Um método enzimático para a Salvação da Células-Tronco Mesenquimais de amostras Clotted Medula Óssea

Resumo

As células-tronco mesenquimais são geralmente obtidas da medula óssea e requerem cultura de expansão. Quando as amostras coagulam antes do processamento, um protocolo usando a droga trombolítica (enzimática) uroquinase pode ser aplicado para degradar o coágulo. Assim, as células são liberadas e disponibilizadas para cultura de expansão. Este protocolo fornece uma alternativa rápida e barata à reamostragem.

Resumo

Células-tronco mesenquimais (MSCs) - geralmente obtidas da medula óssea - geralmente requerem cultura de expansão. Nosso protocolo usa uroquinase de grau clínico para degradar coágulos na medula óssea e liberar MSCs para uso posterior. Este protocolo fornece uma alternativa rápida e barata à reamostragem da medula óssea. A medula óssea é uma importante fonte de MSCs, que são interessantes para engenharia de tecidos e terapias autólogas com células-tronco. Após a retirada, a medula óssea pode coagular, pois compreende todo o sistema hematopoiético. Os coágulos resultantes também contêm MSCs que são perdidas para cultura de expansão ou terapia direta com células-tronco. Percebemos que 74% das amostras de medula óssea canina continham coágulos e produziram menos da metade do número de células-tronco esperado de amostras não coaguladas. Assim, desenvolvemos um protocolo para digestão enzimática desses coágulos para evitar a reamostragem de medula óssea trabalhosa e cara. A uroquinase - um medicamento trombolítico clinicamente aprovado e prontamente disponível - elimina os coágulos da medula óssea quase completamente. Como consequência, os aspirados de medula óssea tratados produzem um número semelhante de MSCs como amostras não coaguladas. Além disso, após o tratamento com uroquinase, as células mantiveram sua atividade metabólica e a capacidade de se diferenciar em linhagens condrogênicas, osteogênicas e adipogênicas. Nosso protocolo recupera amostras de sangue coagulado e medula óssea sem afetar a qualidade das células. Isso torna a reamostragem obsoleta, reduz consideravelmente os custos de amostragem e permite o uso de amostras coaguladas para pesquisa ou terapia.

Introdução

As células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenham um papel importante em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Eles podem migrar, diferenciar-se em vários tipos de células ¹ e enxertar, o que os torna os candidatos ideais para terapias autólogos ^2,3. Ultimamente, os ensaios clínicos utilizando MSCs de osso e cartilagem reparação, doença enxerto versus hospedeiro ou doença cardíaca foram lançados ^4. Estes MSCs podem ser colhidas a partir do cordão umbilical, ou tecido adiposo, mas os resultados mais promissores foram obtidos a partir de medula óssea derivadas de células estaminais ^5.

A crista ilíaca permite recolher uma quantidade considerável de medula óssea e, portanto, serve como local principal de aspiração ^6. No entanto, a qualidade do aspirado diminui com o aumento de volume de medula óssea retirada. Enquanto os primeiros 5 ml de aspirado de medula óssea conter MSCs de alta qualidade, a retirada de volumes maiores leva a diluição do aspirado com sangue periférico fesde o osso altamente vascularizado ^7. Devido às actuais megacariócitos e plaquetas, aspirados de medula óssea são propensas a coagulação, a menos que sejam utilizados anticoagulantes. Mas, mesmo com anticoagulantes, pode ocorrer a formação de coágulos.

Na medula óssea, as MSCs constituem apenas uma pequena proporção do conjunto total de ⁸ células e têm de ser expandidas em cultura para engenharia de tecidos ou mais aplicações terapêuticas ^4. A qualidade de uma tal cultura depende em grande parte do conjunto de células inicial, isto é., A diversidade e um elevado número de partida ^9. Baixo número de MSCs de levantamentos pode ser parcialmente explicado pela variabilidade dos doadores. Por outro lado, as MSCs a partir de amostras de baixa qualidade requerem mais tempo em cultura e passagem em estendida para atingir o número desejado de células. Em ambos os casos, passaging estendido é uma fonte de senescência celular e pode levar à perda de potencial de diferenciação ^10. Portanto, os protocolos que podem maximizar celular y otimizadoield e prevenir contra os efeitos prejudiciais têm de ser desenvolvidas ^11,12.

Quando começamos a trabalhar com MSCs caninos, ficamos surpresos ao ver que cerca de três em cada quatro amostras de medula óssea de cães contido coágulos, enquanto amostras humanas felizmente coagulado (uma em cada dez) foram menos freqüentes. Por outro lado não foi nenhuma surpresa, observou-se que os rendimentos muito mais baixos de MSCs a partir de amostras coaguladas. Para resolver o problema recorrente de amostras coaguladas, que desenvolveu o protocolo usando o urokinase droga trombolítica em vez de reamostragem.

