Um novo protocolo de imagem foi desenvolvido usando um atuador mecânico acionado por motor personalizado para permitir a medição de respostas em tempo real à tensão mecânica em células vivas. Relevante para a mecanobiologia, o sistema pode aplicar deformações de até 20%, permitindo imagens quase em tempo real com microscopia de força confocal ou atômica.
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Artigo de método
Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento
Neste artigo
Resumo
Resumo
Atualmente, há um interesse significativo em entender como as células e tecidos respondem a estímulos mecânicos, mas as abordagens atuais são limitadas em sua capacidade de medir respostas em tempo real em células vivas ou tecidos viáveis. Um protocolo foi desenvolvido com o uso de um atuador celular para distender células vivas crescidas ou tecidos ligados a um substrato elástico durante a imagem com microscopia de força confocal e atômica (AFM). Estudos preliminares mostram que o alongamento tônico das células epiteliais brônquicas humanas causou um aumento significativo na produção de superóxido mitocondrial. Além disso, usando este protocolo, as células epiteliais alveolares foram esticadas e fotografadas, o que mostrou dano direto às células epiteliais por hiperdistensão, simulando uma forma de lesão pulmonar in vitro. Um protocolo para conduzir o nano-indentation do AFM em pilhas esticadas é fornecido igualmente.
Introdução
As células são submetidas a cargas mecânicas em muitos tecidos, e este estímulo mecânico foi mostrado para promover a alterações dos padrões de expressão de genes, a libertação de factores de crescimento, citoquinas, ou remodelação da matriz extracelular e do citoesqueleto 1-4. Os sinais intracelulares transduzidas de tais estímulos mecânicos ocorrer através do processo de mecanotransdutores 5-7. No sistema respiratório, um resultado de mecanotransdutores é o aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e 8,9 citocinas pró-inflamatórias 10 em células epiteliais pulmonares, na presença de cíclica esforço de tensão. Uma fo....
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Protocolo
1. Construção de membrana com Bem Paredes de Retenção de celular Meios de Cultura (ver Figura 1D para o produto final)
- Usando o polidimetilsiloxano (PDMS) folhas revestidas com colagénio I, cortar o contorno da membrana flexível com um bisturi ou uma matriz.
- Colocar cada membrana numa placa de 60 mm de Petri para o armazenamento.
- Criação de paredes:
- Misture PDMS em uma proporção de 10: 1 em peso, de elastômero A a elastômero B (agente de cura).
- Pour 5 ml de PDMS totalmente misturadas em tubos de 50 ml.
- Coloque tubos de 50 ml com PDMS não curado horizontalmente num forno de hibridação.
- Utilizar a fu....
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Resultados
Espécies Reativas de Oxigênio e Deformação
Estudos anteriores mostraram aumentos de espécies reativas de oxigênio (ROS) em vias aéreas e células epiteliais alveolares em resposta ao estiramento cíclico 21. Espécies reactivas de oxigénio incluem moléculas e radicais livres derivados de oxigénio molecular com alta reactividade com lípidos, proteínas, polissacáridos, ácidos nucleicos e 22-24. ROS servir como um sinal intracelular comum para regular a função de can.......
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Discussão
Um dispositivo único para imagens de células vivas durante estiramento mecânico foi desenvolvido; e este dispositivo foi usado em um protocolo para estudar epiteliais do pulmão mechanobiology celular. Em estudos preliminares, verificou-se que uma única estiramento realizada estimulou a produção de superóxido mitocondrial em células epiteliais brônquicas. Além disso, foi demonstrado que o aumento dos níveis de tensão mecânica causou danos directos para a integridade de uma monocamada de células epiteliais alveolares.
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam que agradecer Fedex Instituto de Tecnologia da Universidade de Memphis para seu apoio. Os autores gostariam de agradecer os alunos do grupo de projeto sênior de design no Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn do departamento de Universidade de Tecnologia de Engenharia de Memphis para controle de motor e Dr. Teng Bin e Ms. Charlean Luellen por sua ajuda em cultura de células. Este trabalho foi apoiado por K01 HL120912 (ER) e R01 HL123540 (CMW).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| SmartMotor NEMA 34: Série 3400 | MOOG Animatics | SM3416D | Motor integrado, controlador, amplificador, codificador e barramento de comunicações |
| Membrana Flexcell (Revestida com Colágeno I) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5" x 5.25" x 0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI mancha |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | Rótulo de superóxido mitocondrial |
| Inibidor de superóxido | DMEM | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| Tubos de 50 ml | Fisher Scientific | 06-443-19 | Qualquer tubo de centrífuga pode ser usado para criar uma área para imagens. |
| Forno de Hibridização | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Células Epiteliais de Pulmão de Camundongo |
| Células Epiteliais Bronquiais Humanas | ATCC | CRL-2741 | |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams para Sensores de Orçamento de Nano-indentação | Si-Ni30 | ||
| AFM | Microscópio Olympus | Olympus MFP3D | |
| Asylum | Microscópio Olympus | IX-71 | Microscópio invertido com objetivas de 20X e 40X. |
| Pesquisa do asilo | dos prolongamentos do pé do AFM | não disponível | do AFM |
| Finite dos elementos | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscópios | |||
| Digital microscópio | Life Technologies | EVOS XL Core | Inicialmente uma empresa independente, agora propriedade da Life Technologies. |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM 710 | Microscópio vertical de 2 fótons |
Referências
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E.
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Reimpressões e permissões
