Artigo de método

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

10.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/52752

⸱

30 de maio de 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

Neste artigo

Resumo

Um ELISA que oferece uma nova abordagem quantitativa é descrito. Ele detecta especificamente a α-sinucleína associada à doença (αSD) em um modelo de camundongo transgênico (M83) de sinucleinopatia usando vários anticorpos contra a forma fosforilada de αS na Ser129 ou a parte C-terminal da proteína.

Resumo

Além dos métodos estabelecidos como Western blot, são necessários novos métodos para quantificar rapidamente e facilmente associada a doença α-sinucleína (D aS) em modelos experimentais de synucleopathies. Uma linha de ratinhos transgénicos (M83) que sobre-expressam os aS A53T humanos e o desenvolvimento de um fenótipo clínico espontaneamente dramática entre oito e 22 meses de idade, caracterizada por sintomas que incluem a perda de peso, prostração, e deficiência motora grave, foi utilizada neste estudo. Para análises moleculares de aS D (aS associada a doença) nestes ratos, um ensaio ELISA foi desenvolvido para quantificar especificamente aS D em ratinhos doentes. Análise do sistema nervoso central neste modelo de ratinho revelou a presença de D aS principalmente nas regiões do cérebro caudal e da medula espinhal. Não houve diferenças na distribuição aS D entre diferentes condições experimentais que conduzem à doença clínica, isto é, em uninoculATED e normalmente envelhecimento ratinhos transgénicos e em ratinhos inoculados com extractos de cérebro de ratinhos doentes. A detecção específica de aS D imunorreactividade usando um anticorpo contra a Ser129 fosforilada aS por ELISA essencialmente correlacionados com os valores obtidos por transferência de Western e imuno-histoquímica. Inesperadamente, resultados semelhantes foram observados com vários outros anticorpos contra a parte C-terminal de aS. A propagação de aS D, sugerindo o envolvimento de um mecanismo de "prião-like", pode, assim, ser facilmente controlado e quantificado neste modelo de ratinho utilizando uma abordagem de ELISA.

Introdução

A maioria dos métodos atuais para detectar α-sinucleína associada à doença (αSD) em modelos experimentais da doença de Parkinson (DP), como imunohistoquímica ou Western blot, são demorados e não quantitativos. Esta doença neurodegenerativa é caracterizada pela agregação de alfa-sinucleína principalmente na forma de inclusões contendo uma forma agregada da proteína pré-sináptica normalmente solúvel αS1,2 (corpos de Lewy e neuritos de Lewy). Normalmente apenas marginalmente fosforilada, αS é hiperfosforilada em sua serina 129 na resíduo nestas inclusões3 e pode ser monitorada por anticorpos especificamente direcionados contra αS fosforilada em Ser129, fornecendo assim um marcador confiável da patologia.

Pesquisas recentes sugerem que um mecanismo "semelhante ao prion" poderia estar envolvido na propagação da agregação de αS dentro do sistema nervoso de um paciente afetado4,5. Estes estudos relataram a aceleração de uma sinucleinopatia inoculando extratos cerebrais contendo αSD em um modelo de camundongo transgênico (M83) expressando uma proteína αS humana mutada A53T associada a um comprometimento motor severo que ocorre à medida que os camundongos envelhecem6. Da mesma forma, a inoculação intracerebral de αS recombinante agregado no mesmo modelo de camundongo M83 confirmou a aceleração da agregação5. A indução de depósitos de αS fosforilada também foi relatada após a inoculação de camundongos C57Bl/6 selvagens com αS recombinante fibrilar ou extratos cerebrais de pacientes humanos com DLB7,8. Sacino et al.9 recentemente apontaram que após a injeção de αS humano fibrilar, uma formação generalizada e progressiva de inclusões cerebrais de αS poderia ser induzida em camundongos M83, mas não em camundongos transgênicos E46K ou camundongos não transgênicos nos quais as inclusões de αS induzidas eram transitórias e principalmente restritas ao local da injeção. Estudos recentes em macacos confirmaram a propagação de agregados de αS após a inoculação de extratos derivados da DP em espécies mais próximas aos humanos10.

