Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

Summary

Este manuscrito descreve a produção, caracterização e usos potenciais de uma engenharia de tecidos construção de esôfago 3D preparado a partir de fibroblastos de esôfago normais primária humana e células epiteliais escamosas semeadas dentro de um andaime porcino de-celularizado. Os resultados demonstram a formação de um epitélio estratificado maduro semelhante ao esófago humano normal.

Abstract

A incidência de ambos adenocarcinoma de esôfago e seu precursor, metaplasia de Barrett, estão a aumentar rapidamente no mundo ocidental. Adenocarcinoma de esôfago, além disso, geralmente tem um prognóstico pobre, com pouca melhora nas taxas de sobrevivência nos últimos anos. Estas são condições difíceis de estudar e tem havido uma falta de plataformas experimentais adequadas para investigar perturbações da mucosa esofágica.

Um modelo da mucosa esofágica humano foi desenvolvido no laboratório MacNeil que, ao contrário dos sistemas convencionais de cultura de células em 2D, recapitula as interacções célula-célula e célula-matriz presentes in vivo e produz, um epitélio estratificado maduro semelhante ao do ser humano normal esófago. Em resumo, o modelo utiliza células não transformadas fibroblastos humanos primários esofágicas epiteliais normais e cultivadas dentro de um andaime esofágica acelular derivada de porcino. Caracterização imuno-histoquímica desse modelopor CK4, CK14, Ki67 e involucrin coloração demonstra recapitulação adequada da histologia da mucosa do esôfago humano normal.

Este modelo fornece um modelo experimental robusto, biologicamente relevante da mucosa do esôfago humano. Ele pode ser facilmente manipulado para investigar um certo número de perguntas de investigação, incluindo a eficácia dos agentes farmacológicos e o impacto da exposição a factores ambientais tais como o álcool, toxinas, temperatura elevada ou de componentes do refluxo gastro-esofágico. O modelo também facilita a períodos prolongados de cultura não realizáveis ​​com a cultura de células em 2D convencional, permitindo, nomeadamente, o estudo dos efeitos da exposição repetida de um epitélio madura para o agente de interesse para até 20 dias. Além disso, uma variedade de linhas celulares, tais como as derivadas de tumores esofágicos ou metaplasia de Barrett, pode ser incorporado no modelo para investigar processos tais como a invasão do tumor e droga responsiveness em um ambiente mais biologicamente relevante.

Introduction

A mucosa esofágica compreende um epitélio estratificado, escamoso acima de uma camada de tecido conjuntivo, a lâmina, e é um dos primeiros locais para encontrar factores de stress ambientais ingeridos. A exposição a toxinas dieta está implicada no desenvolvimento de carcinoma escamoso esofágico, enquanto o refluxo duodenogastro-esofágica é um factor crítico na patogénese de metaplasia de Barrett, o qual está associado com um maior risco de progressão para adenocarcinoma esofágico. Carcinomas de esôfago são o ^8º tumor maligno mais comum no Reino Unido machos e adenocarcinoma de esôfago está a aumentar rapidamente no mundo ocidental ^1. Além disso, houve pouca melhora no prognóstico da doença, com uma taxa de sobrevida global em 5 anos de cerca de 15%. Consequentemente, há uma necessidade de plataformas experimentais para investigar o impacto da exposição a estressores ambientais sobre este epitélio esofágico e seu potencial envolvimento no desenvolvimento de metaplasia ou neoplasia.

Embora as linhas de células imortalizadas ou de tumor permitir que os investigadores a estudar a resposta de células epiteliais para estes factores de stress in vitro, eles permanecem proliferativa e não conseguem diferenciar-se em células epiteliais maduras encontradas nas camadas superiores da mucosa esofágica. Além disso, linhas de células que já tenham sido submetidos a tumorigénese pode fornecer informação limitada sobre as respostas iniciais de células normais dentro do epitélio a factores ambientais; e esta é a fase em que o potencial para intervenção terapêutica pode ser mais elevada. Finalmente, sistemas de cultura celular convencionais não conseguem capturar as interacções potencialmente importantes entre as células epiteliais e mesenquimais e entre estas células e a matriz circundante que ocorrem dentro de tecidos in vivo.

