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A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais

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DOI:

10.3791/52697

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1 de agosto de 2015

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1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada

Autores correspondentes: Nikolai L. Chepelev <nikolai.chepelev@gmail.com>

Neste artigo

Resumo

O objectivo do presente protocolo é a detecção do marcador de oxidação do DNA, 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais.

Resumo

O stress oxidativo está associado a diversos processos fisiológicos e patológicos, assim como o metabolismo xenobiótico, levando a oxidação de biomacromoléculas, incluindo ADN. Portanto, a detecção eficiente de oxidação do DNA é importante para uma variedade de disciplinas de investigação, incluindo a medicina e toxicologia. Um biomarcador comum de ADN é danificado oxidativamente 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; erroneamente frequentemente referido como 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OH-dGuo ou 8 -oxo-dG)). Vários protocolos de medição 8-oxo-dGuo por cromatografia líquida de alta pressão com detecção electroquímica (HPLC-ED) foram descritos. No entanto, estas foram principalmente aplicada a ADN purificado tratados com pró-oxidantes. Além disso, devido a diferenças metodológicas entre laboratórios, principalmente devido às diferenças de equipamento analítico, a adoção de métodos publicados para a detecção de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requer otimização cuidadosa de cada laboratório. UMAprotocolo abrangente, que descreve este processo de otimização, é inexistente. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para a detecção de 8-oxo-dGuo por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais. Ele ilustra como a preparação da amostra de ADN podem ser facilmente e rapidamente optimizada para minimizar a oxidação do ADN indesejáveis ​​que podem ocorrer durante a preparação da amostra. Este protocolo demonstra como detectar 8-oxo-dGuo em células humanas cultivadas adenocarcinoma alveolar (isto é, células A549) tratadas com o agente oxidante KBrO 3, e a partir do baço de ratinhos expostos ao hidrocarboneto aromático policíclico dibenzo (DEF, p) criseno (DBC, anteriormente conhecido como dibenzo (a, l) pireno, DalP). Em geral, este trabalho ilustra como uma metodologia de CLER-ED pode ser facilmente optimizado para a detecção de 8-oxo-dGuo em amostras biológicas.

Introdução

Espécies reativas de oxigênio (ROS), cujos níveis de estado estacionário pode aumentar durante muitas condições patológicas e metabolismo xenotoxic, contribuir para um aumento da frequência de dano oxidativo ao DNA. Entre os vários possíveis nucleobases produtos de oxidação, lesões oxidativas do ADN pode ser facilmente medida utilizando o marcador estável de 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que é uma das formas oxidadas de 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo é o mais abundante lesão de DNA 2 e, por conseguinte, foi estudada a maior detalhe como um biomarcador oxidação DNA, apesar da existência de múltiplos produtos de oxidação de ADN 3. Nos seres humanos, este dano pode ser reparado através de base de reparo de excisão por 8-oxoguanine glicosilase 1 (hOGG1) 4. Se reparado, 8-oxo-dGuo pode contribuir para a formação da base de mutações de substituição de par (isto é, transversões de G para T) 4. Importante, 8-oxo-dGuo é um marcador estabelecido fodano do ADN r em relação à iniciação e promoção da carcinogénese 2. Portanto, a quantificação precisa de 8-oxo-dGuo é um biomarcador útil e desejável de dano oxidativo ADN 5.

Há uma confusão generalizada na literatura sobre os nomes corretos para as formas oxidativamente-danificadas do 2-desoxiguanosina e, além disso, o nome correto do composto (s) medidos rotineiramente como um biomarcador de dano oxidativo DNA 6. Os 6,8-diceto-enol e 6, 8-ceto formas tautoméricas de 8-oxo-dGuo (mostrado na Figura 1) são os dois tautómeros mais proeminentes discutidos na literatura 5,7. A forma de ácido 6,8-diceto é a forma mais proeminente a pH fisiológico de 7,4, e é o mais proeminente do produto de oxidação de DNA 7. Portanto, 8-oxo-dGuo, em vez de 8-hidroxi-dGuo é o nome mais adequado para este produto de oxidação 6. É também importante notar que a 2-desoxiguanosina (dGuo), em vez de nucleobase guanina (Gua) ou guanosina ribonucleósido (Guo), respectivamente, é detectado pela maioria dos métodos 6.

Detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo preciso é um desafio devido a: i) a variabilidade na digestão da amostra de ADN, ii) oxidação acidental de dGuo a 8-oxo-dGuo que pode ocorrer durante a preparação da amostra, e iii) a necessidade eficaz para validação do método de HPLC analítico ED-8. Neste protocolo, com vista à consecução i) proporcionando condições favoráveis, para a digestão completa do ADN e ii) pela inclusão quelante de metal e soluções tratados com quelantes e um reagente especial de isolamento de DNA, enquanto iii) foi apenas parcialmente abordados pela inclusão de controlos positivos e proporcionando, assim, que o método é capaz de detectar 8-oxo-dGuo em amostras biológicas. Além disso validação está além do escopo deste artigo. No entanto, estamos confiantes de que este protocolo vai ajudar o prospectivoutilizadores determinar a extensão em que eles precisam validar formalmente o protocolo, dependendo das suas finalidades. Uma lista dos passos requeridos para a validação formal do método é ainda proporcionado. Durante o desenvolvimento e implantação de um método de detecção 8-oxo-dGuo, métodos publicados foram revistos e consolidados. Assim, este método elimina a necessidade de recolher informações a partir de várias fontes publicadas que carecem frequentemente importantes detalhes experimentais ao mesmo tempo proporcionar meios rápidos e simples de testar se o método para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo foi adoptada com sucesso. Este método foi adaptado empregue com sucesso para analisar amostras de ADN a partir de células cultivadas e tecidos de murino. Este artigo de vídeo ajudará outros grupos no estabelecimento de um método eficaz para a detecção e quantificação fiável de 8-oxo-dGuo por CLER-ED.

