Sistema de Gel Concentric para estudar o papel Biofísica da Matrix Microenvironment sobre a migração celular 3D

Resumo

As propriedades mecânicas e a micro estrutura da matriz extracelular afectar fortemente a migração de células 3D. Um método in vitro para estudar o comportamento de migração celular no espaço-temporal ambientes biofísico variáveis, tanto na população e os níveis de células individuais, é descrito.

Resumo

A capacidade das células para migrar é crucial numa grande variedade de funções celulares ao longo da vida do desenvolvimento embrionário e na cicatrização de tumor e a metástase do cancro. Apesar dos esforços intensos de investigação, os princípios bioquímicos e biofísicos básicos de migração de células ainda não são totalmente compreendidos, especialmente nas três dimensões (3D) microambientes fisiologicamente relevantes. Aqui, nós descrevemos um ensaio in vitro concebido para permitir a análise quantitativa de 3D ​​comportamentos de migração celular. O método explora mechanosensing capacidade da célula e propensão para migrar para dentro da matriz extracelular previamente desocupado (ECM). Usamos a invasão de células do cancro da mama altamente invasivos, MDA-MB-231, em géis de colagénio, tal como um sistema modelo. A disseminação da população de células e as dinâmicas migratórias de células individuais ao longo de semanas de cultura pode ser controlada por meio de imagens ao vivo de células e analisados ​​para extrair dados espaço-temporalmente-resolvidos. Além Do Mais, O método é facilmente adaptável para diversas matrizes extracelulares, oferecendo assim uma maneira simples e poderosa para investigar o papel dos factores biofísicos no microambiente sobre a migração celular.

Introdução

A migração de células desempenha um papel chave em várias respostas fisiológicas, tais como o desenvolvimento embrionário, hemostase, e resposta imunitária, bem como em processos patológicos tais como doenças vasculares, inflamação e cancro ^1. Dissecando os factores bioquímicos e biofísicos subjacentes a migração celular é portanto fundamentalmente importante não só para compreender os princípios básicos de funções celulares, mas também para fazer avançar várias aplicações biomédicas, tais como em engenharia de tecidos, anti-metástases e desenvolvimento de drogas anti-inflamatórias. Desde observação in vivo é tecnicamente desafiador, uma série de ....

Protocolo

Colheita 1. celular

1. Obter MD-MBA-231 a partir do 37 ° C, 5% de _CO2. Separar as células do tecido placa de cultura utilizando-se 0,5% de solução de Tripsina-EDTA. Use 1 ml de solução de tripsina-EDTA para células cultivadas num frasco T25.
2. Células de pellets em um tubo de 15 ml por centrifugação a 200 x g durante 4 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de cultura.
3. Contagem de densidade celular, ρ, utilizando um hemocitómetro.
   Nota: Para preparar o gel interior da célula-semeado, a suspensão de células vai ser, mais tarde, diluiu-se 10 × para atingir a densidade final de células d....

Resultados

O ensaio de gel concêntrico aqui apresentada foi realizada utilizando células de cancro da mama altamente invasivos, MDA-MB-231, com 2,4 mg / ml de gel de colagénio interior e uma densidade de sementeira de células de = 2 x 10 ⁶ células / ml, como um exemplo. Como mostrado na Figura 2, tipicamente depois de alguns dias de cultura, as células violou a interface gel interior-exterior e começou a invadir o exterior de gel. A população de células predominantemente espalhar radialmente para o exte.......

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um ensaio in vitro para estudar o comportamento migratório 3D de células em ambientes matriciais que se assemelham topologicamente a ECMs encontradas in vivo. Existem três pontos fortes principais deste ensaio em comparação com outros métodos atualmente disponíveis. Primeiro, este ensaio permite examinar simultaneamente os mecanismos de migração celular tanto no nível da população quanto no nível da célula individual. Isso abre possibilidades de estudar a migração celular co.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora de cultura de células	Fisher Scientific Pte Ltd	Modelo: 371, S/No 318854-6055
Microscópio confocal	Nikon A1R		Microscópio de varredura a laser confocal invertido equipado com câmara de incubadora
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Corante fluorescente CellTracker CMTMR	Life Technologies	C2927
Prato com fundo de vidro	IWAKI Cell Biology	3931-035	Prato de 35 mm de diâmetro com poço de fundo de vidro de 12 mm de diâmetro
Hemocitômetro	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessador medidor de pH	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Colágeno	Advanced BioMatrix	#5010-D	Colágeno bovino solubilizado em ácido tipo I (pH de estoque ~ 2)
Lente objetiva	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicilina-Estreptomicina	Life Technologies	15140-122
Medidor de pH	Sartorius	S/No 29153352	Basic pH Meter PB-11
Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400-054