Modelos animais proporcionam um microambiente mais realista para estudar as respostas do epitheli esofágicahum e pode incorporar a indução artificial da doença do refluxo gastro-esofágico ^2. No entanto, pode ser mais difícil de manipular os estressores ambientais nesses modelos e eles podem não representar plenamente a resposta dentro do esôfago humano.

Outros modelos experimentais esofágicas humanos têm sido desenvolvidos que utilizam células primárias imortalizadas, células ou linhas celulares de tumor em um colagénio, ou combinado colagénio / Matrigel, andaime contendo fibroblastos ^3,4. É menos trabalho intensivo para gerar estes andaimes do que o andaime esofágica acelular descrito neste manuscrito, e estes modelos organotípicas proporcionam uma ferramenta útil, especialmente no estudo de invasão tumoral ^5,6, onde a infiltração de células tumorais no gel de colagénio pode ser prontamente observado. Contudo, estes géis de colagénio tem propriedades mecânicas não nativas e não têm certas características do tecido original, incluindo uma membrana basal específico e o appropriate superfície topografia. Este pode influenciar o comportamento das células, resultando em, por exemplo, adesão pobre entre o epitélio e andaime quando utilizando um gel de colagénio ⁷ andaime. Como consequência, o andaime esofágica porcino acelular foi desenvolvido, com a vantagem de ser um andaime biologicamente mais realista e, portanto, mais adequada para o uso como uma plataforma experimental. Também tem sido demonstrado que é melhor para incorporar células primárias para as construções esofágicas do que as linhas celulares imortalizadas esofágicas epiteliais, tais como Het-1A, uma vez que estas células formam um epitélio de múltiplas camadas, mas não conseguem diferenciar ou estratificar ^4,7,8 .

Por conseguinte, este protocolo foi adaptado a partir de um método já em uso no laboratório MacNeil para fazer o tecido da pele e mucosa oral engenharia ^9,10 e incorpora um andaime de esôfago porcino de-celularizado combinado com células humanas primárias do esôfago epiteliais e fibroblastos. This protocolo produz, um epitélio estratificado maduro, semelhante ao do esófago humano normal como demonstrado por CK4, CK14, Ki67 e involucrina coloração. O modelo resultante proporciona uma plataforma experimental para estudar as respostas a factores de stress ambientais, e tem sido utilizada eficazmente para estudar alterações na expressão do gene no epitélio esofágico em resposta ao material refluído componentes ^11.

Protocol

Células do esôfago humanos são obtidos a partir de pacientes submetidos à cirurgia gástrica ou esofágica. O consentimento informado é obtido para o tecido a ser usado para fins de pesquisa, eo tecido usado de forma anônima sob as aprovações éticas adequadas (SSREC 165/03, Tissue Research Humano Banco Licence 12179).