Protocolo

Certifique-se de que todos pecuária, acomodação, manuseamento e experimentação aderir às regras e regulamentos locais e que os protocolos de experimentação sejam aprovadas antes de iniciar qualquer estudo. Para as experiências descritas, cuidados animais, manipulação e tratamento foram aprovados pelo Comitê Animal Care a Health Canada. Consulte a "Tabela de Reagentes" para obter informações dos fornecedores.

1. Coleta de Amostras Biológicas

  1. As células ou tecidos animais
    1. Cultivar células do adenocarcinoma A549 alveolares humanos em meio F12-K contendo 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina.
    2. Semear as células em aproximadamente 1 milhão de células por uma placa de 10 cm. Para cada experiência, utilizam um conjunto de placas 12 no total (três placas de repetição por um biológica x quatro doses) para proporcionar ADN suficiente (80 ug) para a digestão enzimática e análise por HPLC.
    3. Quando a densidade de células torna-se maior do que aproxmadamente 70% da área da superfície da placa, meios de remover e lavar as células duas vezes com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4.
    4. No caso de células animais em cultura, usar KBrO 3 como um controlo positivo.
      NOTA: se uma relação linear positiva entre concentração KBrO 3 e frequência de 8-oxo-dGuo tem sido relatado na literatura 9.
    5. Dissolver KBrO 3 em PBS. Certifique-se de que a concentração final no meio de cultura celular é maior do que 1 mm, para obter um aumento estatisticamente significativo na 8-oxo-dGuo em relação a células de un-expostos. Adicionar a mesma concentração de KBrO 3 a cada placa em série (por exemplo, placas de 12 10 cm).
    6. Incubar as placas durante 3 h a 37 ° C. Remova a mídia e lavar uma vez com PBS.
    7. Adicionar 1 ml de solução de tripsina (concentração de estoque de 2,5 g / ml) e incubar durante 3 min a 37 ° C.
    8. Lava-se com 4 ml de PBS, recolher as células a partir de cada conjunto num único polystyr 50 ml cónicoeno tubo de centrífuga, e centrifugar a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
    9. Remover PBS e armazenar o sedimento de células à temperatura de -80 ° C até análise posterior. Oxidação de ADN artificial pode ser ainda minimizado por isolamento nuclear, tal como descrito noutro local 10.
  2. Tecidos animais
    1. Dose animais, conforme necessário. Para este protocolo, adulto (9 semanas de idade) tratar masculino Muta rato por sonda oral por dia durante três dias consecutivos com 20 mg DBC / kg de peso corporal por dia dissolvido em azeite de oliva.
      NOTA: Este animal transgênico portos engenharia λ-bacteriófago e mutação do gene repórter lacZ de E. coli 11 é usado para roedores transgênicos mutação ensaios 12.
    2. Execute necropsia de animais, por exemplo, os ratos anestesiados pode usar isoflurano e, em seguida sacrificados através de deslocação cervical seguido de abertura da cavidade torácica. Piscar imediatamente tecidos congelados em nitrogênio líquido. Armazenar os tecidos a -80 ° C até à análise.
      NOTA: O momento da eutanásia após o tratamento pode ser uma outra variável importante (por exemplo, a oxidação do ADN era máxima a 72 h após a exposição ao ruído no cérebro de rato e de fígado 13).

2. Extração de DNA, Precipitação e Wash (para os tecidos prosseguir diretamente para 2.2)

  1. Homogeneizar as células coletadas em um tubo cônico de 50 ml de poliestireno centrífuga com 1 ml de DNA isolar agente como DNAzol. Usar uma pipeta de ponta de 1.000 ul, para dispersar o sedimento de células até a solução ficar homogénea. Transferir homogeneizado para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar em gelo durante 10-20 min. Continuar em 2.3.
  2. Homogeneizar 15-20 mg de tecido em 1 ml de um homogeneizador de vidro portátil antiaderente contendo 500 ul de agente de isolamento de DNA. Delicadamente levantar e abaixar homogeneizador durante cerca de 1 min; tecidos moles requerem menos tempo. Tratamento suave garante menos de corte de DNA. Armazenar o homogeneizado em gelo durante cerca de 10-20 min.
  3. PastilhaO homogeneizado por centrifugação durante 10 min a 10.000 x g e 4 ° C num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónico.
  4. Transferir cuidadosamente o sobrenadante resultante em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml prestando muita atenção para evitar entrar em contato com o sedimento.
  5. Precipitar o DNA do homogenado por adição de 0,5 ml de EtOH a 100% por 1 ml de homogenato. Inverta tubos 10 vezes para garantir o isolamento e reagente de EtOH são suficientemente misturados.
  6. Neste ponto, o DNA é precipitado viscoso, enrolar-lo para uma ponta de pipeta de plástico (por exemplo, com uma capacidade máxima de retenção de 200 ul) e, em seguida, transferido para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml cónico.
    NOTA: centrifugação rápida pode ser empregue para remover qualquer lisado remanescente a partir do ADN isolado.
    (ADN de lavagem e de solubilização)
  7. Adicione 1 ml de EtOH a 75% para o ADN isolado. Suspende-se o sedimento de DNA bem, invertendo os tubos 10 vezes.
  8. Cuidadosamente decantar o etanol a partir do tubo. Certifique-se de que the ADN sedimentar varas para o lado do tubo. Armazenar os tubos verticalmente durante 1-2 min e usar uma pipeta para remover qualquer excesso de EtOH a partir do fundo do tubo.
  9. Repetir a lavagem mais uma vez de ADN, e ou armazenar a amostra no seio de EtOH à temperatura de -20 ° C (estável durante vários meses) ou proceder imediatamente à digestão.
  10. Dissolve-se o ADN em tampão de digestão (descrito abaixo) e, em seguida, quantificar utilizando métodos espectroscópicos normais (isto é, absorvância a 260 nm utilizando NanoDrop espectrofotómetro).

