Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Resumo

Desenvolvemos uma preparação quimérica genética do hipocampo ventral – circuito accumbens in vitro que permite imagens diretas ao vivo para analisar os mecanismos pré-sinápticos da transmissão sináptica mediada pelos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparação também fornece uma abordagem informativa para estudar os mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica.

Resumo

O aumento sustentado da sinalização axonal e o aumento da liberação de neurotransmissores pela ativação de receptores nicotínicos de acetilcolina pré-sinápticos (nAChRs) é um mecanismo importante para a neuromodulação pela acetilcolina (ACh). A dificuldade de acesso à sondagem dos mecanismos de sinalização dentro dos axônios intactos e nos terminais nervosos, tanto in vitro quanto in vivo, limitou o progresso no estudo dos componentes pré-sinápticos da plasticidade sináptica. Aqui, apresentamos uma preparação quimérica genética do circuito ventral hipocampo (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro que permite imagens diretas ao vivo para analisar os componentes pré e pós-sinápticos da transmissão, variando seletivamente o perfil genético dos neurônios pré vs pós-sinápticos. Demonstramos que as projeções de microfatias de vHipp, como entrada axonal pré-sináptica, formam sinapses glutamatérgicas múltiplas e confiáveis com alvos pós-sinápticos, os neurônios dispersos de nAcc. A localização pré-sináptica de vários subtipos de nAChRs é detectada e a transmissão sináptica mediada por sinalização nicotínica pré-sináptica é monitorada por registro eletrofisiológico simultâneo e imagens de células vivas. Esta preparação também fornece uma abordagem informativa para estudar os mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica glutamatérgica in vitro.

Introdução

Modulação do circuito colinérgico excitabilidade contribui para os aspectos fundamentais de cognição, e modulação colinérgica alterada é uma característica de distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricas incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e dependência ^1-4. Um mecanismo estabelecido de facilitação de transmissão sináptica colinérgica no sistema nervoso central é, por activação directa de nAChRs localizadas em locais pré-sinápticos. A activação destes receptores pré-sinápticos leva a um aumento de Ca2 ⁺ intracelular ([Ca ^2+] _i) nos terminais pré-sinápticos - tanto directamente, devido à relativamente elevada condutância de cálcio de certos subtipos de nAChR, e indirectamente, por cascatas de sinalização intracelular ^5, aumentando, assim, a libertação de neurotransmissores. De facto, a activação dos nAChRs pré-sinápticos tem sido associada com mudanças na libertação de uma grande variedade de neurotransmissores, incluindo glutamato, GABA, acetilcolina, umND dopamina ^6-10. Embora este processo tem sido estudada usando métodos electrofisiológicos indirectamente em diversas sinapses, indicadores ópticos de [Ca2 ^+] _i e a reciclagem das vesículas sinápticas permitir uma medição mais directa e temporalmente precisa dos fenómenos pré-sinápticos.

Localização pré-sináptica dos nAChRs foi demonstrada de forma convincente com rotulagem imuno-ouro direta de nAChRs na microscopia eletrônica (EM) nível ^11,12. Várias outras técnicas também têm sido utilizados para tratar a localização do nAChR indirectamente, incluindo a detecção de locais de nAChRs subunit- quimeras de proteína fluorescente em neurónios cultivados ^13,14, electrofisiológico gravação de correntes de nAChR em terminais sinápticos ^15,16, monitorização de nicotina induziu alterações na [Ca ^{2 +]} _i em terminais nervosos sinápticas por imagens ao vivo de células ¹⁷ e monitoramento indireto da liberação do neurotransmissor no terminal sináptico portécnicas de imagem de células vivas com indicadores fluorescentes, incluindo exocitose das vesículas sinápticas vistos por estirilo corantes anfip�icos FM (FM1-43 e FM4-64) e / ou synapto-pHluorin e por repórteres fluorescentes neurotransmissores específicos, como CNiFERs para ACh e iGluSnFr para glutamato ^18-20. No geral, essas abordagens atuais para identificar a localização pré-sináptica dos nAChRs são complicadas e exigem sistemas e técnicas especiais para permitir a identificação confiável e monitorização fisiológica da atividade pré-sináptica.