1. Isolamento de esôfago humano células epiteliais

1. Trabalhando em fluxo laminar capuz de cultura de tecidos e utilizando uma técnica estéril, preparar o meio de cultura epitelial através da mistura de meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD) e F12 de Ham na proporção de 3: 1 (v: v). Adiciona-se 10% (v / v) de FCS, factor de crescimento epidermal 10 ng / ml, 0,4 ug / ml de hidrocortisona, 1,8 x 10 ^{~ 4} M de adenina, 5 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina, 2 x 10 ^-7 M tri-iodotironina, 1 x 10 ^-10 M a toxina da cólera, 2 x 10 ^-3 M glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B.
2. Usando padrãotécnicas estéreis, colocar 11 ml de DMEM, 10% FCS, 2 x 10 ^-3 M de L-glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B num balão de cultura de tecidos T75. Adicionar 1 x 10 ⁶ letalmente irradiados fibroblastos 3T3 de ratinho ¹² em 1 ml do mesmo meio e incubar durante a noite a 37 ° C num CO _2, atmosfera humidificada de 5%. Isto produzirá uma camada alimentadora para a cultura subsequente de células epiteliais.
3. Usando um bisturi e seguindo as recomendações de um histopathologist, dissecar um aproximadamente 2 ^cm2 amostra de tecido da região fundo livre de doença de mucosa epidermóide de esôfago obtidas a partir de pacientes submetidos à cirurgia gástrica ou esofágica. O transporte para o laboratório num recipiente de 50 ml de meio de transporte estéril (PBS 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 0,625 ug / ml de anfotericina B) à temperatura ambiente.
4. Neste ponto, armazenar o tecido no transportemédio de até 12 horas (durante a noite) a 4 ° C, por conveniência; no entanto, não usar períodos de armazenamento de mais tal como resultam da viabilidade celular reduzida.
5. Trabalhando em fluxo laminar capuz de cultura de tecidos e utilizando uma técnica estéril, esterilizar uma lâmina de bisturi por imersão em etanol a 70% durante 5 min. Enxágüe em PBS estéril.
6. Colocar o tecido de uma placa de Petri estéril e usar o bisturi para cortar em tiras de 0,5 centímetros. Adicionar 5 ml de 0,1% (w / v) de tripsina em PBS para a placa de Petri, colocar a tampa no prato e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
7. Adicionar 5 ml de FCS para o tecido no prato de Petri para inibir a tripsina. Segurando a tira de tecido com uma pinça estéril, raspe a superfície epitelial com a lâmina de bisturi para 1-2 min por tira para remover as células epiteliais para o meio circundante. Remover o tecido raspada e reserve. Repetir o processo para todas as tiras do tecido.
8. Recolhe-se o meio contendo as células epiteliais desacopladas em um tubo de centrífuga de 15 mle centrifuga-se (5 min, 200 x g). Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 12 ml de meio epitelial (descrito no passo 1.1).
9. Decantar e rejeitar o meio a partir da camada de células de alimentação no frasco T75 preparado no passo 1.2. Usar uma pipeta estéril para adicionar a suspensão de células contendo as células epiteliais isolada de fresco ao frasco e incubar a 37 ° C em 5% de CO _2, atmosfera humidificada.
10. Após 24 h, deitar fora e deite fora o meio de cultura, que também irá conter os detritos celulares, e substituir com 12 ml de meio fresco epitelial. Continuar a incubação a 37 ° C num CO _2, atmosfera humidificada de 5%. Colônias vão começar a aparecer nos próximos 24 a 48 h e pode ser visto colocando o frasco de cultura sob um microscópio de luz padrão. Decantar o meio de cultura gasto e substitua com um volume igual de meio fresco a cada 2 a 3 dias.
11. Uma vez que o balão tenha atingido 80% de confluência, as células de passagem ^13. Dividir o cells em uma proporção de 1: 5 a aumentar o número de células utilizadas no modelo. Siga passo 1.2 para estabelecer camadas alimentadoras de células 3T3 irradiadas em cada balão que vai receber células epiteliais 24 h antes da passagem das células.
    Nota: Utilize as células epiteliais no modelo de esôfago descrito abaixo entre as passagens 1 e apenas 4.

2. Isolamento de esofágicas fibroblastos humanos

1. Trabalhando em uma câmara de fluxo laminar e usando técnica estéril, tomar o tecido retiradas no passo 1.7. Coloque em uma placa de Petri estéril e pique finamente por cortar com uma lâmina de bisturi estéril. Adicionar 10 ml de 0,5% (w / v) de colagenase A solução e colocar a tampa no prato de Petri e incubar a 37 ° C durante a noite num CO _2, atmosfera humidificada de 5%.
2. Transferir a digest para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar (10 min, 200 x g), cuidadosamente, deitar fora e deite fora o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de cultura de fibroblastos (DMEM 10% de FCS, 2 x 10 ^-3 M de L-glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B).
3. Colocar a suspensão para um frasco T75 e incubar a 37 ° C num CO _2, atmosfera humidificada de 5%. Após 24 h, deitar fora o suporte, que vai conter os detritos e substituir por 12 ml de meio fresco de fibroblastos. Substituir o meio de cultura a cada 2 a 3 dias e as células de passagem, uma vez que tenham atingido 80% de confluência ^13, dividindo as células numa proporção de 1: 5 para aumentar os números de células.
   Nota: Utilize as células de fibroblastos no modelo descrito a seguir entre as passagens 4 e apenas 10.