Terapias trombolíticos pode neutralizar situações que ameaçam a vida, como a oclusão de vasos sanguíneos, provocando um ataque cardíaco, acidente vascular cerebral ou embolia devido a coagulação indesejada. Eles trabalham por degradação dos coágulos através da clivagem enzimática da fibrina pela plasmina e enzimática do plasminogênio ativadores. Apesar da ampla utilização para o tratamento de pacientes, apenas muito poucas publicações que existem atividades trombolíticos utilizadopara aplicações de laboratório para resgatar amostras coaguladas, focando principalmente nos linfócitos. Em 1987, Niku et al. descreveram o uso de estreptoquinase para dissolver coágulos de sangue, resultando em linfócitos funcionais ¹³ e quatro anos mais tarde, De Vis et al. estendeu o uso de estreptoquinase para isolar as células de leucemia de sangue e medula óssea para aplicações de citometria de fluxo ^14. A publicação mais recente sugere o uso de Alteplase para diagnóstico de câncer ^15. Enquanto estiver usando a mesma abordagem enzimática, nosso protocolo incide sobre o isolamento de multipotentes da medula óssea MSCs forma a fornecer uma ferramenta para os pesquisadores da área de células-tronco.

Protocolo

NOTA: aspirados de medula óssea Humanos da crista ilíaca foram coletados de doadores consentindo com a aprovação do comitê de ética do cantão de Lucerna. Aspirados de medula óssea a partir de canino da crista ilíaca foram recolhidas com consent.Human do proprietário do cão (aprox. 20 ml) e canina (aprox. 10 ml), aspirados de medula óssea eram anti-coagulados por adição de 15 ml de citrato de sódio a 3,8% imediatamente depois da retirada no teatro operação. As amostras foram transferidas para o ambiente de laboratório para o processamento do mesmo dia como retirado.

1. Preparação de Urokinase (Antes de ^1º Use)

1. Reconstituir uroquinase utilizando solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) de acordo com as instruções do fabricante: Adicionam-se 10 ml de PBS para o frasco septo-entrada utilizando uma seringa de 10 ml. Dissolver a substância seca por agitação para obter 50.000 unidades de injeção (U) por ml.
2. Preparar alíquotas de 500 ul (25.000 U) em cada stubos terile. Alíquotas da loja -20 ° C e usá-lo quando necessário para pelo menos 6 meses.

2. Preparativos Passos (antes de cada Medula Óssea Treatment)

1. Descongelar uma alíquota de urokinase (25.000 U) per aspirado de medula óssea coagulado (volumes aspirado até 25 ml foram tratados com sucesso utilizando uma alíquota única de 25.000 U).
2. Pré-aqueça um banho-maria ou incubadora com agitação a 37 ° C.

3. digestão enzimática do Clot

1. Realizar todos os trabalhos em uma cabine de segurança biológica fluxo laminar para evitar contaminação microbiana das amostras de medula óssea durante o processamento. Quando se trabalha com material humano potencialmente infeccioso, o uso de luvas de protecção, bem como a manipulação cuidadosa é aconselhável.
2. Coloque uma peneira de 100 um de células no topo de um tubo estéril de 50 ml. Com cuidado, despeje o aspirado de medula óssea através do filtro de células, inclinando a peneira ou em movimento em torno do material do coágulo. Use a ponta da pipeta estéril paramelhor fluxo através do filtro de rede.
   Nota: Evite qualquer diluição do coágulo, por exemplo, lavando o coágulo com PBS. Urokinase atua indiretamente e requer componentes do soro (ie., Plasminogênio) a partir da biópsia para efetiva digerir. Enquanto continua o procedimento com o material de coágulo, o filtrado pode ser mantido à temperatura ambiente até à sua utilização no passo 3.6.
3. Transferir o material coágulo de medula óssea em uma placa de cultura de célula vazia usando uma pinça estéril. Cortar os detritos em pedaços pequenos de cerca de 2 mm ^3, utilizando um bisturi esterilizado.
4. Transferir os pequenos pedaços do coágulo dentro de um tubo de reacção de 50 ml utilizando o fórceps estéreis. Verifique se o coágulo picada tem uma aparência molhada. Se ele parece ser seca, use parte do filtrado do passo 3.1 para umedecer.
5. Tritura-se o coágulo, pipetando para cima e para baixo para 5 vezes usando uma pipeta de 5 ml de microtitulação. Adicionar uma parte alíquota de urocinase para a amostra. Incubar durante 30 min a 37 ° C, quer num banho de água ou ema (gentilmente) incubadora de agitação.
6. Triturar por pipetagem cima e para baixo por 5 vezes usando uma pipeta de 5 ml. Execute esta etapa em um gabinete de biossegurança. Incubar durante mais 30 min a 37 ° C. Após a incubação, tritura-se novamente 5 vezes usando uma pipeta de 5 mL. Passe longo de um 100 um novo filtro de células de reunir com o filtrado do passo 3.2.
7. Centrifugar a suspensão de células à temperatura ambiente durante 10 min a 500 x g. Descartar o sobrenadante. Re-suspender o sedimento de células em meio, tal como descrito abaixo, ou de acordo com o procedimento padrão de laboratório para o MSC expansão da cultura.