A ligação entre as alterações de αS e a doença de Parkinson sugere que αSD é um potencial biomarcador para a doença de Parkinson11. Um estudo recente mostrou a detecção de agregados solúveis oligoméricos de α-sinucleína no líquido cefalorraquidiano (LCR) humano e plasma como um potencial biomarcador para a doença de Parkinson baseado em um sistema sanduíche ELISA convencional usando o mesmo anticorpo para capturar e detectar αS12. Com base no mesmo método, proteínas multiméricas foram reconhecidas em amostras biológicas, incluindo o cérebro, porque existem múltiplas cópias de epítopos presentes nas formas montadas13. Muito recentemente, αS patológica no LCR de pacientes com patologia comprovada de corpos de Lewy foi detectada usando tanto um kit ELISA com um anticorpo altamente específico contra αSD (5G4) quanto um ensaio de imunoprecipitação14. Esses métodos poderiam diferenciar pacientes com DP/DLB de outros tipos de demência.

A propagação "semelhante ao prion" da agregação de αS foi estudada ainda mais no modelo de camundongo transgênico M83 usando uma abordagem ELISA que foi projetada para identificar especificamente αSD15. Neste estudo, relatamos o protocolo ELISA detalhado usado para detectar quantitativamente αSD em camundongos doentes (seja ou não inoculados com αSD de camundongos M83 doentes) e mais especialmente nas regiões cerebrais especificamente direcionadas pelo processo patológico neste modelo de camundongo transgênico M834.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos e protocolos que envolvam animais estavam em conformidade com a Directiva CE 86/609 / CEE do Conselho e ratificado pelo vem, o comitê nacional francês para a consideração de Ética em Experimentação Animal (protocolo 11-0043). Os animais foram alojados e tratados em ANSES de aprovado instalações experimentais em Lyon (aprovação B 69387 0801).

1. Preparação de Ratos

  1. Eutanásia ratinhos por injecção intraperitoneal de uma dose letal de pentobarbital de sódio.
  2. Recuperar todo o cérebro do crânio do rato e colocá-lo em um 35 milímetros de plástico placa de Petri sobre gelo até a extração.
  3. Extrai-se a medula espinal cervical.
    NOTA: aS Extrair quer a partir de uma das metades do cérebro após a secção sagital ou a partir de cérebros de rato dissecadas, disponível após as experiências enumeradas na Tabela 1.
Experiment Ratos
Inóculo (equivalente cérebro) 		Período de sobrevivência
(Dpi) 		Median / sobrevivência máxima
(dias de idade) 		aS detecção d por ELISA
/ WB / IHC
1 Ratos não inoculadas 441 ± 166 419/736 8/8
2 Camundongos inoculados (0,2 mg) 150 ± 52 140/241 9/9

Tabela 1. Lista de experiências realizadas em ratos M83. As inoculações foram realizadas com 6 semanas de experiência 2 na área do estriato-cortical com 20 ul de um homogenato de cérebro de um rato doente (1% peso / vol em glucose a 5%), depois anestesia de seis semanas de idade ratos M83 homozigotos 3% inalação de isoflurano. dpi: dias após inoculção.

2. Extracção de aS Cérebro Metades

  1. Sagital cortar o cérebro para obter duas metades. Pesar cada metade em um tubo ribolysis contendo bolas de moagem.
  2. Prepare alta Sal (SH) de tampão contendo 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 750 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 1% de fosfatase e inibidores da protease cocktails. Adicionar tampão alto de sal para as metades do cérebro para se obter 20% (peso / volume) homogeneizados.
  3. Preparar as amostras de as metades cerebrais usando um homogeneizador mecânico em 6,0 m / s durante 23 seg duas vezes. Após os primeiros 23 segundos de homogeneização, colocar os tubos que contêm os homogeneizados em gelo durante 2 min antes do segundo ciclo de 23 seg.
  4. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 5 minutos para eliminar fragmentos de cérebro não moídos. Recuperar os sobrenadantes, dividem-se em 200 mL alíquotas e mantê-los à temperatura de -80 ° C para análise posterior ELISA.