Aqui nós descrevemos protocolos e equipamentos para um sistema in vitro de co-cultura de um hipocampo ventral (vHipp) - núcleo accumbens (NACC) circuito que fornece acesso direto para identificar e analisar os dois componentes pré e pós-sinápticos de transmissão sináptica. Mostramos exemplos de localização pré-sináptica dos nAChRs ea imagens de células vivas de nAChR mediada sinalização de Ca2 ⁺ e liberação de neurotransmissores aloaxônios ng vHipp. Uma extensão natural (e direta) do protocolo apresentado aqui é a preparação de contatos pré e pós-sinápticos composta de neurônios de diferentes genótipos. Deste modo, a contribuição de um produto de gene em particular para o pré e / ou de mecanismos pós-sinápticos de modulação pode ser avaliada directamente.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publications No. 80-23, revisado 2012) e estudos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use para Comitês de Pesquisa em Stony Brook University (# 1618 e # 1792).

1. vHipp-NACC Synaptic Co-culturas

1. Camundongos Sacrifice (pós-natal dias 0-3, a partir do tipo selvagem (WT) ou nAChRs α7 linha de camundongo transgênico) com CO _2. Decapitar cada filhote e salvar a cauda em um tubo de 1,5 ml de centrífuga para post facto genotipagem. Execute as seguintes etapas em uma capa esterilizado.
2. Remover o topo do crânio com tesouras e pinças para expor todo o cérebro. Começando na junção onde os córtices cerebrais em parte, de um ao outro caudalmente, obter uma secção coronal que contém os córtices posteriores incluindo o vHipp ^5,21 sob um microscópio de dissecação.
3. Dissecar vHipp tiras de tecido contendo a região CA1-subículo de acordo com um desenvolvimento atlas de cérebro de ratinho ²² (Figura 1A). Transferir para um prato de cultura de 35 milímetros contendo meio de cultura frio (4 ° C), cortadas em pequenas fatias finas (cerca de 100 mm x 100 mm microslices).
4. Pré-incubar 12 milímetros poli-D-lisina / laminina revestidos por lamelas de vidro dentro de 24 placas de cultura de tecidos com meio de cultura (~ 500 mL) durante pelo menos 30 min no incubador a 37 ° C. Remova a mídia antes do plaqueamento microslices.
5. A placa com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo no centro da lamela com uma quantidade mínima de meio (~ 50 ul, contendo ~ 20 peças de microslices) para facilitar a fixação dos explantes. Placa microslices vHipp provenientes de um único animal (ou a + / + ou - / - genótipo da linha α7 transgênico) em cada lamela.
6. Após os explantes resolver sobre a lamela, adicione delicadamente mídia adicional (~ 100 mL) por the parede de modo que o nível dos meios de comunicação é alta o suficiente para cobrir completamente os explantes sobre a periferia, mas não os que estão no centro da lamela.
7. Depois de uma O / N de incubação em 37 ° C, 5% de _CO2, dispersar NACC neurónios embrionários do dia 18 ao dia pós-natal uma ratinhos WT e adicionar aos explantes.
   1. Dissecar tecidos NACC de acordo com um atlas do mouse cérebro em desenvolvimento ²⁰ (Figura 1B).
   2. Cortar em pequenos pedaços (cerca de 500 mm × 500 mm microslices) e transferir para um tubo de 15 ml.
   3. Trata-se com 0,25% de tripsina (2 ml) durante 15 min a 37 ° C. Lavar pedaços de tecido três vezes com meio de lavagem frio (5 ml, 4 ° C), seguido por uma lavagem em meio de cultura frio (5 ml, 4 ° C). Permitir suspensão para descansar por 5 minutos em cada etapa de lavagem e, em seguida despeje cuidadosamente o sobrenadante.
   4. Separar as células por trituração suave em 2 ml de meio de cultura com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo levemente.
   5. Transsuspensão de células fer para outro tubo de 15 ml e centrifugar a 2000 x rpm durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em meios de cultura em 1 ml por 6 filhotes. Dispersar as células com cuidado pipetando em mídia várias vezes com uma pipeta Pasteur polida-fogo.
   6. Adicionar 0,25 ml de células NACC dispersos para cada lamela com explantes vHipp.
   7. Manter as culturas numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de _CO2. Coloque placas de cultura de compressas de gaze estéril umedecido para estabilizar mecanicamente e manter a umidade, facilitando a formação de sinapses.