3. Digestão Enzimática

  1. Prepare "tampão de digestão" combinando volumes apropriados (dependendo do número de amostras a ser digerido) de 50 mM de fosfato de Na monobásico (contendo 2,0 mM de KCl, 1,0 mM de desferal (DFO) e 200 mM MgCl2) com 50 mM de fosfato de Na dibásico (também contendo KCl 2,0 mM, 1,0 mM de DFO e 200 mM MgCl2). Cada amostra requer 4,0 ul monobásicos e 17,0 ul de solução de fosfato dibásico.
  2. remover qualquer remanescente de EtOH a partir da parte inferior das amostras de tubos e seco ao ar durante cerca de 5 min. Certifique-se de que o DNA não seque completamente.
  3. Dissolve-se 80 ug do DNA extraído em 21,0 ul de tampão de digestão, adicionar 1 unidade de ADNase I dissolvido em 2,0 mL de tampão de digestão.
  4. Vortex levemente para alcançar uma boa mistura e incubar durante 1,5 horas a 37 ° C.
  5. No final do período de incubação, adicionar 216,4 ml de solução de fosfato dibásico de Na 50 mM contendo 2,0 mM de KCl, 1,0 mM de DFO e 200 mM de MgCl2.
  6. Prepare "tampão de digestão-2" pela combinação de um volume de tampão de digestão com nove volumes de dibásico, 50 mM de fosfato de Na (com KCl 2,0 mM, 1,0 mM de DFO e 200 mM MgCl2).
  7. Adicionar 0,025 unidades de fosfodiesterase (PDE) eu enzima em 16,3 uL de tampão de digestão-2. Pipeta cima e para baixo durante alguns segundos, em seguida, vortex levemente para alcançar uma boa mistura e incubar durante 1,5 horas a 37 ° C.
  8. Adicionar 00,4 unidades de fosfatase alcalina (AP) em 8,0 uL de tampão de digestão-2. Pipeta cima e para baixo durante alguns segundos, em seguida, vortex levemente para alcançar uma boa mistura e incubar durante 1,5 horas a 37 ° C. Adicionar 33,0 ul de MeOH de grau HPLC.
  9. Executar amostras de ADN digerido por HPLC, como descrito a seguir, imediatamente ou armazenar a -80 ° C até à utilização para minimizar a oxidação. NOTA: Os passos de digestão de 1,5 hr aqui sugeridas são baseadas em tais intervalos sugeridos em outros lugares 9 e sobre as conclusões que os protocolos semelhantes alcançar a digestão de DNA completa 9. Por isso, assumiu-se que o único factor limitativo para alcançar a digestão completa foi tempo e que a inibição da enzima e da amostra não homogeneidade foram negligenciáveis.