3. aS Extração de Dissecadas regiões do cérebro

  1. Dissecar umcérebro inteiro em um 35 milímetros de plástico placa de Petri no gelo com um ampliador de baixa potência (ampliação 8X), utilizando dois forcipes cujas extremidades são mantidos juntos, exceto quando dissecando o hipocampo. Não exceda 10 min para preservar a integridade do cérebro. Coloque o cérebro lado direito para cima e recuperar os seguintes regiões do cérebro, nesta ordem:
    1. Separe um dos dois bulbos olfatórios usando uma pinça colocados logo atrás do bulbo. Deslocá-lo do cérebro por um movimento para baixo. Repita esta operação para a segunda lâmpada.
    2. Suavemente cunha a pinça entre as duas córtices e movê-lo para a frente para facilitar a dissociação das duas córtex. Mantendo o cérebro no lugar com um fórceps, utilizar outro para separar o córtex do hipocampo.
    3. Posicionar a pinça 2 mm abaixo do córtex. Manter uma pressão suave sobre a pinça até que o topo do hipocampo é visível. Retire a primeira parte do córtex, e repita com a segunda parte. Utilizar as pinças para separar os dois córticescomeçando no hipocampo e que se deslocam para a frente do cérebro.
    4. Posicione a pinça abertos ao redor um dos hipocampos. Fechar a pinça, na parte inferior do hipocampo, em seguida, removê-lo suavemente, recuperando-se, tanto quanto possível. Repetir o procedimento para a segunda hipocampo.
    5. Posicionar as pinças abertas abaixo de um dos corpos estriados e separá-lo suavemente a partir do cérebro. Utilizar as pinças para remover qualquer remanescente córtex do striatum. Repita este procedimento para o segundo striatum.
    6. Utilizar as pinças para deprimir suavemente por 2 mm, o contorno do cerebelo para facilitar a separação do cerebelo a partir do cérebro. Coloque a pinça logo atrás do cerebelo e removê-lo, movendo a pinça para a frente.
    7. Utilizar a parte larga da pinça para elevar o mesencéfalo, a fim de ver claramente onde se junta o tronco cerebral. Adicione uma incisão vertical na junção, em seguida, remover o tronco cerebral.
    8. Posicione a pinça atrás do mesencéfalo, que is composta por quatro estruturas arredondadas. Inciso verticalmente até o mesencéfalo foi completamente separado do restante do cérebro.
  2. Prepare homogenatos de variável% (peso / volume) em tampão SH, dependendo da quantidade de tecidos disponíveis, isto é, 5% homogeneizado para um peso entre 10 e 30 mg, 10% para um peso entre 30 e 80 mg, e 20% para um peso acima de 80 mg.
    1. Adicionar um volume adequado de tampão de HS para as regiões cerebrais dissecados para se obter o esperado% de homogenato.
    2. Vortex e verificar que os tecidos são totalmente imersos no buffer HS.
    3. Homogeneizar amostras preparadas a partir das regiões cerebrais dissecados ou a medula espinhal cervical com um moinho de tecido composto por um tubo de vidro de borosilicato e dois pilões, A e B.
    4. Pour cada região do cérebro para ser esmagado directamente para dentro do tubo. Inserir um pilão para dentro do tubo e retirá-la. Repetir este movimento cerca de dez vezes para dissociar o tecido. Em seguida, use um pilão B para continue moer o tecido com mais 20 movimentos. Transferir os homogeneizados num tubo de 1,5 ml com uma pipeta de transferência de 1 ml.
  3. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar quaisquer fragmentos cerebrais não moídos. Recuperar os sobrenadantes, dividi-los em 200 mL alíquotas e mantê-los à temperatura de -80 ° C para análise posterior ELISA.

