As células-tronco mesenquimais são geralmente obtidas da medula óssea e requerem cultura de expansão. Quando as amostras coagulam antes do processamento, um protocolo usando a droga trombolítica (enzimática) uroquinase pode ser aplicado para degradar o coágulo. Assim, as células são liberadas e disponibilizadas para cultura de expansão. Este protocolo fornece uma alternativa rápida e barata à reamostragem.
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Artigo de método
Um método enzimático para a Salvação da Células-Tronco Mesenquimais de amostras Clotted Medula Óssea
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Células-tronco mesenquimais (MSCs) - geralmente obtidas da medula óssea - geralmente requerem cultura de expansão. Nosso protocolo usa uroquinase de grau clínico para degradar coágulos na medula óssea e liberar MSCs para uso posterior. Este protocolo fornece uma alternativa rápida e barata à reamostragem da medula óssea. A medula óssea é uma importante fonte de MSCs, que são interessantes para engenharia de tecidos e terapias autólogas com células-tronco. Após a retirada, a medula óssea pode coagular, pois compreende todo o sistema hematopoiético. Os coágulos resultantes também contêm MSCs que são perdidas para cultura de expansão ou terapia direta com células-tronco. Percebemos que 74% das amostras de medula óssea canina continham coágulos e produziram menos da metade do número de células-tronco esperado de amostras não coaguladas. Assim, desenvolvemos um protocolo para digestão enzimática desses coágulos para evitar a reamostragem de medula óssea trabalhosa e cara. A uroquinase - um medicamento trombolítico clinicamente aprovado e prontamente disponível - elimina os coágulos da medula óssea quase completamente. Como consequência, os aspirados de medula óssea tratados produzem um número semelhante de MSCs como amostras não coaguladas. Além disso, após o tratamento com uroquinase, as células mantiveram sua atividade metabólica e a capacidade de se diferenciar em linhagens condrogênicas, osteogênicas e adipogênicas. Nosso protocolo recupera amostras de sangue coagulado e medula óssea sem afetar a qualidade das células. Isso torna a reamostragem obsoleta, reduz consideravelmente os custos de amostragem e permite o uso de amostras coaguladas para pesquisa ou terapia.
Introdução
As células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenham um papel importante em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Eles podem migrar, diferenciar-se em vários tipos de células 1 e enxertar, o que os torna os candidatos ideais para terapias autólogos 2,3. Ultimamente, os ensaios clínicos utilizando MSCs de osso e cartilagem reparação, doença enxerto versus hospedeiro ou doença cardíaca foram lançados 4. Estes MSCs podem ser colhidas a partir do cordão umbilical, ou tecido adiposo, mas os resultados mais promissores foram obtidos a partir de medula óssea derivadas de células estaminais 5.
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Protocolo
NOTA: aspirados de medula óssea Humanos da crista ilíaca foram coletados de doadores consentindo com a aprovação do comitê de ética do cantão de Lucerna. Aspirados de medula óssea a partir de canino da crista ilíaca foram recolhidas com consent.Human do proprietário do cão (aprox. 20 ml) e canina (aprox. 10 ml), aspirados de medula óssea eram anti-coagulados por adição de 15 ml de citrato de sódio a 3,8% imediatamente depois da retirada no teatro operação. As amostras foram transferidas para o ambiente de laboratório para o processamento do mesmo dia como retirado.
1. Preparação de Urokinase (Antes de 1º Use)
- Reconst....
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Resultados
Os fatos que 74% das amostras de medula óssea de cães (n = 54) contidos coágulos quando chegaram em nosso laboratório (Figura 1A), juntamente com a diminuição da produtividade MSC partir dessas amostras, nos fez acreditar que um número considerável de MSCs foi preso dentro dos coágulos . Com efeito, uma simples DAPI-mancha de material de coágulo seccionado confirma a presença de células nucleadas em alta densidade (Figura 1B). E isso leva a baixos números de MSCs disponíveis para expans.......
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Discussão
Rotineiramente nós amostra da medula óssea, enquanto o paciente está a sofrer a cirurgia (no nosso caso, a cirurgia da coluna, principalmente), com a vantagem de que apenas pouco trabalho adicional tem de ser efectuada pelo pessoal na sala de cirurgia. Mesmo que as amostras são misturadas com citrato de sódio imediatamente após a retirada, muitas amostras foram parcialmente coagulado quando chegaram no laboratório para processamento. Nesta fase, resampling para substituir espécimes coagulados seria uma intervenção adici.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 e pela Swiss Paraplégic Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Médios Basais | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Humano FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha com Nucleosídeo, com Glutamina Estável | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Inativado por Calor | Amimed | 2-01F36-I | |
| Anfotericina B | Applichem | A1907 | |
| Componentes Adipogênicos do Meio DMEM-HAM | |||
| F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| Soro para coelhos | Gibco | 16120099 | |
| Dexametasona | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma | I5879 | |
| Biotina | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazona | Pantotenato Sigma | R2408 | |
| Óleo Sigma | P5155 | ||
| Vermelho-O | Sigma | O0625 | |
| Componentes do Meio Osteogênico Ácido | |||
| L-ascórbico 2-fosfato | Sigma | A8960 | |
| ß-glicerofosfato | Nitrato de prata Sigma | G9422 | |
| (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Componentes | |||
| Biopad - dispositivo médico em forma de esponja | Euroresearch | ||
| L-prolina | Sigma | P5607 | |
| Insulina-Transferrina-Selênio X | Gibco | 51500056 | |
| Fator de crescimento transformador humano-β 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear rápido vermelho | Sigma | N8002 | |
| Citrato tri-sódico genérico | |||
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| 0,5% de tripsina-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| coloração de Giemsa | Applichem | A0885 | |
| Formaldeído | Applichem | A0877 | |
| Ácido sulfúrico (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Cloridrato de guanidina | Applichem | A1499 | |
| Consumíveis Tubo de | |||
| reação de 50 ml | Seringa Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| de 10 ml | Braun | 4606108V | |
| Agulha Sterican (22G) | Braun | 4657624 | |
| Microtubos de 1,7 ml | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μ filtro de células m | Falcon | 6.05935 | |
| pinça estéril | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| bisturi estéril | Braun | 5518059 | |
| Placa de corte de células Primaria | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| frasco de cultura de células - Frasco T300 | TPP | 90301 | |
| Equipamento | |||
| Gabinete de biossegurança microbiológica classe II | Skan | 82011500 | |
| banho-maria | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Pipeta sorológica 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscópio | Olympus | CKX41 | |
| incubadora umidificada Heracells 240 | Thermo científico | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo 75004331 |
Referências
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., e....
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Reimpressões e permissões
