Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

Summary

Este protocolo detalha um método para isolar vesículas extracelulares (SVE), pequenas partículas membranoso liberados a partir de células, a partir de tão pouco como 10 amostras de soro ul. Esta abordagem evita a necessidade de ultracentrifugação, exige apenas alguns minutos de tempo de ensaio, e permite o isolamento de VE a partir de amostras de volumes limitados.

Abstract

Vesículas extracelulares (SVE), partículas membranoso liberados a partir de vários tipos de células, realizar um grande potencial para aplicações clínicas. Eles contêm ácido nucleico e proteína de carga e são cada vez mais reconhecido como um meio de comunicação intercelular utilizado por ambos eucariota e células procarióticas. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho, os protocolos para o isolamento de veículos eléctricos são muitas vezes moroso, complicado e requer grandes volumes de amostra e equipamento caro, tal como uma ultracentrífuga. Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos uma plataforma de imunoafinidade baseado em papel para separar subgrupos de EVs que é fácil, eficiente e requer volumes de amostra tão baixas como 10 jul. As amostras biológicas podem ser pipetados directamente para zonas de teste de papel que tenham sido quimicamente modificados com moléculas de captura que têm uma afinidade elevada para marcadores de superfície específicos EV. Immunosorben ligado a enzima Nós validar o ensaio por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), com base em papelensaios t (P-ELISA), e análise de transcriptoma. Estes dispositivos baseados em papel permitirá o estudo de EVs na clínica e no ambiente de pesquisa para ajudar a avançar a nossa compreensão das funções EV na saúde e na doença.

Introduction

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas membranosas heterogêneas que variam em tamanho de 40 nm a 5.000 nm e são liberadas ativamente por muitos tipos de células por meio de diferentes rotas de biogênese^1-9. Eles contêm subconjuntos únicos e selecionados de DNA, RNA, proteínas e marcadores de superfície de células parentais. Seu envolvimento em uma variedade de processos celulares, como comunicação intercelular¹⁰, modulação da imunidade¹¹, angiogênese¹², metástase¹², quimiorresistência¹³ e desenvolvimento de doenças oculares⁹, é cada vez mais reconhecido e tem estimulado um grande interesse em sua utilidade em aplicações diagnósticas, prognósticas, terapêuticas e de biologia básica.

EVs podem ser classicamente categorizados como exossomos, microvesículas, corpos apoptóticos, oncossomos, ectossomos, micropartículas, telerossomos, prostatossomos, cardiossomos e vexossomos, etc., com base em sua biogênese ou origem celular. Por exemplo, os exossomos são formados em corpos multivesiculares, enquanto as microvesículas são geradas por brotamento diretamente da membrana plasmática e as vesículas apoptóticas são de células apoptóticas ou necróticas. No entanto, a nomenclatura ainda está sendo refinada, em parte devido à falta de compreensão e caracterização completas dos EVs. Vários métodos foram desenvolvidos para purificar EVs, incluindo ultracentrifugação¹⁴, ultrafiltração¹⁵, esferas magnéticas¹⁶, precipitação polimérica^17-19 e técnicas microfluídicas^20-22. O procedimento mais comum para purificar EVs envolve uma série de centrifugações e/ou filtração para remover grandes detritos e outros contaminantes celulares, seguida por uma ultracentrifugação final de alta velocidade, um processo caro, tedioso e inespecífico^14,23,24. Infelizmente, a necessidade tecnológica de isolamento rápido e confiável de EVs com pureza e eficiência satisfatórias ainda não foi atendida.

Desenvolvemos um dispositivo de imunoafinidade baseado em papel que fornece uma maneira simples, que economiza tempo e custo, mas eficiente, de isolar e caracterizar subgrupos de EVs²². O papel de celulose cortado em uma forma definida pode ser organizado e laminado usando duas folhas de plástico com orifícios registrados. Em contraste com a estratégia geral de definir o limite do fluido em dispositivos baseados em papel imprimindo cera hidrofóbica ou polímeros^25-27, esses padrões de papel laminado são resistentes a muitos líquidos orgânicos, incluindo etanol. As zonas de teste de papel são quimicamente modificadas para fornecer cobertura estável e densa de moléculas de captura (por exemplo, anticorpos específicos do alvo) que têm alta afinidade com marcadores de superfície específicos em subgrupos EV. As amostras biológicas podem ser pipetadas diretamente nas zonas de teste de papel e os EVs purificados são retidos após as etapas de enxágue. A caracterização de EVs isolados pode ser realizada por MEV, ELISA e análise transcriptômica.