4. Detecção de aS por ELISA

  1. Diluir os anticorpos de revestimento para 0,01 ng / ml. Use um anti-soro policlonal de coelho ou aS monoclonal clone de anticorpo em 42 mM de Na 2 CO / 3 tampão NaHCO 3 50 (pH 9,6).
  2. Revestir a microplacas de 96 poços com 100 ul por poço de solução de revestimento, esta e deixar a 4 ° CO / N. Utilizar o anticorpo policlonal de coelho anti-aS na solução de revestimento para ELISA, utilizando anticorpos de detecção syn514, clone 42, LB509, AS11, 4d6 ou 8A5. Use o anti-aS anticorpo monoclonal clone 42 como uma solução de revestimentoem combinação com o anti-pSer129 aS anticorpo de detecção.
    NOTA: Se necessário, as placas podem ser mantidas a 4 ° C durante uma semana antes do ELISA é realizado.
  3. Usar um lavador de placas para lavar as placas cinco vezes com 300 ul de solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de Tween 20 (PBST) por poço. A partir deste passo em diante, a incubação é a TA.
  4. Adicionar 200 ul de tampão PBS T20 por cavidade de bloqueio. Agita-se durante 1 hora a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST.
  5. Diluir os homogenatos cerebrais (diluição 1: 100 dos homogenatos de 20%, 01:50 10% dos homogenatos e 01:25 dos homogenatos de 5% em PBST BSA a 1%), e adicionar 100 ul a cada poço. Em seguida incubar durante 2 horas enquanto se agitava a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST.
  6. Adicione os diferentes anticorpos de detecção aS em PBST com BSA 1% nas diluições mencionados na Lista de Materiais. Incubar durante 1 hora a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST.
  7. Adicionar tanto anti-Mouse ou anti-coelho conjugados HRP de IgG diluído 1: 8000 em PBST suplementado com BSA a 1% durante 1 hora, agitando a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST.
  8. Adicionar 100 ul de 3,3 ', 5,5' solução-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço e incubar durante 15 min no escuro, com agitação a 150 rpm.
  9. Parar a reacção por adição de 100 ul de HCl 1 N por poço, em seguida, medir a absorvência a 450 nm com um leitor de microplacas.
  10. Para análise de dados, subtrair o valor de DO obtidos com um bem com todos os reagentes, excepto as amostras do cérebro do rato (bem em branco) a partir dos valores de DO medido para cada uma das amostras analisadas.

5. Mapeamento de Epitopos

  1. Realizar mapeamento de epítopos de acordo com o método descrito por Osman 16. Resumidamente, os péptidos da sequência no local de α-sinucleína humano contendo 12 aminoácidos de nitrocelulose com 10 aminoácidos que se sobrepõem.
  2. Bloco com 50 mM de Tris / NaCI 150 mM, pH 10 contendo 0,05% de Tween 20 e 5% de leite em pó. Incubar o anticorpo em solução a uma concentração de 2 ug de anticorpo por ml de bloqueio a 2-10 ° CO / N.
  3. Lava-se a membrana três vezes, utilizando Tris a 50 mM / NaCl 150 mM, pH 10, que contém 0,05% de Tween 20. Incubar, com o anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com HRP. Lava-se a membrana mais cinco vezes, utilizando o mesmo tampão, em seguida, a mancha usando um kit de coloração de Western blot de TMB.