4. HPLC Run: Preparação da fase móvel, a instalação de Instrumentação e Manutenção

  1. Use água ultrapura para preparar todas as soluções tampão e tratada com resina de alta resistência de união (por exemplo, Chelex 100: estireno divinylbecopolímero nzene com iminodiacetato íons que metais de transição com elevada afinidade de quelato) para minimizar a contaminação de metal e oxidação do DNA durante a preparação da amostra.
  2. Preparar tampão fosfato de Na 250 mM, pH 6,2. Utilizar uma razão de 1: 3,6957 de fosfato de sódio dibásico (FW = 177,99 g / mol) para fosfato de sódio monobásico (FW = 119,98 g / mol).
    Exemplo: Por conseguinte, para uma solução de 3 L combinar 70,81 g de fosfato monobásico e 28,43 g de pó dibásico, adicionar água até a, por exemplo, 2,8 L e verificar que o pH da solução é 6,2. Ajustar o pH com 250 mono ou fosfato de sódio dibásico soluções mM, preparados separadamente e não por ácidos concentrados ou bases. Adicionar 2,24 g de KCl para se obter uma concentração de 10 mM de KCl.
  3. Preparar a fase móvel em três frascos, pelo menos, 1 L de cada vez, contendo: solvente B - metanol de grau HPLC, solvente - B de água ultrapura, e solvente C - tampão de fosfato a partir do passo 4.2. Insira HPLC tubulação de fornecimento de fase móvel para as garrafas; remainitubos ng deve ser também mergulhado numa das garrafas (por exemplo, solução C) preparada e mesmo que não são necessários para a mistura.
  4. Durante o funcionamento, misturar as soluções de fase móvel como 6% de solvente A, 74% de solvente B e 20% de solvente C para se obter uma solução final de tampão de 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,2) com 2,0 mM de KCl, e 6% de MeOH.
  5. Retire o eletrodo do detector eletroquímico, desmontá-lo e referência limpo e eletrodos que trabalham com as soluções de limpeza do eléctrodo e os discos para polir recomendados pelo fabricante. Lavar as superfícies limpas com água ultrapura, limpe a água com cuidado e garantir o detector está seca antes de ligar o sistema.
  6. Remontar o detector e ligue a entrada de fase móvel para o eletrodo. Ligue o fluxo e permitir que a fase móvel, para encher o eléctrodo antes de acoplar o tubo de saída de fase móvel. Instale uma nova coluna antes de iniciar a otimização. Certifique-se de que a instalação está na direção correta e forma todas as recomendações do fabricante.
  7. Ligue a instrumentação HLPC bem à frente (por exemplo, 1 hora) de amostra analisa a permitir o equilíbrio e para reduzir o ruído da linha de base. Ver Tabela 1 para configurações sugeridas; o limite da pressão de volta deve ser definida para 3000 psi para evitar danos coluna. Ligue o desgaseificador. Prossiga com injeção das bombas e da criação de gradiente de solvente.
  8. Privilegiada a seco as bombas de acordo com as instruções do fabricante. Fazê-lo para molhar as linhas quando a fase móvel foi substituída ou o tubo de entrada está exposta ao ar.
  9. Localize o disco priming e inserir a 10-15 ml seringa de plástico lá. Certifique-se a seringa está totalmente inserido antes de abrir a linha. Para abrir as linhas simplesmente virar o sentido anti-horário disco por um turno.
  10. Comece o primo com a selecção da interface HPLC apropriado. Com cuidado, puxe a seringa para extrair o líquido para as linhas. Uma vez que líquido está fluindo, o principal é completo; permitir que o programaterminar a corrida. Repita o procedimento para todas as linhas (geralmente quatro, dependendo do instrumento).
  11. Em alternativa, prima molhados quando as linhas já estão molhadas de uma privilegiada seco antes (veja abaixo).
    NOTA: Quando uma grande quantidade de tempo decorrido entre os usos (por exemplo, 2 semanas ou mais), um primo seco é recomendado.
  12. Alterar a composição dos componentes solventes de fase móvel de 25% de cada um utilizando a interface do utilizador de HPLC. A partir da interface, selecione a opção "Função directa", em seguida, selecionar a opção "Wet Prime". Isto irá primos todas as linhas ao mesmo tempo.
  13. Certifique-se de que todo o ar está fora do sistema, observando a linha principal molhado, uma vez que entra no recipiente de resíduos. Depois de uma boa privilegiada, garantir que não há bolhas são deixados na linha. Se bolhas persistir, repita priming.
  14. Uma vez que a bomba está preparado, começam a se mover a fase móvel de HPLC. Utilizar a interface de HPLC para alterar manualmente a composição da fase móvel para metanol a 6% (solvente A) e 94%água (solvente B), e seleccionar uma taxa de fluxo de 0,9 ml / min. Permitir 5 minutos para limpar qualquer metanol a partir do passo de limpeza coluna.
  15. Depois de 5 minutos, para alterar a composição de 6% de metanol (solvente A), 74% água (solvente B), tampão de 20% (solvente C), aumentar a taxa de fluxo de 1,0 ml / min. Definir outros parâmetros, como resumido na Tabela 1, e definir o limite da pressão de volta para 3000 psi para evitar danos coluna.
    NOTA: Os problemas potenciais com a configuração HPLC incluem linha de base à deriva, pico dividida e intensidade do sinal diminui. Estes geralmente podem ser superados com a limpeza da coluna após cada utilização, de limpeza do eléctrodo freqüente, e garantir que as soluções tampão são livres de contaminação (por exemplo, partículas em suspensão ou crescimento microbiano).
  16. Executar a fase móvel durante cerca de 1-1,5 horas para atingir um sinal de linha de base estável.
  17. Utilizando a interface de software do instrumento, seleccione os parâmetros como indicados na Tabela 1 e conjunto de tempo de corrida a 15 min. Injectar a sample. Use aumento dos tempos de execução para amostras complexas (determinar esta empiricamente por observação da presença ou ausência de picos para além do intervalo de 15 min).
    NOTA: O software Instrumento permite a programação de condições de execução de amostra e configuração para autosampling.
  18. Após as corridas foram concluídos, desligar o detector de célula usando a interface do detector. É importante seguir as recomendações do fabricante em relação a desligar o detector como manuseio inadequado e shut-down pode danificar o instrumento. NÃO desligue o celular por mudar parte de trás do detector, pois isso pode danificar o instrumento.
  19. Alterar manualmente a composição da fase móvel a 6% de metanol e 94% de água. Corra por 5 min.
  20. Reduzir manualmente a taxa de fluxo de 0,7 ml / min, imediatamente alterar a composição para 50% de MeOH e 50% de água. Executado por pelo menos 20 min. A falha para executar esta etapa durante o tempo recomendado pode resultar em danos para a coluna e o detector. Desligue o fluxo, umad, em seguida, desligue o desgaseificador.

5. Preparação de Normas

  1. Preparar tampão de fase móvel como descrito nas etapas 4,1-4,3 acima. É importante utilizar a fase móvel de HPLC para a preparação de padrões para evitar picos resultantes da mistura de soluções diferentes após a injecção da amostra.
  2. Dilui-se esta solução de uma em cada cinco com água ultrapura antes da utilização, e a solução final deve conter 6% de MeOH.
  3. dGuo Padrão
    NOTA: O potencial de alta oxidação necessário para a detecção dGuo pode aumentar o risco de medição compostos interferentes electroactivos. Isto pode ser verificada por meio de, por exemplo, uma curva-padrão de detecção de UV a 260 nm dGuo e comparando-a com a curva padrão criada com detecção CE. Se ambos alinham bem (por exemplo, Figura Suplementar 1) e os efeitos da matriz de amostra foram tomados em consideração, pode-se proceder à detecção dGuo por UV a 260 nm, em vez de detecção CE.
    1. Medir 1,0 mg de dGuo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1,0 ml de MeOH de grau HPLC.
    2. Vortex em alta velocidade até dGuo se dissolva completamente. Este é o estoque primário; armazenar a -20 ° C durante várias semanas.
    3. Para criar o estoque dGuo secundário (0,5 mM), diluir 143 ul de estoque primário dGuo em 857 mL de fase móvel de HPLC. Armazenar em gelo até o uso e preparar diariamente.
    4. Fazer diluições adicionais para criar uma curva padrão (por exemplo, a Tabela 2). Soluções de loja no gelo e preparar diariamente. Padrões são executados em série com amostras experimentais.
    5. Antes de se executar, variar a tensão do detector utilizando a concentração mais elevada do estoque para encontrar tensão óptima.
  4. 8-oxo-dGuo Padrão
    1. Medir 1,0 mg de 8-oxo-dGuo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 0,1 ml de MeOH de grau HPLC. Vortex na alta velocidade até 8-oxo-dGuo se dissolva completamente. Esta é a principal estoque de 8-oxo-dGuo. Armazenar a -20 ° C durante sevsemanas Gerais.
    2. Em um tubo separado, misture 2,9 ul de estoque primário e 997,1 mL de tampão de fase móvel de HPLC, vortex. Este é o estoque secundário (10.000 nM).
    3. Para criar uma solução de trabalho para a curva padrão (250 nM), combinar 24,4 ul de estoque secundário e 975,6 uL de tampão de fase móvel.
    4. Realizar outras diluições para fornecer as soluções necessárias para criar uma curva padrão (por exemplo, Tabela 3). Soluções de loja no gelo e preparar diariamente. Normas de execução com as amostras experimentais.
  5. Quantificação
    1. Integrar a área sob a curva para ambos 8-oxo-dGuo e dGuo usando o software padrão (como uma parte da interface de computador-HPLC; ver Figura 2A Recurso).
    2. Construir curva padrão (concentração conhecida de cada analito vs a área sob a curva (Figura 2B Recurso). Utilizando a equação da curva padrão, para calcular a relação 8-oxo-dGuo / dGuo para cada amostra.