3. Preparação do De-celularizado esofágico Andaime

1. Obter esófagos suína intacta em um abatedouro de suínos da raça Landrace recém abatidos que são utilizados para a produção de alimentos. Uma esôfago único irá fornecer andaimes suficientes para cerca de 30 construções separadas.
   Nota: Devido à extensa e hora consuming protocolo de esterilização necessário, é normalmente vale obtenção e processamento de um mínimo de 10 esófagos de uma só vez.
2. Colocar imediatamente o esófago recentemente excisada para um vaso estéril de 180 ml contendo aproximadamente 150 ml de solução de povidona-iodo a 10% durante 5 minutos para reduzir a carga microbiana de qualquer contaminação. Transferir o esófago para um segundo vaso contendo aproximadamente 100 ml de PBS estéril contendo 200 UI / ml de penicilina, 200 ug / ml de estreptomicina, e 1,25 ug / ml de anfotericina B.
   1. Colocar a tampa sobre o recipiente e transportar o esófagos de volta ao laboratório à temperatura ambiente. Dois ou três esófagos pode ser transportado em cada recipiente, em função do seu tamanho.
3. Uma vez no laboratório, tratar o tecido de uma câmara de fluxo laminar utilizando uma técnica asséptica para minimizar a contaminação microbiana. Esterilizar pinças, tesouras e lâminas de bisturi por imersão durante 5 min em etanol a 70%, e lavagem em PBS estéril.
4. Lidar com as esophagus usando uma pinça estéreis. Usando a tesoura, corte o esôfago aberto longitudinalmente. Lavar o tecido, colocando o esôfago em um pote estéril de 180 ml contendo aproximadamente 100 ml de PBS estéril e balançando suavemente para remover quaisquer detritos.
5. Limpe uma placa de dissecção cortiça pulverizando generosamente com etanol 70% e deixe secar.
6. Remover o esôfago do PBS, e utilizando agulhas estéreis, o pino para fora do esôfago em cima da prancha, mais elevada superfície da mucosa. Agarrar a superfície da mucosa, numa extremidade do esófago com pinças estéreis e puxar para fora da placa. Isto irá separar a mucosa da submucosa subjacente.
   1. Em seguida, use uma lâmina de bisturi estéril para dissecar o esôfago longitudinalmente ao longo da lâmina própria, remoção de pinos como a dissecção progride para permitir que a mucosa a ser levantada.
7. Reter a mucosa dissecada e descartar a submucosa subjacente.
8. Cortar e descartar as mais proximais e distais dois centímetros de tele mucosa, há um maior número de glândulas submucosas e uma lâmina mais espessa nas zonas, respectivamente ^7.
9. Usar um bisturi para cortar o tecido restante em de 5 ^cm2. Colocar todo o tecido cortado em um vaso estéril de 180 ml contendo aproximadamente 150 ml de PBS estéril e agitar suavemente para enxaguar o tecido. Se o processamento de mais de cinco esôfago em um tempo que pode ser necessário usar vários vasos para esta e as três etapas seguintes.
10. Usando pinças estéreis, transferir o tecido cortado em um vaso de 180 ml contendo 150 ml de 1 M estéril de NaCl, 200 UI / ml de penicilina, 200 ug / ml de estreptomicina e 1,25 ng / ml de anfotericina B. incubar durante 72 horas a 37 ° C.
11. Coloque o tecido em um pote de 180 ml fresco contendo 150 ml de PBS estéril. O epitélio terá começado a separar visivelmente a partir do tecido subjacente. Descascar delicadamente o epitélio desanexação do esôfago porco usando uma pinça estéril e descarte.
    1. Inserir o restante tquestão em uma jarra de 180 ml e adicionar 150 ml de PBS estéril. Agitar suavemente durante 5 minutos para lavar. Deitar fora o PBS e repetir mais duas vezes com PBS fresco.
12. Colocar todo o tecido dentro de uma garrafa de vidro de 500 ml contendo 400 ml de estéril 80% (v / v) de solução de glicerol durante 24 horas à temperatura ambiente. Transferir para 400 ml de estéril 90% (v / v) de solução de glicerol durante mais 24 h.
13. Armazenar em 400 ml de solução de glicerol a 100% estéril à temperatura ambiente durante um mínimo de 4 meses para desidratar e esterilizar o tecido ao mesmo tempo preservando a integridade da membrana basal.