6. Análise Estatística

  1. Use o pacote de software e R nlme para executar as regressões de efeitos mistos para modelar OD. Para cada comparação, realizar um modelo de regressão de efeitos mistos. Use um efeito fixo para distinguir sintomático de grupos assintomáticos.
  2. Usar um efeito aleatório para reflectir a variabilidade de repetições para um dado rato. Verifique homoscedasticidade examinando os resíduos e, se necessário, use as funções de variância para modelar a estrutura de variância de erros dentro do grupo de acordo com Pinheiro e Bates 17. Defina 0,05 como limite de significância de P.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Neste estudo, as ELISAs utilizados especificamente identificados aS associados à doença (D aS) em homogenatos de cérebro preparados num tampão de alto de sal a partir de ratinhos doentes M83. Usando um anticorpo que reconhece especificamente pSer129 aS (p = 0,0074), o ELISA facilmente distingue antigos, camundongos doentes (> 8 meses de idade) de jovens (2-5 meses de idade), os camundongos saudáveis ​​M83 (Figura 1). Vários outros anticorpos mostraram sinais igualmente elevados (> 0,6 O...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Foi demonstrada a utilização de um ELISA para detectar especificamente aS D directamente a partir de homogenatos do cérebro do rato no decorrer da doença no modelo de ratinho transgénico para M83. Na verdade, este ELISA poderia facilmente distinguir os ratos doentes M83 M83 de camundongos saudáveis ​​utilizando homogeneizados única inteiras cerebrais em tampão de alta sal.

Os passos mais críticos para os resultados bem sucedidos utilizando este ELISA são: dissecting correctamente ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer Damien Gaillard para inoculações e acompanhamento de experiências com animais. Este trabalho foi apoiado por ANSES (Agência Francesa de Alimentos, Saúde Ambiental e Ocupacional e Segurança) e por uma bolsa da Fundação France Parkinson.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LB509Abcamab27766Anticorpo de detecção 1/2.000
AS11Produzido na AnsesAnticorpo de detecção 1/1.000
4D6Abcamab1903Anticorpo de detecção 1/2.000
PSer129Abcamab59264Anticorpo de detecção 1/3.000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Anticorpo de detecção 1/1.000
syn514Abcamab24717Anticorpo de detecção 1/500
clone 42BD Biosciences610787Anticorpo de revestimento e detecção (1/2.000)
8A5Fornecido pelo Dr. AndersonAnticorpo de detecção 1/2.000
anticorpo policlonal anti-αsynMilliporeAB5038PAnticorpo de revestimento
Conjugado HRP anti-IgG de camundongoSouthern Biotech1010-05
Conjugado HRP anti-IgG de coelhoSouthern Biotech4010-05
Conjugado HRP anti-IgG de cabra contra camundongoDianova115-035-164
Tampão HSAjustar a pH 7,5 e manter a 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAjustar a pH 7,5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Solução estoque 100 mM, tóxica
Cocktail de fosfatase 1%Pierce78428
Cocktail inibidor de protease 1%Roche04 693 132 00150x concentrado
Microplaca MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampão carbonato 50 mM pH 9,6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602,86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293,36 g/L, pH 9,6
Tampão de bloqueio Superblock T20 PBSPierceE6423H10x concentrado
TMBSigmaT0440Usado para ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Usado para mapeamento de epítopos
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120manter no gelo nesta etapa
Tubos de moagemBiorad355-1197
Lava-placasTecanColumbus Pro
Leitor de placasBioradModelo 680
Lente de aumento de baixa potênciaVWR630-10628X ampliação
Pinça Dumont#7WPI14097Para etapas de dissecação
Pipeta de transferência 1ml SamsoSamso043231
Tubos de 1,5 mlDutscher033290

Referências

  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
  2. Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
  3. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  4. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  5. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  8. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
  10. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
  11. Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
  12. El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
  13. Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
  14. Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
  15. Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).
  16. Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
  17. Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
  18. Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
  19. Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11(2001).
  20. Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
  21. Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
  22. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225(2011).
  23. Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
  24. Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540(2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Detec o de Alfa Sinucle naM todo ELISAAlfa Sinucle na Associada a Doen asPrepara o de Homogeneizado CerebralCompara o por Western BlotAnticorpo Fosfo Ser129An lise da Medula EspinhalTronco Encef lico Mesenc faloPropaga o Semelhante a Pr ons

Artigos relacionados