6. Agarose Gel Eletroforese

NOTA: electroforese em gel de agarose podem ser realizados para verificar a integridade de digestão de ADN.

  1. Prepare 50x Tris-acetato-EDTA (TAE) tampão, dissolvendo-se 242 g de base Tris (FW = 121,14) em 750 ml de água ultrapura. Adicionar 57,1 ml de ácido acético glacial e 100 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0; EDTA se dissolverá completamente quando o pH da solução é ajustado a 8,0 com, por exemplo, NaOH) e adicionar água ultrapura até um volume final de 1 L. loja à TA, diluir esta solução 50x antes da utilização.
  2. Pesam-se 1 g de agarose e dissolvê-lo em 100 ml de tampão 1x TAE, aquecimento no microondas durante 1-2 min. Usar óculos e equipamentos de proteção para evitar contato com agarose fervente.
  3. Arrefecer a solução para baixo até aproximadamente 50 ° C, adicionar 5 mL de brometo de etídio (cuidado: mutagênico) e deite-o no aparelho de gel de agarose em execução. Insira o pente.
  4. Aguardar até que a solução solidifica, derrame tampão TAE sobre o gel e carregar as amostras (de volume depende do tamanho pente; tipicamente, 10-20 ul da amostra de DNA é carregado, misturado com corante 6x correndo para visualizar e facilitar o carregamento).
  5. Submeter o gel até o corante migra aproximadamente 2/3 do comprimento do gel (por exemplo, 45 minutos a 150 V). Visualize as bandas de ADN sob a luz UV.

Resultados

dGuo foi observado a ter um tempo de retenção de 4,7 minutos enquanto que 8-oxo-dGuo teve um tempo de retenção de aproximadamente 6,4 minutos (Figura 2A e B). Há uma diferença de cerca de 1.000 vezes em as alturas dos picos entre os dois analitos, como pode ser visto na Figura 2C. Voltamogramas de 8-oxo-dGuo e dGuo foram obtidos por padrões que funcionam a um potencial de trabalho na gama de 0,2-1,1 V. O potencial de trabalho óptima para o 8-oxo-dGuo foi determinada como sendo 0,5 V e +0,9 V para dGuo (Figura 3). Estes potenciais estão de acordo com outros eletrodos de carbono vítreo descritos na literatura 14,15. O limite de detecção e gama dinâmica de detecção electroquímica 8-oxo-dGuo e dGuo é relatado para estar na gama femtomole e nanomole, 8,9, respectivamente. As curvas padrão para dGuo e 8-oxo-dGuo deve ser executada diariamente para garantir a detecção linear ao longo de um intervalo de concentração apropriada e efectuar adequadadade do instrumento (Figura 4). As curvas padrão são construídas representando graficamente a área do pico em função da concentração de analito conhecida (Figura Suplementar 2) que permite calcular a concentração do analito na amostra a partir da equação gerada a partir das curvas padrão.

A digestão completa do DNA é necessária para medições precisas de frequência 8-oxo-d'água e vários métodos de digestão de ADN genómico ter sido sugerido 8,15,16. Sempre que necessário, a eficácia da extracção do ADN e digestão pode ser verificado através de electroforese em gel de agarose (Figura 5A) e HPLC-ED (Figura 5B). Lanes com esfregaço DNA óbvio na Figura 5A (por exemplo, pistas 2, 4, 6, 9, 11 e 13) indicam a presença de DNA não digerido enquanto amostras com fragmentos de ADN digeridos correr fora do gel e foram, portanto, sem ser detectado. O planalto na Figura 5B indica que mais incubatina de ADN com enzimas de digestão além 1,5 h não resulta numa maior quantidade de dGuo detectado, sugerindo digestão quase completa após 1,5 horas. Além disso, tanto a electroforese em gel de agarose e HPLC-ED foram usadas para testar a utilidade do tampão de digestão de ADN à base de fosfato aqui utilizado. Este tampão é bem adaptado para a fase móvel de HPLC e não dá origem a ruídos indesejáveis ​​detector atribuível a mistura de soluções diferentes (dados não mostrados). Por conseguinte, a mudança do tampão sugerido na literatura (por exemplo, Tris-HCl a 8) para tampão fosfato de sódio é recomendada para este protocolo (esquerda versus direita da Figura 5A). Por favor, note que os pressupostos subjacentes para a otimização da digestão do DNA eram aquela enzima inibição e falta de homogeneidade da amostra foram insignificantes e tempo de digestão foi o único fator limitante, como indicado acima. Uma possibilidade que a digestão incompleta do ADN resultou em fragmentos que são demasiado pequenos para ser detected sobre os restos de gel de agarose. Mesmo que tal erro sistemático afetaria todas as amostras igualmente, de novas experiências (por exemplo, o tratamento de células cultivadas com um pró-oxidante radiomarcada 10) poderiam ser realizados para excluir totalmente essa possibilidade.