4. Produção da Cultura Mídia

1. Prepare quelado de soro de vitelo recém-nascido para a utilização no meio de cultura.
   1. Despeje 100 g de Chelex 100 em uma garrafa de vidro de 1 L e adicionar água de-ionizada. O volume exacto não é crítica, mas deve ser suficiente água adicionada para cobrir o pó Chelex. Adicionar um agitador magnético e esterilizar em autoclave (121 ° C durante15 min).
   2. Deixar a garrafa arrefecer e o Chelex a assentar. Em uma câmara de fluxo laminar, deitar fora o excesso de água, adicionar 500 ml de soro de vitelo recém-nascido (NCS) e deixar a agitar durante a noite a 4 ° C.
   3. Pare de mexer e deixe o Chelex para resolver, isso pode levar até 30 min. Em uma câmara de fluxo laminar, decanta-se o soro quelada utilizando uma pipeta estéril, tendo cuidado para não perturbar o Chelex, e armazenar em 10 mL de alíquotas a -20 ° C.
2. Prepare três meios diferentes numa câmara de fluxo laminar, começando com pró-proliferativa e terminando com formulações de pró-diferenciativas.
   1. Prepare Composição Meio I composto de Hams F12 e DMEM numa razão 3: 1 (v: v), 4 x 10 ^-3 M de L-glutamina, 0,5 ug / ml de hidrocortisona, 1 x 10 ^{~ 4} M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 ^-12 M triiodotironina, 1,8 x 10 ^{~ 4} M de adenina, 1,88 x 10 ^-3 M de _CaCl2, 4 x 10 ^-12 M progesterona, 10? g / ml emsulin, 10 ug / ml de transferrina, 10 ng / ml de selénio, 1 x 10 ^-3 M de etanolamina e 0,1% (v / v) quelatado NCS.
   2. Prepare Composite Médio II como Composite Médio Eu exceto substituir soro quelatados com 0,1% (v / v) não-quelado NCS.
   3. Prepare Composite Médio III como Composite Médio II, excepto omitir progesterona e aumento sérico de 2% (v / v) não-quelado NCS.