2. Immunocytochemistry

1. Fix culturas (5-7 dias in vitro) em paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose / PBS (~ 500 ul por lamela, 20 min, RT).
2. Permeabilizar as culturas com 0,25% de Triton X-100 / PBS (~ 500 ul por lamela, 5 min, RT).
3. Culturas em bloco com 10% de soro de burro normal em PBS (~ 500 mL por lamela, 30 min, RT) antes de Antibody coloração. Incubar com anticorpos primários o / n a 4 ° C. Use os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti- (nAChRs α ₄ -ECD 1: 500; anti-α ₅ subunidades, 1: 500), anti-vesicular transportador de glutamato 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
4. Lavar anticorpos primários com PBS (3 vezes / ~ 500 ul por lamela, 5 min) e depois incubar as culturas em anticorpos secundários conjugados com Alexa 488 (~ 500 mL por lamela, 1: 500) ou Alexa 594 (~ 500 mL por lamela , 1: 500) durante 1 hora a 37 ° C.
5. Incubar em culturas αBgTx conjugados com Alexa 594 (~ 500 mL por lamela, 1: 1000 em meio de cultura) durante 45 min a 37 ° C, antes da fixação para rotulagem superfície α7 * nAChRs.
6. Montagem e vedação lamelas.
7. Capturar imagens com um microscópio de fluorescência equipado com objectivos Plan-Apocromática (20X com 0,8 NA ou 63X de petróleo com 1,4 NA) e uma câmera CCD.

3. FM1-43 Based vesicular Fusão

1. Manter culturas (5-7 dias in vitro) em uma câmara de imagem, montar a câmara no disco giratório microscópio confocal. Continuamente perfundir (1 ml / min) com HBS cocktail à TA.
2. Parar de perfusão e de carga culturas com 10 uM FM1-43 em 56 mM de K ⁺ ACSF (~ 500 mL) durante 90 segundos (coloração), lavar corante externo afastado durante 15 min com Ca ²⁺ livre HBS contendo ADVASEP-7 (0,1 mM) para eliminar FM1-43 ligada à membrana.
3. Estimular as culturas com 56 mM de K ⁺ ACSF (~ 500 mL) sem FM1-43, durante 120 segundos (descoloração), recarregar as culturas com FM1-43 utilizando as mesmas condições, e lava-se novamente com o Ca2 ⁺ livre de HBS contendo ADVASEP-7 para 15 min.
4. Adquirir FM1-43 imagens de fluorescência com disco giratório microscópio confocal equipado com uma objectiva Plan-Apochromat (60X de água com 1,4 NA, excitação 488 nm, emissão 530 nm) e capturar imagens com uma câmera CCD.
5. Coletar imagens FM1-43 fluorescência de base (a cada 2 s por 1 min) Como o controlo de pré-nicotina; aplicam-se a nicotina (1 uM) por perfusão rápida (2 ml / min) durante 1 min, e em seguida lavar com nicotina para fora HBS coquetel. Mantenha lapso de tempo imagens de captura antes, durante e após a aplicação de nicotina cada 2 s por 5 min.
6. Quantificar FM1-43 intensidade de fluorescência antes (F _coloração) e depois (F _{descoloração)} aplicação de nicotina em cada bouton sináptica.
7. Calcular quantidade total de fluorescência FM1-43 libertado ao longo dos axónios vHipp pela quantificação da diferença de FM1-43 intensidade de fluorescência antes e após a aplicação de nicotina (Af = F _coloração -F _{descoloração).} Analisar fração de diminuição da intensidade de fluorescência após a nicotina com a seguinte equação: F _{diminuição%} = Af / F _coloração.