Ao contrário das soluções padrão, o ADN digerido, quer a partir de células ou tecidos isolados do rato, produziu vários picos adicionais (Figura 6A e 6B). Estes foram afastadas dos picos 8-oxo-dGuo e dGuo, mas spiking experiências como uma parte de exercícios de validação descritas na discussão são necessários para examinar se picos adicionais (isto é, amostra de impurezas devido a efeitos de matriz, por exemplo) interferir com quantificação . O dGuo-8-oxo pico foi confirmada por correspondência com o tempo de retenção com o padrão; e, além disso, aumentar na dGuo-8-oxo pico para as amostras de células ou animais que foram submetidos a tratamento pró-oxidante (Figura 7). Pro-oxidante KBrO 3 participa na abstracção de um electrão a partir de guanina, que leva à formação de 8-oxo-dGuo 17. É digno de nota que, na ausência da tensão de pró-oxidante, 2,4 moléculas de 8-oxo-dGuo por 10 7 dGuo foram detectados em células A549 (Figura 7A). Isto é comparável a 4,5 moléculas de 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo detectados em células A549 observado utilizando uma alternativa, a abordagem à base de espectrometria de massa concebido para resolver potenciais deficiências do método de HPLC-ED 9. DBC tratamento (ou seja, diário de 20,0 mg DBC / kg de peso corporal por dia durante três dias) aumentou níveis dGuo-8-oxo no ADN do rato baço. Este é também um resultado esperado, uma vez que é conhecido por ROS ser produzido durante o metabolismo de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos in vivo 8. Os níveis relativos de 8-oxo-dGuo do baço de animais não esforçados foram 8,3-9,4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (Figura 7B), o que está em excelente agreement com os valores publicados de quatro moléculas de 8-oxo-dg / 10 6 dGuo medidos em células esplénicas de murideo sob condições normalizadas por HPLC ED-18. As Figuras 6 e 7 mostram que os níveis de 8-oxo-dGuo acima da linha de base são muito pequenas . Assim, se o DNA é oxidado a níveis mais baixos do que o observado aqui, os níveis de 8-oxo-dGuo pode ser indistinguível da linha de base, o qual deve ser mantido em mente por utilizadores potenciais do protocolo.

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Figura 1. Estrutura de 8-oxo-dGuo e o seu tautómero 8-OH-dGuo. Note-se que 8-oxo-dGuo em vez de 8-OH-dGuo é o principal tautómero a pH 7,4.

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Figura 2. Os tempos de retenção para dGuo (A) e 8-oxo-dGuo (B). CLER-ED Os cromatogramas foram obtidos a partir de uma injecção de 10,0 ul de uma das dGuo, (1,0 nmol total) ou 8-oxo-dGuo (1000 fmol no total) e detectada a 0,9 V (A) ou 0,5 V (B). O pico de retenção para dGuo foi de aproximadamente 4,7 min (A) e que, para 8-oxo-dGuo era de aproximadamente 6,4 min, (B). O pico largo a 2-3 minutos é provavelmente causada por distúrbios de injecção e não é afectada (isto é, sempre presente na intensidade semelhante) pela concentração de 8-oxo dGuo. (C) cromatogramas sobrepostos de duas injecções separadas descritos em (A) e (B) detectado por UV (260 nm). Os padrões foram executados no mesmo dia, usando condições de execução idênticas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. tensão do detector Optimizing. (A) o voltamograma de dGuo (concentração final de 1 nmol) detectado por análise de CLER-ED na faixa de 0,7-1,1 V. (B) o voltamograma de 8-oxo-dGuo (concentração final de 500 fmol) detectado por análise de HPLC-ED na faixa de 0,3-0,7 V. Meios de três experiências independentes (N = 3) ± desvio padrão mostrado. Em alguns casos, as barras de erro são mais pequenos do que os símbolos o corte.

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Figura 4. Curva padrão para dGuo (A) e 8-oxo-dGuo (B). Dez microlitros de qualquer dGuo ou 8-oxo-dGuo foi injectado e medidos por CLER-ED a 0,9 V (A) ou 0,6 V (B ). Meio de três experimentos independentes (N = 3) ± desvio padrão mostrado. Em alguns casos, as barras de erro são smaller do que os símbolos de plotagem.

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Figura 5. Optimização de digestão de ADN. (A) Oitenta por micrograma de ADN de testículos de salmão foi digerido tal como descrito em 8 de Tris-HCl, tampão de glicina-etilo (esquerda) ou tampão de fosfato de sódio (à direita). Electroforese em gel de agarose (1,0%) foi operado a 150 V durante 45 min. Pista 1 e 8: escada de ADN; pistas 2, 4 e 6: DNA não digerido; pistas 3, 5 e 7: ADN digerido; colunas 9, 11 e 13: DNA não digerido (tampão fosfato); As pistas 10, 12, e 14:. DNA digerido (tampão de fosfato) (B) de ADN de testículos de salmão (80 ug) foi digerido aqui por incubação com ADNase I, PDE I, e AP para 0,5-2,5 por cada passo h, em 50 tampão fosfato mM contendo cloreto de magnésio e o DFO. Cinquenta microlitros de cada amostra, contendo 7,3 ug de ADN digerido, foi analisada por HPLC (isto é, 0,9 V e 1 ml / min flow) para detectar dGuo. Figura mostra meio de três experimentos independentes (N = 3) ± erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. Os cromatogramas de 8-oxo-dGuo detecção em células em cultura (A) ou tecido animal (B). (A) ADN digerido a partir de células A549, tratados ou não tratados com KBrO 3. (B) O ADN digerido a partir do baço de DBC camundongos tenha sido tratada com. Peaks deslocado para a esquerda devido à remoção da coluna (devido ao acúmulo de pressão no aparelho, a sua posição foi confirmada com as normas). Padrões e amostras foram executados no mesmo dia usando condição de execução idênticoss e 10 ml de injecção volumes, na taxa de fluxo de 1 ml / min e 0,5 e de 0,9 V para dGuo e 8-oxo-dGuo, respectivamente. Por favor clique aqui para uma versão maior do painel A; aqui para o painel B.