5. Produção da Mucosa Modelo de esôfago humano

1. Executar todo o trabalho em uma capela de fluxo laminar, utilizando uma técnica asséptica para manter um ambiente estéril. Esterilizar todas as ferramentas por imersão em etanol a 70% durante 5 min, antes da lavagem em PBS estéril.
2. Um dia antes de ele é necessário, hidratar o andaime de esôfago suína acelular. Um pedaço de andaime é necessário para cada constructo a ser preparado.
   1. Para reidratar o lugar tecido peças suficientes de andaime suína em um pote contendo 100 ml de PBS estéril, agite e deixe de molho por 10 min. Decant o PBS e substituir com PBS fresco. Repetir o processo de lavagem cinco vezes para assegurar a remoção de todos os vestígios de glicerol.
3. Testar a esterilidade andaime por incubação durante a noite o tecido re-hidratado em 100 ml de DMEM a 37 ° C. Se não houver mudança de cor ou a turvação do meio de cultura no final do período de incubação, o andaime é assumido ser estéril. Uma vez que a esterilidade foi confirmada, colocar de 5 cm ² acelular andaime em uma placa de 6 poços, com o lado superior da submucosa.
4. Coloque um anel estéril de grau médico de aço inoxidável (diâmetro interno 10 mm, 20 mm de diâmetro externo) para o centro de cada um andaime e pressionar suavemente para baixo usando fórceps estéreis, para assegurar uma vedação adequada com o tecido.
5. Colher as fibroblastos utilizando tripsina-EDTA ¹³ para produzir uma suspensão de células. Contar as células usando um hemocitómetro ^14. Centrifugar a suspensão de células (10 minutos, 200 x g). Ressuspender o sedimento de células em um appropriate o volume do meio de fibroblastos para produzir uma contagem celular final de 2,5 x 10 ⁶ culas por ml.
6. Adicionar 0,2 ml de meio de fibroblastos, contendo 5 x 10 ⁵ fibroblastos humanos esôfago, dentro de cada anel. Inundar a área em torno do exterior do anel, com cerca de 2 ml de meio de fibroblastos. Incubar a 37 ° C num CO _2, atmosfera humidificada de 5%.
7. Após 24 horas remover a anéis e fibroblastos meio e adicionar, pelo menos, 5 ml de meio de fibroblastos fresco a cada poço, assegurando que o andaime está totalmente imerso no meio. Cultura de uma semana, a 37 ° C em 5% de CO _2, atmosfera humidificada substituindo o meio a cada 2 a 3 dias.
8. Depois de uma semana remover as placas de 6 poços contendo os andaimes para uma inundação capa laminar, remova a médio e inverter cada andaime usando uma pinça estéril, colocar a superfície da mucosa superior. Este ponto de tempo é referido como o dia 0.
9. Colocar os anéis de aço sobre a superfície da mucosa no centro deo tecido como no passo 5.4.
10. Preparar os balões T75 de células epiteliais para tripsiniza�o ^13. Após a lavagem com PBS, e antes da adição de uma solução de tripsina-EDTA, adiciona-se 2 ml de solução estéril de 0,02% (w / v) de solução de EDTA a cada frasco. Incubar durante 2 min a 37 ° C. Toque suavemente o frasco para separar selectivamente a camada alimentadora i3T3 enquanto deixando as células epiteliais em anexo.
    Nota: Geralmente, não é prático ou necessário para paciente corresponder as células epiteliais para os fibroblastos já incorporados no modelo da semana anterior.
11. Decantar a solução de EDTA contendo a camada de alimentação e adicionar solução de tripsina-EDTA a colheita das células epiteliais ^13. Contar as células usando um hemocitómetro ^14. Centrifugar a suspensão de células (10 minutos, 200 x g). Ressuspender o sedimento de células em um volume apropriado de composto Meio 1 para produzir uma contagem celular final de 5 x 10 ⁶ culas por ml.
12. Adicionar 0,2 ml de Meio I Composição, contendo 1 x 10 ⁶ células epiteliais, dentro do anel. Inundar a área em torno do exterior do anel, com cerca de 2 ml de Meio I Composição e colocar as construções na incubadora a 37 ° C em 5% de CO _2, atmosfera humidificada.
13. Após 24 h (Dia 1) remover os anéis e o meio e adicionar, pelo menos, 5 ml de fresco Composição Meio I, assegurando os andaimes são totalmente submersa e retornar para a incubadora. Após mais 24 h (Dia 2) remover o meio e substituída com, pelo menos, 5 ml de meio II Composição, assegurando novamente os andaimes são totalmente submersa e retornar para a incubadora.
14. No dia 4 lugar grades de malha de aço inoxidável de grau médico estéril (2 cm de largura x 2 cm de comprimento x 0,5 cm de altura), em novas placas de 6 poços, um por construto. Use pinças estéreis para transferir as construções para o topo das redes de aço, no ponto mais alto da superfície da mucosa.
    1. Adicionar suficiente Médio Composto III, de modo que o líquido atinja a parte inferior do compósito, mas a superfície éexposto ao ar, o que garante que a amostra é mantida a uma interface ar-líquido. O volume exacto de meio necessária irá variar, dependendo da espessura do andaime, o volume do poço e a altura exacta da grelha de aço inoxidável.
15. Manter os compósitos numa interface ar-líquido durante entre 10 e 20 dias (dia 14 ao dia 24), dependendo das necessidades da experiência. Substitua o Composite Médio III por meio fresco cada 2 a 3 dias (segunda-feira, quarta-feira, sexta-feira é um regime user-friendly).
    Nota: Depois de 5 dias a uma interface ar-líquido (dia 9) as construções têm um epitélio esofágico suficientemente maduro para ser usado em experimentos do impacto dos factores ambientais sobre o epitélio esofágico.
16. No final da experiência, fixar as construções para análise histológica e coloração imuno-histoquímica ^{7, 15} ou extracto de proteína ou ARN ^11,16 a partir do epitélio para mais analysé. Se necessário, reter o meio de cultura condicionado para análise de moléculas de sinalização extracelulares ^17.