Imagem 4. Cálcio

1. Enxágüe culturas (5-7 dias in vitro) rapidamente com HBS normal, em seguida, carregar culturas com 5 Indicador de Fluo-4 Ca ²⁺ (Éster AM) e 0,02% de Pluronic F-127 em HBS (2 ml) durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. Lave a Fluo-4 com solução HBS (3 vezes / 5 min). Retorno culturas para incubadora (37 ° C / 5% de CO ₂₎ durante pelo menos 30 min.
3. Manter as culturas na mesma câmara de imagem e mesmas condições que as descritas na secção de fusão vesicular com base FM1-43 (veja o passo 3.1).
4. Coletar imagens Fluo-4 fluorescência de projeções axonais dos micro-fatias vHipp com um objectivo Plan-Apochromat (60X de água com 1,4 NA, excitação 488 nm, emissão 530 nm) e uma câmera CCD.
5. Recolha de linha de base de Fluo-4 imagens de fluorescência (a cada 10 segundos durante 2 minutos) como o controlo de pré-nicotina, nicotina aplica (1 uM) por perfusão rápida (2 ml / min) durante 1 min, e em seguida lavar com nicotina para fora HBS coquetel. Manter lapso de tempo de captura de imagens, antes, durante e após a aplicação da nicotina a cada 10 segundos durante 30 minutos.
6. Salve todas as molduras dos fluo-4 imagens de fluorescência-primas, a exportação como uma série deImagens em formato TIFF para posterior análise.
7. Recolha a intensidade integrada de fluo-4 fluorescência ao longo vHipp axónios antes e após a aplicação de nicotina.
8. Normalizar a intensidade de fluorescência integrada com a seguinte equação: Af / F ₀ = (FF ₀₎ / ₀ F, em que F representa a ₀ pré-nicotina intensidade de fluorescência integrada corrigida-fundo e F é a intensidade de fluorescência integrada ao longo dos axónios vHipp em cada ponto temporal após a aplicação de nicotina. Analisar e traçar normalizada intensidade de fluorescência integrada.

Resultados

A preparação utilizada consiste de gene quimérico co-culturas de circuitos vHipp-NACC in vitro. Projeções que emanam microslices vHipp, como entrada axonal pré-sináptico, pode fazer contatos sinápticos com metas pós-sinápticos, os neurônios dispersos de NACC. A nicotina induziu um (≥ 30 min) facilitação sustentado de transmissão glutamatérgica de neurônios NACC inervados por vHipp axônios sinalização ao longo vHipp axônios ⁵ via α7 pré-sináptica * nAChRs ²¹ e prolongada de cálcio.

Discussão

A preparação de co-cultura descrito re-circuitos do hipocampo ventral cede-accumbens in vitro. Esta análise permite preparação relativamente simples e de confiança dos perfis espaciais e temporais pelo qual a activação de nAChRs pré-sinápticos eliciar melhoradas transmissão glutamatérgica ^{5, 21.}

Co-culturas são definidos como o crescimento de diferentes tipos de células específicas em um prato que pode proporcionar condições fisiológicas in vitro para demonstrar ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Meio de Cultura (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Suplementos	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicilina-Estreptomicina	GIBCO	10908-010	0,5 ml
Suplemento GlutaMAX	GIBCO	35050-061	0,5 ml
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
2. meios de lavagem (HBSS, 100 ml)
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES (1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
3. HEPES tamponado com solução salina (HBS)    pH=7,3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,Sigma		C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glicose	Sigma	G0350500	10 mM
4. Coquetel HBS para imagens ao vivo pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,Sigma		C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glicose	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxina	Tocris	1078	2 µ M
bicuculline	Tocris	131	10 µ M
D-AP-5	Tocris	105	50 µ M
CNQX	Tocris	1045	20 µ M
LY341495	Tocris	1209	10 µ M
5. Sem cálcio HBS    pH=7,3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glicose	Sigma	G0350500	10 mM
6. 56 mM Potássio ACSF pH=7,4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1,3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2,5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26,2 mM
Glicose	Sigma	G0350500	10 mM