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Figura 7. A quantificação de 8-oxo-dGuo em amostras biológicas. Os picos foram integrados e em comparação com curvas padrão (ver Figura 2 Suplementar para mais detalhes), para se obter os níveis de 8-oxo-dGuo no DNA a partir de células A549, tratados com KBrO 3 ( A), ou os níveis de 8-oxo-dGuo no DNA a partir do baço de ratinhos tratados com DBC (B). Estrelas (*) indicam significância estatística (p <00,05, one-way análise de variância (ANOVA) (A), o teste t de Student (B)). Meios de três (A) ou cinco (B) experiências independentes ± erro padrão da média são mostrados. As amostras foram recolhidas 4 ou 24 horas após o tratamento de 3 dias.

Na fase móvel Tampão de fosfato de Na 50,0 mM, pH 6,2, contendo 6% de MeOH e 2,0 mM de KCl
Taxa de fluxo da fase móvel 1,0 mL / min
Tipo de coluna YMC-BASIC com sílica esférico ligado
O comprimento da coluna 15 centímetros
Diâmetro interno da coluna 3,5 milímetros
A temperatura da coluna 35 ° C
Temperatura do detector 29 ° C
Ajuste da tensão para 8-oxo-dGuo 0,5 V
Ajuste da tensão para dGuo 0,9 V
O volume de injecção 10,0 ml

Quadro 1. Parâmetros do instrumento para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo por CLER-ED.

nmoles 100 nM padrão, ul HPLC de fase móvel, ul Diluição, dobre
5 300 0 1
2.5 150 150 2
1 60 240 5
0,5 30 270 10
0,25 15 285 20
0,1 6 294 50

Tabela 2. </ Strong> Preparação da curva padrão para dGuo.

fmoles 250 nM padrão, ul HPLC de fase móvel, ul Diluição, dobre
2500 300 0 1
1000 120 180 2.5
500 150 150 5
250 150 150 10
100 120 180 25
50 150 150 50

Tabela 3. Preparação de curva padrão para 8-oxo-dGuo.

figure-results-8
Cear plementar Figura 1. Comparação do electroquímica (EC) e de detecção à base de UV de dGuo. curva padrão foi criado para a detecção dGuo por detecção electroquímica (CE) ou de detecção por UV (260 nm). As áreas de pico foram integrados para dGuo pico em aproximadamente 4,7 min por ambos os métodos. N = 3, significa ± desvio-padrão são mostrados.

figure-results-9
Figura Suplementar 2. Quantificação da dGuo da sua curva padrão. Um exemplo da utilização de curva padrão para determinar a concentração de dGuo é mostrado. (A) área de pico pode ser determinada por integração utilizando o software padrão. (B) Esta informação é usada para construir uma curva padrão, a fim de utilizar a equação da linha de calcular a concentração do analito na amostra desconhecida.52.697 / "target =" _ blank 52697fig9large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Apesar de 8-oxo-dGuo foi classificado como um biomarcador útil de oxidação do DNA, a sua quantificação confiável pode representar um desafio. Embora existam vários métodos publicados, há uma necessidade de uma visão abrangente, descritivo de protocolo para permitir que pesquisadores para implantar o método em seus laboratórios. Aqui apresentamos uma visão detalhada de um protocolo baseado em HPLC que irá permitir novos usuários para estabelecer um método eficaz para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo.

Três métodos principais que foram descritos para a quantificação de 8-oxo-dGuo. Estes incluem a enzima-linked immunosorbent assay (ELISA) baseados em kits comerciais 19, cromatografia / espectrometria de massa (MS) líquido métodos (por exemplo, como descrito em outro lugar 9 e métodos de HPLC-ED, como o que aqui descrito. Métodos ELISA podem sofrer de interferências com certos compostos em amostras biológicas 19. Em geral, os resultados obtidos utilizando Chromatographic técnicas são consideradas mais fiável para 8-oxo-dGuo quantificação, em comparação com os métodos baseados em ELISA 20. Na comparação dos métodos de HPLC de ED com os métodos baseados em MS, a vantagem de o primeiro é relativamente barato equipamento (isto é, cerca de uma ordem de grandeza menos dispendiosa do que o equipamento para os métodos baseados em MS). Além disso, HPLC-MS são superiores aos métodos HPLC-ED como o primeiro não são propensos a potenciais interferências com compostos eletroativos e fornecer medições quantitativas inequívocas, usando isótopos 21.

Têm sido levantadas preocupações em relação à utilização de métodos de extracção de fenol tradicionais para a extracção de ADN genómico a ser utilizado para 8-oxo-dGuo quantificação 22. Vários pesquisadores notaram que as condições associadas à extração fenol padrão pode apresentar oxidação indesejada dGuo aumentando assim os níveis basais 1,9. Para resolver este problema, celular e animaDNA genómico de L pode ser extraída e purificada utilizando um protocolo modificado DNAzol 22. DNAzol contém altas concentrações de tiocianato de guanidina, e estudos anteriores 9 notaram menor nível basal formação 8-oxo-dGuo DNAzol quando é usado em relação ao fenol tradicional e métodos de extracção à base de Nal. O composto quelante de ferro DFO foi usada para minimizar a produção de ROS e oxidação do DNA durante a preparação da amostra. Como referido acima, os níveis de 8-oxo-dGuo em células A549 não esforçados (Figura 7A) eram altamente semelhantes ao que foi medido por um método baseado no MS 13. Isto sugere que a incorporação de precauções descritas para os métodos baseados em MS 13 permitido minimização da oxidação do DNA indesejável durante a preparação e análise da amostra para alcançar precisa quantificação 8-oxo-dGuo por CLER-ED. Calendário de células de cultura de necropsia ou de captura após o tratamento pró-oxidante pode ser um outro fator importante, como pode ser visto aqui por 8-oxo-dGuo níveis em quedano baço em 24 hr contra 4 h após o último tratamento (Figura 7B). Isto pode ser devido à activação da reparação de excisão de bases para eliminar danos no ADN.

