sistema vascular linfático é absorver linfa, um excesso de fluido intersticial que contém lipídeos, proteínas e componentes celulares, e conduzi-la para o sistema venoso do sangue. Uma rede de capilares linfáticos dirige linfa para os nódulos linfáticos onde é rastreada quanto à presença de antigenes estranhos, um processo importante na vigilância e implantação de células brancas do sangue para neutralizar os antigénios estranhos imune.
O sistema linfático unidireccional começa em tecidos com o capilar linfático inicial, uma estrutura única, com uma única camada descontínua de células endoteliais planas de pa....
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Protocolo
Declaração de Ética: A aprovação ética para a recolha de tecidos e malformação prepúcio linfáticos foi obtido a partir de Comitês de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital do Royal Children, Melbourne, Austrália. Consentimento assinado foi recebido de pais dos pacientes antes da cirurgia. As amostras de tecidos foram coletadas de pacientes com diagnóstico de LMs submetidos a procedimentos cirúrgicos, como parte de sua gestão clínica e os pacientes submetidos a circuncisão eletivo. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho de Investigação Médica Nacional de Saúde e, na Austrália.
1. Preparação de ....
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Resultados
Após a digestão do tecido inicial, após 24 horas em cultura de amostras não fraccionadas, as colónias de células endoteliais podem ser observadas (Figura 2A), juntamente com as células semelhantes a fibroblastos e células musculares lisas. Seguindo triagem e após 24 horas em cultura de células, as células CD34 CD31 Baixa Pos VEGFR-3 células Pos Pos podoplanina anexar e mostram a morfologia típica de calçada (Figura 2B e C). Utilizando o método FACS.......
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Discussão
LECs desempenhar um papel importante na manutenção da homeostase dos fluidos, resposta imunitária a antigénios estranhos e a absorção e transporte de alguns nutrientes. Homeostase LEC pode ser afectada por processos de doenças, tais como infecções bacterianas e metástases de tumores, mas também pode desenvolver LECs mutações somáticas que resultam na formação de vasos linfáticos disfuncionais e morbidade significativa para os pacientes afectados. Para ganhar mais compreensão da etiologia malformação linfática através do.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Fundação Baker e 'Mulheres na Ciência Fellowship »do Royal Children Foundation apoio de Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty e Edouard G. Stanley são NHMRC Senior Bolseiros de Investigação. Trabalho em seus laboratórios foi apoiada por NHMRC e Células-Tronco Austrália.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Usado para coletar amostras de tecido da sala de cirurgia. |
| Kit de bala EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | O kit de bala EGM-2 MV contém 500 ml de meio EBM-2 e EGF humano, hidrocortisona, gentamicina (GA-1000), soro fetal bovino (FBS), VEGF, FGF-b humano, R3-IGF-1 e ácido ascórbico. |
| VEGF-C | R& D Systems | 2179-VC-025 | A mídia completa de células endoteliais é suplementada com 50 ng/ml de |
| solução antibiótica-antimistótica VEGF-C (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | Esta solução contém 10.000 U/ml de penicilina, 10.000 mg/ml de estreptomicina e 25 mg/ml de antimicótico Fungizone. Use na diluição de 1:100. |
| Fibronectina do plasma humano | Sigma-Aldrich | F2006 | Usado em concentrações de 10 mg / ml. Pode ser reutilizado por até 1 mês se mantido a 4 ° C e mantido estéril. Use 7 ml para revestir balão de 150 cm2. |
| Reagente de dissociação celular StemPro Accutase | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro® Accutase® é utilizado a 0,05 ml por cm2 para cobrir toda a superfície do balão. O uso de volumes menores pode resultar em descolamento celular incompleto. |
| 0,4% Corante azul de tripano | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Usado como um corante de viabilidade. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Usado a 0,04% |
| Colagenase II | Worthington Lab | 4176 | Usado a 0,25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Usado a 0,01% |
| Filtros de células de nylon de 70 mm | BD Falcon | 352350 < | |
| Clone VEGFR-3 conjugado com PE 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Usado na diluição 1:50 |
| PE-Cy7-conjugado CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Usado na diluição 1:200 |
| APC-camundongo conjugado anti CD31 humano, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Usado na diluição 1:100 |
| Alexa 488-conjugado rato anti humano Podoplanina, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | diluição de 1:200 |
| IgG1, isótipo k, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Usado em camundongo conjugado com PE-Cy7 de diluição 1:50 |
| IgG1, isótipo k, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | diluição 1:200 |
| IgG1, isótipo k, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Usado em diluição |
| de 1:100Camundongo conjugado com Alexa 488 IgG2a, isotipo k, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Usado na diluição de 1:200 |
Referências
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of ....
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Reimpressões e permissões
