Este protocolo detalha um método para isolar vesículas extracelulares (SVE), pequenas partículas membranoso liberados a partir de células, a partir de tão pouco como 10 amostras de soro ul. Esta abordagem evita a necessidade de ultracentrifugação, exige apenas alguns minutos de tempo de ensaio, e permite o isolamento de VE a partir de amostras de volumes limitados.
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Artigo de método
Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vesículas extracelulares (SVE), partículas membranoso liberados a partir de vários tipos de células, realizar um grande potencial para aplicações clínicas. Eles contêm ácido nucleico e proteína de carga e são cada vez mais reconhecido como um meio de comunicação intercelular utilizado por ambos eucariota e células procarióticas. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho, os protocolos para o isolamento de veículos eléctricos são muitas vezes moroso, complicado e requer grandes volumes de amostra e equipamento caro, tal como uma ultracentrífuga. Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos uma plataforma de imunoafinidade baseado em papel para separar subgrupos de EVs que é fácil, eficiente e requer volumes de amostra tão baixas como 10 jul. As amostras biológicas podem ser pipetados directamente para zonas de teste de papel que tenham sido quimicamente modificados com moléculas de captura que têm uma afinidade elevada para marcadores de superfície específicos EV. Immunosorben ligado a enzima Nós validar o ensaio por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), com base em papelensaios t (P-ELISA), e análise de transcriptoma. Estes dispositivos baseados em papel permitirá o estudo de EVs na clínica e no ambiente de pesquisa para ajudar a avançar a nossa compreensão das funções EV na saúde e na doença.
Introdução
As vesículas extracelulares (EVs) são partículas membranosas heterogêneas que variam em tamanho de 40 nm a 5.000 nm e são liberadas ativamente por muitos tipos de células por meio de diferentes rotas de biogênese1-9. Eles contêm subconjuntos únicos e selecionados de DNA, RNA, proteínas e marcadores de superfície de células parentais. Seu envolvimento em uma variedade de processos celulares, como comunicação intercelular10, modulação da imunidade11, angiogênese12, metástase12, quimiorresistência13 e desenvolvimento de doenças oculares9, é cada vez mais reconhecido e tem estimulado um grande in....
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Protocolo
Um diagrama geral do procedimento de operação é fornecida na Figura 1. Usando as práticas éticas, foram coletadas amostras de sangue de indivíduos saudáveis, e obteve amostras de humor aquoso de pacientes através do Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sob IRB aprovou protocolos ( IRB TCVGH No. CF11213-1).
1. fabricação de dispositivos de papel
- Cortar papel de cromatografia em círculos de 5 mm de diâmetro para fornecer o mesmo layout como uma microplaca de 96 poços. Sanduíche estas peças de papel com duas folhas de poliestireno com registada furos de passagem, e laminado.
- Modificar dispositivos de ....
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Resultados
A capacidade do dispositivo de papel para isolar subconjuntos de veículos eléctricos assenta de forma eficiente mediante o reconhecimento sensível e específico de marcadores de superfície EV. A modificação das fibras de papel estável com moléculas de captura é conseguido usando a química da avidina-biotina, conforme descrito noutro local 28-30. A eficácia de conjugação química e que o método de fisiossorção é avaliada utilizando leituras baseados em fluorescência. As zonas de teste de papel são preparados seg.......
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Discussão
Os passos mais críticos para o isolamento bem sucedido de subgrupos de vesículas extracelulares são: 1) uma boa escolha de papel; 2) uma cobertura estável e elevada de moléculas de captura na superfície das fibras de papel; 3) manuseio adequado de amostras; e 4) práticas de higiene geral de laboratório.
Os materiais porosos têm sido utilizados em muitos ensaios de baixo custo e sem equipamento. Eles podem ter o tamanho de poro sintonizável, funcionalidade versátil, baixo custo e alta relação.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte pelo Conselho Nacional de Ciência Taiwan grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) e NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), e do Veterans General Hospitais e University System of Taiwan Programa Comum de Investigação (CC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Papel para Cromatografia | GE Healthcare Life Sciences | 3001-861 | Whatman® Papel de celulose grau 1 |
| (3-mercaptopropil) trimetoxissilano | Sigma Aldrich | 175617 | Este produto químico reage com água e umidade e deve ser aplicado dentro de um saco de luvas cheio de nitrogênio. Evite o contato com os olhos e a pele. Não respire vapores nem inale vapores. |
| Etanol | Fisher Scientific | BP2818 | Absoluto, 200 Provas, grau de biologia molecular |
| Albumina de soro bovino (BSA) | BioShop Canada Inc. | ALB001 | Muitas vezes referido como fração de Cohn V. |
| N-γ-éster de succinimida maleimidobutiriloxi (GMBS) | Pierce Biotechnology | 22309 | GMBS é um reticulador amina-sulfidrila. O GMBS é sensível à umidade. |
| Avidin | Pierce Biotechnology | 31000 | NeutrAvidin tem 4 locais de ligação para a biotina e seu valor de pI é 6,3, que é mais neutro do que a avidina nativa Biotinilated |
| mouse anti-humano anti-CD63 | Ancell | 215-030 | clone AHN16.1/46-4-5 |
| anexina biotinilada V | BD Biosciences | 556418 | Annxin V tem uma alta afinidade pela fosfatidilserina (PS) |
| Primário anti-CD9 e secundário anticorpo | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | O anticorpo secundário é conjugado com peroxidação de rábano Tubos de |
| separação de soro | BD Biosciences | 367991 | Ativador de coágulo e gel para separação de soro |
| Tampão de ligação de anexina V | BD Biosciences | 556454 | 10x; diluir para 1x antes do uso. |
| Conjunto de reagentes de substrato TMB | BD Biosciences | 555214 | O conjunto contém peróxido de hidrogênio e 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) |
| [header] | |||
| Kit de isolamento de RNA | Life Technologies | AM1560 | MirVana Kit de isolamento |
| de RNA à base de polivinilpirrolidona auxiliar de isolamento de RNA Life | Technologies | AM9690 | O auxiliar de isolamento de RNA vegetal contém polivinilpirrolidona (PVP) que se liga a polissacarídeos. |
| Kit de limpeza de RNA | Qiagen Inc. | 74004 | é projetado para purificação de até 45 μ g RNA. |
| Câmara de plasma | March Instruments | PX-250 | |
| Microscópio eletrônico de varredura | Hitachi Ltd. | Scanner de mesa S-4300 | |
| Hewlett-Packard Company | Photosmart B110 | Imagens coloridas de 8 bits foram capturadas. Câmeras e smartphones também podem ser usados. | |
| Sistema de gravação de imagem | J& H Technology Co | GeneSys G:BOX Chemi-XX8 | imagens de fluroscência de 16 bits foram capturadas. Microscópios de fluroscência também podem ser usados. |
Referências
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages....
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Reimpressões e permissões