As duas limitações óbvias do método descrito são as seguintes: (1) o requisito, em vez de grandes quantidades de ADN (cerca de 80 ^ g por amostra para se atingir três repetições técnicas), e (2) a possibilidade de interferências a partir de compostos co-eluição. Verificou-se que apenas uma muito pequena (ou seja, cerca de 15 mg) pedaço de baço (cerca de 15% do peso total de tecido) era suficiente para se obter 80 ^ g de ADN, deixando uma quantidade suficiente de tecido para a outra (por exemplo, a expressão do gene) analisa. A quantidade de ADN extraído é um outro parâmetro importante que afecta a oxidação do ADN artefatual 23,24,25. Portanto, trabalhar com bastante grande (~ 80 mg / amostra) que sugerimos aqui é consistente com as recomendações anteriores do uso de> 30 mg para minimizar a oxidação do DNA artifactual 25.Para os tecidos de menor dimensão (por exemplo, no hipocampo), pode-se reduzir proporcionalmente o protocolo para iniciar com 20-30 ug de ADN, uma vez que este deve ser suficiente para 2-3 é executado. Maiores quantidades de DNA, o que presumivelmente facilitar a resolução de picos acima do ruído de fundo, mas esta continua a ser verificada experimentalmente A presença de substâncias potencialmente interferentes que podem ser endereçadas, numa base caso-a-caso, e é essencial incluir sempre amostra de ADN a partir de in vitro simultânea ou em tratamentos in vivo com um controlo positivo que é conhecido por induzir lesões oxidativas do ADN (ver Figura 7).

Embora o fosfato em tampões de fosfato foi reportado para reduzir a actividade da fosfatase alcalina, as experiências de optimização método (Figura 5) confirmaram que o tampão de fosfato pode ser facilmente utilizado. Desde tampão fosfato está contido na fase móvel, a sua utilização na preparação de amostras de ruído reduzido detector devido ao soldesabafar mistura. , A composição do tampão, a extracção do ADN e digestão Assim tensão foram optimizadas e controlos positivos foram incluídos. Além disso, um resumo descrevendo como essas variáveis ​​podem ser optimizadas por laboratórios individuais é fornecido. O nosso objectivo era produzir um método que poderia ser útil para laboratórios especializados destinados a desenvolver um ensaio para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo.

No entanto, notamos que é necessária a validação formal do método, conforme descrito sob os passos validações recomendadas pela Conferência Internacional sobre Harmonização dos Requisitos Técnicos para o Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) para validação de procedimentos analíticos (ou seja, ICH Q2 ( R1) 26). Resumidamente, os elementos de validação deve examinar quantitativa do ensaio: 1) precisão (que pode ser conseguido através da inclusão de amostras com diferentes quantidades de 8-oxo-l-dGuo cravado no; 2) e gama de linearidade (resposta linear dentro da extconcentração do analito ended; 3) precisão (repetibilidade e reprodutibilidade); 4) O limite de detecção (em geral, o ponto em que a relação sinal-ruído é maior ou igual 2-3; isto pode ser dependente da matriz); 5) O limite de quantificação (concentração à qual a resposta satisfaz alguns níveis pré-determinados, tais como 2 x desvio padrão de controle, e poderá ser dependente de matriz); 6) selectividade / especificidade (capacidade de detectar o analito em amostras complexas contra soluções puras); 7) reprodutibilidade (a capacidade de obter o mesmo resultado em laboratórios diferentes, com operadores diferentes); e 8) robustez e adequação do sistema. Dado que o objectivo da validação recomendado pelo ICH é demonstrar que é "adequado para as suas finalidades pretendidas" e muitos laboratórios provavelmente terá efeitos diferentes, os potenciais utilizadores deste ensaio terá de validar esta, na medida considerada necessária. Quantificação precisa de 8-oxo-dGuo é desejável em toxicologia e medicina molecular pecadoce ele pode melhorar a compreensão do estresse oxidativo como, e mais especificamente oxidação do DNA, é mecanicamente e empiricamente associados a efeitos adversos para a saúde.

Divulgações

Nenhum conflito de interesses ou interesses financeiros concorrentes declarados.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Canadá Health Initiative Genomics Research e Desenvolvimento (GRDI) ea Estratégia Regulatória Canadense de Biotecnologia (RCSB). Os autores não têm qualquer conflito de interesses.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
8-oxo-dGuo padrãoCayman Chemical Company89320Inapropriadamente referido como "8-hidroxi-2'-desoxi Guanosina"; consulte Fig. 1 e texto para obter detalhes.
Fosfatase alcalinaSigma-AldrichP5931De E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901Quelatos metais pesados
Mesilato de desferoxaminaSigma-AldrichD9533
dGuo padrãoSigma-AldrichD7145
Fosfato de sódio dibásicoSigma-AldrichS9390
DNA de esperma de salmãoSigma-AldrichD1626Sal de sódio
DNase ISigma-AldrichD4527Tipo II, de pâncreas bovino
DNAzolInvitrogen10503-27
Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado (EDTA)Sigma-AldrichE4884O composto não se dissolveria completamente até que o pH da solução fosse ajustado para 8,0 (por exemplo com NaOH)
F12-K meioATCC30-2004
Soro bovino fetalATCC30-2020
Coluna de guardaEspecialidades cromatográficasYBA 99S03 0204GCProtege o cólum da contaminação; também pode levar ao acúmulo de pressão
Cloreto de magnésioSigma-AldrichM8266
Fosfatode sódio monobásicoSigma-AldrichS9638
Penicilina-EstreptomicinaInvitrogen15140-122
Solução salina tamponada com fosfatoInvitrogen15190-250
Enzima fosfodiesterase I Sigma-AldrichP3243Tipo II de Crotalus adamaneus veneno
Homogeneizador de teflonThomas Scientific7724T-1 ou 7724T-5 para 1 ou 5 mL, respectivamenteO volume (capacidade de retenção) depende da quantidade de amostra a ser processada.
Coluna de TrypsinInvitrogen15050-065
YMC-BASIC com asespecialidades cromatográficasYBA 99S03 1546WT
do silicone esférico ligado

Referências

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