Results

Este manuscrito descreve o processo necessário, mostrado de forma esquemática na Figura 1, a cultura de modelos em 3D do epitélio humano esofágica com sucesso. Para confirmar a adequação do modelo como uma plataforma experimental histológica e imuno-histoquímica estudos foram realizados comparando com os tecidos cultivados mucosa escamosa esofágica humano normal.

A avaliação histológica do epitélio produzida pelo método descrito mostra um, de múltiplas camadas, epitélio esca...

Discussion

Este manuscrito descreve a produção e caracterização de um modelo biologicamente relevante da mucosa esofágica humana adequada para utilização como uma plataforma experimental para estudar o impacto da exposição a factores de stress ambientais sobre o epitélio esofágico.

Os passos mais críticos para o sucesso da produção de um modelo da mucosa esofágica humano são: assegurando que a maior parte das células epiteliais permanecem proliferativa e não ter já começado a diferenciar antes de semea...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tripsina	BD Biosciences	215240	Prepare a solução a 0,1% p / v em PBS e filtre a esterilização. Quente em 37  ° C banho-maria antes de usar.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Quente em 37  ° C banho de água antes
de usar Presunto's F12	Labtech	LM-H1236	Quente em 37  ° C banho-maria antes de usar
Soro de Bezerro Fetal	Labtech	FB-1090
Fator de Crescimento Epidérmico	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µ g/ml de solução-mãe em ácido acético 10 mM, 1% FCS
Hiddorcortisona	Sigma-Aldrich	H0396	Preparar a solução-mãe em PBS e filtrar a esterilização antes de usar
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	Preparar a solução-mãe em PBS e esterilizar por filtro antes de usar
Insulina	Sigma-Aldrich	I2767	Preparar solução 10 mg/ml em 0,01  M HCl, diluir 1:10 em água destilada e esterilizar com filtro antes de usar
Transferrina	Sigma-Aldrich	T2036	Preparar solução estoque em água destilada e esterilizar com filtro antes de usar
Triiodotironina	Sigma-Aldrich	T2752	Preparar solução estoque em água destilada e esterilizar com filtro antes de usar
Toxina da cólera	Sigma-Aldrich	C8052	Preparar solução estoque em água
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P0781
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Nome da marca Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolva 1 comprimido em 100  ml de água e autoclave para esterilizar
a colagenase A	Roche	10103578001
solução de iodopovidona	Ecolab	10830E	Marca Videne
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Soro de bezerro recém-nascido	Gibco	26010074
Progesterona	Sigma-Aldrich	P8783	Preparar a solução estoque em DMEM e esterilizar por filtro antes de usar
Etanolamina	Sigma-Aldrich	E9508	Preparar solução estoque em DMEM e esterilizar por filtro antes de usar
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H0888	Preparar solução estoque em DMEM e esterilizar por filtro antes de usar usar
O-fosforiletanolamina	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare a solução estoque em DMEM e filtre esterilize antes de usar
ITS (insulina, transferrina, selênio)	Lonza	17-838Z	Usado para preparação de mídia composta
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Quente em 37  ° C banho-maria antes de usar
solução EDTA 0,02%	Sigma-Aldrich	E8008	Quente em 37  ° C banho-maria antes da utilização
Balão de cultura T75	VWR	734-2313
Tubo de centrifugação de 50 ml	Fisher	11819650
Tubo universal de 15 ml	SLS	SLS7504
Pote de 180 ml	VWR	216-2603
Placa de Petri	SLS	150350
Placa de 6 poços	VWR	734-2323
anéis			Fabricado em casa - aço inoxidável de grau médico, diâmetro interno 10 mm, diâmetro externo 20 mm
grades			Fabricado em casa - as folhas têm furos de 0,3 cm de diâmetro, dobradas para produzir grade 2  cm (l) x 2 cm (p) x 0,5 cm (a)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1. Use em 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10. Use em 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002. Use em 1:200.
Involucrina	Novocastra	INV	Clone SY5. Use em 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Camundongo 3T3 fibroblastos	ATCC-LGC	CRL-1658	anteriormente crescimento interrompido por irradiação (60 Gy)