Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Resumo

Desenvolvemos uma preparação quimérica genética do hipocampo ventral – circuito accumbens in vitro que permite imagens diretas ao vivo para analisar os mecanismos pré-sinápticos da transmissão sináptica mediada pelos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparação também fornece uma abordagem informativa para estudar os mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica.

Resumo

O aumento sustentado da sinalização axonal e o aumento da liberação de neurotransmissores pela ativação de receptores nicotínicos de acetilcolina pré-sinápticos (nAChRs) é um mecanismo importante para a neuromodulação pela acetilcolina (ACh). A dificuldade de acesso à sondagem dos mecanismos de sinalização dentro dos axônios intactos e nos terminais nervosos, tanto in vitro quanto in vivo, limitou o progresso no estudo dos componentes pré-sinápticos da plasticidade sináptica. Aqui, apresentamos uma preparação quimérica genética do circuito ventral hipocampo (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro que permite imagens diretas ao vivo para analisar os componentes pré e pós-sinápticos da transmissão, variando seletivamente o perfil genético dos neurônios pré vs pós-sinápticos. Demonstramos que as projeções de microfatias de vHipp, como entrada axonal pré-sináptica, formam sinapses glutamatérgicas múltiplas e confiáveis com alvos pós-sinápticos, os neurônios dispersos de nAcc. A localização pré-sináptica de vários subtipos de nAChRs é detectada e a transmissão sináptica mediada por sinalização nicotínica pré-sináptica é monitorada por registro eletrofisiológico simultâneo e imagens de células vivas. Esta preparação também fornece uma abordagem informativa para estudar os mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica glutamatérgica in vitro.

Introdução

Modulação do circuito colinérgico excitabilidade contribui para os aspectos fundamentais de cognição, e modulação colinérgica alterada é uma característica de distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricas incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e dependência ^1-4. Um mecanismo estabelecido de facilitação de transmissão sináptica colinérgica no sistema nervoso central é, por activação directa de nAChRs localizadas em locais pré-sinápticos. A activação destes receptores pré-sinápticos leva a um aumento de Ca2 ⁺ intracelular ([Ca ^2+] _i) nos terminais pré-sinápticos - tanto directamente, devido à....

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publications No. 80-23, revisado 2012) e estudos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use para Comitês de Pesquisa em Stony Brook University (# 1618 e # 1792).

1. vHipp-NACC Synaptic Co-culturas

1. Camundongos Sacrifice (pós-natal dias 0-3, a partir do tipo selvagem (WT) ou nAChRs α7 linha de camundongo transgênico) com CO _2. Decapitar cada filhote e salvar a cauda em um tubo de 1,5 ml de centrífuga para post facto genotipagem. Execute as seguintes etapas ....

Resultados

A preparação utilizada consiste de gene quimérico co-culturas de circuitos vHipp-NACC in vitro. Projeções que emanam microslices vHipp, como entrada axonal pré-sináptico, pode fazer contatos sinápticos com metas pós-sinápticos, os neurônios dispersos de NACC. A nicotina induziu um (≥ 30 min) facilitação sustentado de transmissão glutamatérgica de neurônios NACC inervados por vHipp axônios sinalização ao longo vHipp axônios ⁵ via α7 pré-sináptica * nAChRs ²¹ e prolongada de cálcio.

Discussão

A preparação de co-cultura descrito re-circuitos do hipocampo ventral cede-accumbens in vitro. Esta análise permite preparação relativamente simples e de confiança dos perfis espaciais e temporais pelo qual a activação de nAChRs pré-sinápticos eliciar melhoradas transmissão glutamatérgica ^{5, 21.}

Co-culturas são definidos como o crescimento de diferentes tipos de células específicas em um prato que pode proporcionar condições fisiológicas in vitro para demonstrar .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Meio de Cultura (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Suplementos	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicilina-Estreptomicina	GIBCO	10908-010	0,5 ml
Suplemento GlutaMAX	GIBCO	35050-061	0,5 ml
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
2. meios de lavagem (HBSS, 100 ml)
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES (1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
3. HEPES tamponado com solução salina (HBS)    pH=7,3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,Sigma		C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glicose	Sigma	G0350500	10 mM
4. Coquetel HBS para imagens ao vivo pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,Sigma		C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glicose	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxina	Tocris	1078	2 µ M
bicuculline	Tocris	131	10 µ M
D-AP-5	Tocris	105	50 µ M
CNQX	Tocris	1045	20 µ M
LY341495	Tocris	1209	10 µ M
5. Sem cálcio HBS    pH=7,3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glicose	Sigma	G0350500	10 mM
6. 56 mM Potássio ACSF pH=7,4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1,3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2,5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26,2 mM
Glicose	Sigma	G0350500	10 mM