Protocol

Um diagrama geral do procedimento de operação é fornecida na Figura 1. Usando as práticas éticas, foram coletadas amostras de sangue de indivíduos saudáveis, e obteve amostras de humor aquoso de pacientes através do Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sob IRB aprovou protocolos ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. fabricação de dispositivos de papel

1. Cortar papel de cromatografia em círculos de 5 mm de diâmetro para fornecer o mesmo layout como uma microplaca de 96 poços. Sanduíche estas peças de papel com duas folhas de poliestireno com registada furos de passagem, e laminado.
2. Modificar dispositivos de papel, utilizando o método de conjugação química descrita nas etapas seguintes ^28.
   1. Tratar de papel com dispositivos de plasma de oxigénio (100 mW, 1% de oxigénio, 30 seg) em uma câmara de plasma.
      ATENÇÃO: cuidado especial deve ser tomado quando se trabalha com trimetoxissilano 3-mercaptopropil e N -γ-maleimidobutiriloxi suecinimidaéster (GMBS), uma vez que ambos são sensíveis à humidade e tóxico. Usar luvas de protecção e evitar a inalação ou contato com a pele e os olhos. Mantenha o frasco bem fechado estoque e permitir que atinjam a temperatura ambiente antes de abrir para evitar a condensação de água. Como alternativa, abra a garrafa de dentro de um saco de luva cheia de azoto ou caixa. Alíquota em pequenos frascos para evitar a abertura freqüente da garrafa estoque.
   2. Imediatamente incubar tratada dispositivos de papel em um (v / v) solução de 4% de 3-mercaptopropil trimetoxi silano, em etanol (200 proof) durante 30 min.
   3. Lavar dispositivos de papel com etanol e incubar com 0,01 umol / ml GMBS em etanol durante 15 min.
   4. Lavar com etanol (200 proof) e incubar dispositivos de papel com 10 ug / ml de avidina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 hora a 4 ° C. Armazenar a 4 ° C, se necessário, e usar dentro de 4 semanas.
3. Molhar cada zona de ensaio de papel com 10 ul de PBS contendo 1% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) Por 3 × 10 min antes de manchar 10 jul biotinilado moléculas de captura por 3 × 10 min. Utilizam anti-CD63 anticorpo (20 ug / ml em PBS contendo 1% (w / v) de BSA e 0,09% (w / v) de azida de sódio) ou anexina V (1:20, v / v em tampão de ligação da anexina V) como moléculas de captura.
4. Enxaguar anticorpo ou anexina V moléculas anti-CD63 não ligados utilizando 10 ul correspondente PBS contendo 1% (w / v) de BSA ou anexina V soluções tampão de ligação para 3 x 1 min, respectivamente.

2. Serum e Aqueous Humor Coleta e Processamento

1. Recolha de soro.
   1. Colete 10 ml de sangue periférico por punção venosa em tubos de separação de soro e inverter cuidadosamente o tubo de cinco vezes. Defina o tubo na posição vertical e aguarde 30 min.
   2. Centrifugar a 1.200 x g durante 15 min. Transferir o soro a partir da camada superior para um tubo limpo, e centrifuga-se novamente a 3000 × g durante 30 min.
   3. Passe o sobrenadante com um fil 0,8 mmter. Manter a amostra a -80 ° C até à sua utilização.
2. Coleção humor aquoso: coletar amostras de humor aquoso de pacientes diagnosticados por um oftalmologista diretamente através de procedimentos e armazenar amostras invasiva a -80 ° C até o uso.

3. Isolamento de Extracelular Vesículas

1. Amostras pontuais em cada zona de teste de papel a uma taxa de 5 mL / min.
2. Enxaguar os VE não ligados com 10 ul correspondentes PBS contendo 1% (w / v) BSA a ligação de anexina V ou soluções tampão para 3 x 1 min para dispositivos papel funcionalizados com anti-CD63 ou anticorpos anexina V moléculas, respectivamente. Execute as seguintes ensaios a jusante.

4. jusante Ensaio Exemplo 1: eletromicrografias de digitalização

1. Corrigir EVs capturadas em funcionalizado zona de teste de papel utilizando 10 mL de 0,5 × fixador de Karnovsky para 10 min.
2. Lavar as amostras com amplo PBS por 2 × 5 min.
3. Desidratar oamostras com subsequente etanol 35% durante 10 min, de etanol a 50% durante 2 x 10 min, etanol a 70% durante 2 x 10 min, etanol a 95% durante 2 × 10 minutos, e 100% de etanol durante 4 x 10 min.
4. Critical seco e por pulverização catódica revestir as amostras com paládio / ouro, e examinar utilizando um microscópio eletrônico de varredura operado em baixa tensão de aceleração de elétrons (~ 5 kV).

5. Downstream Ensaio Exemplo 2: ELISA baseado no Livro

1. Adicionar uma solução contendo 5 uL de anti-CD9 anticorpo primário a 1: 1000 em PBS a cada zona de ensaio contendo VE capturados. Espere 1 min.
2. Lavar as amostras com 30 ml de PBS foram agitados a 100 rpm durante 30 segundos.
3. Adicionar 5 uL de uma solução contendo peroxidase de rábano (HRP) -ligada anticorpo secundário em 1: 1000 em PBS e esperar 1 min.
4. Lavar as amostras com 30 ml de PBS foram agitados a 100 rpm durante 30 segundos.
5. Adicionar um substrato colorimétrico 5 ul contendo 1: 1 razão em volume de peróxido de hidrogénio umad 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e digitalizar utilizando um scanner de mesa.