4. Sementeira para Cultura de Células de Expansão e placas CFU

1. Ressuspender as células (que consiste em eritrócitos e células mononucleares) em 50 ml de meio basal Alpha-MEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina e 2,5 mg / mL de anfotericina B . Contar as células diluída 1:10 em solução de Azul de Tripano usando um chambe Neubauerr.
2. Placa as células em frascos de cultura de célula a uma densidade de 5 x 10 ⁷ células / ^cm2, e incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C. Se possível, use hipóxia (5% de oxigênio) condições. Para o controlo do ensaio de CFU, placa 10 ⁹ células em uma placa de cultura celular de 10 cm de diâmetro.
3. Após 3 dias de cultura, as células estaminais mesenquimais estão ligados à placa de cultura celular, enquanto outras células permanecem em suspensão. Mudar os meios com meio basal suplementado com factor de 5 ng / mL de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Para o controle ensaio CFU, tratar o prato de cultura de células da mesma forma.
4. Continue a cultura de células para um total de 2 semanas, a troca de meios três vezes por semana. Se as células superior a 80% de confluência, dividido por tripsinização. Para o controlo do ensaio de CFU, trocar a mídia da mesma forma, mas não se dividem as células para o curso de duas semanas.

5. Giemsa para ensaio CFU

1. Preparar 10 ml de solução-Giemsa por prato: dilute a solução estoque (7,6 g / l Giemsa em glicerol: metanol) 1:10 em água estéril (sempre preparar uma diluição de trabalho de fresco).
2. Remova o material da placa de cultura de células e lavar as células com PBS. Seja muito precautious ao aplicar líquido para a placa de petri e evitar lavagem fora das células.
3. Fix células em metanol puro durante 5 min à TA. Descarte o metanol. Adicionar a solução-Giemsa e incubar durante 60 min, num incubador humidificado a 37 ° C.
4. Lavar duas vezes com PBS. Air secar a cabeça placa pela primeira vez em uma toalha de papel. Contar as colónias manualmente. Este é melhor conseguido utilizando uma caneta marcador na parte de trás da placa.

6. MSC Diferenciação

1. MSCs caninos diferenciação
   NOTA: MSCs caninos foram diferenciadas em condrogênica, osteogênica e linhagens adipog�icas por estimulação com a mídia apropriada por quatro semanas.
2. Para Diferenciação adipogênica, MSCs cultura em monocamada em 4 x 10 ⁵ cells / cm ² alternando dois diferentes condições de cultura como se segue;
   1. Cultura em meio de manutenção contendo adipogénese GlutaMAX DMEM +, 3% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / mL de anfotericina B e 170 mM de insulina.
   2. Cultura em meio de indução de adipogénese com meio de manutenção suplementado com 3% de FBS, 5% de soro de coelho, 1 uM de dexametasona, 500 uM de 3-isobutil-1-metilxantina, 33 uM de biotina, 5 uM e 17 uM rosiglitazona pantotenato ^16.
   3. Revel as gotículas lipídicas por coloração com óleo Vermelho-O. Resumidamente, corrigir as células com 10% de formaldeído, lavar com PBS e manchar com óleo 0,35% O vermelho em isopropanol.
3. Para diferenciação osteogénica cultura em monocamada em MSCs de 7 x 10 ³ células / ^cm2 e estimulam a seguir:
   1. Avançada DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / ml de anfotericina B, 501; M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 10 mM beta-glicerofosfato e 100 nM de dexametasona.
   2. Identificar os depósitos de mineralização por Von Kossa (5% AgNO _3). Resumidamente, fixar as células com formaldeído a 10%, lava-se com PBS e mancha com 5% de AgNO ₃ em água destilada.
4. Diferenciação condrogênica
   1. Corte cubos (3 mm de cada lado) de uma esponja em forma de dispositivos médicos, constituída a partir de liofilizado colágeno tipo I, e utilizado como material de andaime para apoiar células ^17.
   2. MSCs das sementes no topo dos cubos, na concentração de 4 x 10 ⁶ células / ml (~ 70.000 células / cubo).
   3. Antes da adição de meios, para permitir que as células aderem aos cubos durante 30 min.
   4. Manter construções MSC-colagénio em meio condrogénica consistindo de DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / ml de anfotericina B, 40 ng / ml de dexametasona, 50 ug / ml ascórbico ácido 2-fosfato,50 ug / ml de L-prolina, 1x insulina-transferrina-X Selénio, e 10 ng / ml de factor de crescimento transformante-β1.
   5. Use coloração azul alcian visualizar acúmulo de proteoglicanos nas seções construções. Resumidamente, corar as secções O / N com 0,4% de azul de alcian dissolvido em 0,01% _de H ₂ SO ₄ e 0,5 M de cloridrato de guanidina. Em seguida, lavam as secções foram lavadas durante 30 minutos em 40% de DMSO e 0,05 M de _MgCl2. As células foram contrastadas com vermelho rápido nuclear.