6. Ensaio jusante Exemplo 3: Isolamento de ARN

1. Mergulhar as amostras em 35 uL de auxílio de isolamento de ARN baseada em polivinilpirrolidona e 265 ul de lise / tampão de ligação para lisar os VE capturados. Vortex vigorosamente.
2. Adicionar 30 ul de homogenato fornecido no kit de isolamento ao lisado. Vortex vigorosamente e colocar em gelo durante 10 min.
3. Extrai-se o ARN utilizando a separação do ácido fenol-clorofórmio descrito nas etapas seguintes.
   1. Tome 330 ul de fenol-clorofórmio a partir da camada do fundo do frasco e adiciona-se ao homogeneizado / lisado. Vortex vigorosamente.
   2. Centrifuga-se a 10000 xg durante 5 min. Transferir a fase aquosa (superior) para um tubo limpo e anotar o volume removido.
4. Precipitar o ARN total com etanol a 100% do volume que é 1,25 vezes o volume da fase aquosa removida na etapa anterior e collect o ARN na solução de eluição pré-aquecido a 95 ° C.
5. Concentrar e purificar o ARN utilizando um kit de limpeza de ARN de acordo com o protocolo do fabricante.

Results

A capacidade do dispositivo de papel para isolar subconjuntos de veículos eléctricos assenta de forma eficiente mediante o reconhecimento sensível e específico de marcadores de superfície EV. A modificação das fibras de papel estável com moléculas de captura é conseguido usando a química da avidina-biotina, conforme descrito noutro local ^28-30. A eficácia de conjugação química e que o método de fisiossorção é avaliada utilizando leituras baseados em fluorescência. As zonas de teste de papel são preparados seg...

Discussion

Os passos mais críticos para o isolamento bem sucedido de subgrupos de vesículas extracelulares são: 1) uma boa escolha de papel; 2) uma cobertura estável e elevada de moléculas de captura na superfície das fibras de papel; 3) manuseio adequado de amostras; e 4) práticas de higiene geral de laboratório.

Os materiais porosos têm sido utilizados em muitos ensaios de baixo custo e sem equipamento. Eles podem ter o tamanho de poro sintonizável, funcionalidade versátil, baixo custo e alta relação...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Papel para Cromatografia	GE Healthcare Life Sciences	3001-861	Whatman® Papel de celulose grau 1
(3-mercaptopropil) trimetoxissilano	Sigma Aldrich	175617	Este produto químico reage com água e umidade e deve ser aplicado dentro de um saco de luvas cheio de nitrogênio. Evite o contato com os olhos e a pele. Não respire vapores nem inale vapores.
Etanol	Fisher Scientific	BP2818	Absoluto, 200 Provas, grau de biologia molecular
Albumina de soro bovino (BSA)	BioShop Canada Inc.	ALB001	Muitas vezes referido como fração de Cohn V.
N-γ-éster de succinimida maleimidobutiriloxi (GMBS)	Pierce Biotechnology	22309	GMBS é um reticulador amina-sulfidrila. O GMBS é sensível à umidade.
Avidin	Pierce Biotechnology	31000	NeutrAvidin tem 4 locais de ligação para a biotina e seu valor de pI é 6,3, que é mais neutro do que a avidina nativa Biotinilated
mouse anti-humano anti-CD63	Ancell	215-030	clone AHN16.1/46-4-5
anexina biotinilada V	BD Biosciences	556418	Annxin V tem uma alta afinidade pela fosfatidilserina (PS)
Primário anti-CD9 e secundário anticorpo	System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	O anticorpo secundário é conjugado com peroxidação de rábano Tubos de
separação de soro	BD Biosciences	367991	Ativador de coágulo e gel para separação de soro
Tampão de ligação de anexina V	BD Biosciences	556454	10x; diluir para 1x antes do uso.
Conjunto de reagentes de substrato TMB	BD Biosciences	555214	O conjunto contém peróxido de hidrogênio e 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)
[header]
Kit de isolamento de RNA	Life Technologies	AM1560	MirVana Kit de isolamento
de RNA à base de polivinilpirrolidona auxiliar de isolamento de RNA Life	Technologies	AM9690	O auxiliar de isolamento de RNA vegetal contém polivinilpirrolidona (PVP) que se liga a polissacarídeos.
Kit de limpeza de RNA	Qiagen Inc.	74004	é projetado para purificação de até 45  μ g RNA.
Câmara de plasma	March Instruments	PX-250
Microscópio eletrônico de varredura	Hitachi Ltd.	Scanner de mesa S-4300
	Hewlett-Packard Company	Photosmart B110	Imagens coloridas de 8 bits foram capturadas. Câmeras e smartphones também podem ser usados.
Sistema de gravação de imagem	J& H Technology Co	GeneSys G:BOX Chemi-XX8	imagens de fluroscência de 16 bits foram capturadas. Microscópios de fluroscência também podem ser usados.