Resultados

Os fatos que 74% das amostras de medula óssea de cães (n = 54) contidos coágulos quando chegaram em nosso laboratório (Figura 1A), juntamente com a diminuição da produtividade MSC partir dessas amostras, nos fez acreditar que um número considerável de MSCs foi preso dentro dos coágulos . Com efeito, uma simples DAPI-mancha de material de coágulo seccionado confirma a presença de células nucleadas em alta densidade (Figura 1B). E isso leva a baixos números de MSCs disponíveis para expans...

Discussão

Rotineiramente nós amostra da medula óssea, enquanto o paciente está a sofrer a cirurgia (no nosso caso, a cirurgia da coluna, principalmente), com a vantagem de que apenas pouco trabalho adicional tem de ser efectuada pelo pessoal na sala de cirurgia. Mesmo que as amostras são misturadas com citrato de sódio imediatamente após a retirada, muitas amostras foram parcialmente coagulado quando chegaram no laboratório para processamento. Nesta fase, resampling para substituir espécimes coagulados seria uma intervenção adici...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			Médios Basais
PenStrep 100X	Gibco	15140122
Humano FGF-basic	Peprotech	100-18B
MEM Alpha com Nucleosídeo, com Glutamina Estável	Amimed	1-23S50-I
FBS Inativado por Calor	Amimed	2-01F36-I
Anfotericina B	Applichem	A1907
Componentes Adipogênicos do Meio DMEM-HAM
F12 + GlutaMAX	Amimed	1-26F09-I
Insulina	Sigma	I5500
Soro para coelhos	Gibco	16120099
Dexametasona	Applichem	D4902
3-Isobutil-1-metilxantina	Sigma	I5879
Biotina	Sigma	B4639
Rosiglitazona	Pantotenato Sigma	R2408
	Óleo Sigma	P5155
Vermelho-O	Sigma	O0625
Componentes do Meio Osteogênico Ácido
L-ascórbico 2-fosfato	Sigma	A8960
ß-glicerofosfato	Nitrato de prata Sigma	G9422
(AgNO3)	Sigma	S6506
Componentes
Biopad - dispositivo médico em forma de esponja	Euroresearch
L-prolina	Sigma	P5607
Insulina-Transferrina-Selênio X	Gibco	51500056
Fator de crescimento transformador humano-β 1	Peprotech	100-21
Alcian Blue 8GX	Sigma	A3157
Nuclear rápido vermelho	Sigma	N8002
Citrato tri-sódico genérico
PBS	Applichem	964.9100
0,5% de tripsina-EDTA	Gibco	15400054
coloração de Giemsa	Applichem	A0885
Formaldeído	Applichem	A0877
Ácido sulfúrico (H2SO4)	Applichem	A0655
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Applichem	A1584
Cloreto de magnésio (MgCl2)	Applichem	A3618
Cloridrato de guanidina	Applichem	A1499
Consumíveis Tubo de
reação de 50 ml	Seringa Axygen	SCT-50ML-25-S
de 10 ml	Braun	4606108V
Agulha Sterican (22G)	Braun	4657624
Microtubos de 1,7 ml	Brunschwig	MCT-175-C
100 μ filtro de células m	Falcon	6.05935
pinça estéril	Bastos Viegas, SA	489-001
bisturi estéril	Braun	5518059
Placa de corte de células Primaria	Falcon	353803
C-Chip Neubauer Improved	Bioswisstech	505050
frasco de cultura de células - Frasco T300	TPP	90301
Equipamento
Gabinete de biossegurança microbiológica classe II	Skan	82011500
banho-maria	Memmert	1305.0377
Stripettes Pipeta sorológica 5ml	Corning	4487-200ea
microscópio	Olympus	CKX41
incubadora umidificada Heracells 240	Thermo científico	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	Thermo 75004331

Componentes do meio condrogênico di-hidratado Applichem A3901 Urokinase Medac 1976826 científico