Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.
Artigo de método
Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.
Adjuvantes vacinais tradicionais, como alúmen, provocam respostas subótimas de células T CD8+. Para enfrentar esse grande desafio no desenvolvimento de vacinas, vários sistemas de nanopartículas foram projetados para imitar as características dos patógenos para melhorar a entrega de antígenos aos linfonodos de drenagem e aumentar a captação de antígenos pelas células apresentadoras de antígenos, levando a novas formulações de vacinas otimizadas para indução de respostas de células T CD8+ específicas do antígeno. Neste artigo, descrevemos a síntese de um sistema de nanopartículas "imitador de patógenos", denominado vesículas multilamelares reticuladas entre bicamadas (ICMVs) que podem servir como um transportador de vacina eficaz para a co-entrega de antígenos de subunidades e agentes imunoestimuladores e elicitação de potentes respostas de linfócitos T CD8 + citotóxicos (CTL). Descrevemos métodos para caracterizar o tamanho hidrodinâmico e a carga superficial de nanopartículas de vacina com espalhamento dinâmico de luz e analisador de potencial zeta e apresentamos um procedimento baseado em microscopia confocal para analisar a entrega de antígenos mediados por nanopartículas aos linfonodos de drenagem. Além disso, mostramos uma nova técnica de imagem de bioluminescência de animais inteiros utilizando a transferência adotiva de células T CD8 + específicas para antígenos que expressam luciferase em camundongos receptores, seguida de vacinação com nanopartículas, que permite a interrogação não invasiva de padrões de expansão e tráfego de CTLs em tempo real. Também descrevemos a coloração de tetrâmero e a análise por citometria de fluxo de células mononucleares do sangue periférico para quantificação longitudinal das respostas endógenas das células T em camundongos vacinados com nanopartículas.
Desenvolvimento tradicional vacina tem utilizado, principalmente, a abordagem empírica de tentativa-e-erro. No entanto, com o recente desenvolvimento de uma grande variedade de biomateriais e descoberta de determinantes moleculares de activação imunitária, é agora possível conceber racionalmente formulações de vacinas com pistas biofísicas e bioquímicas derivados de patogénios 1,2. Em particular, várias plataformas de entrega de droga de partículas foram examinados como transportadores de vacinas uma vez que podem ser co-carregadas com antigénios de subunidade e agentes imunoestimulantes, proteger os componentes da vacina contra a degradação, e aumentar a ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Todas as experiências descritas neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Universidade de uso e cuidados dos Animais (UCUCA) na Universidade de Michigan e realizado de acordo com as políticas e diretrizes estabelecidas.
1. Síntese e Caracterização de ICMVs Co-carregado com proteína Antígeno e Adjuvante Moléculas
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os passos envolvidos na síntese de ICMVs estão ilustrados na Figura 1 6. Resumidamente, uma película de lípido contendo quaisquer fármacos lipofílicos ou corantes fluorescentes é hidratado na presença de drogas hidrofílicas. Os catiões divalentes, tais como Ca 2+, são adicionados à unidade de fusão de lipossomas aniónicos em vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulação, tal como DTT, é adicionado a "staple" lípidos funcionalizado com maleimida na apposing camada.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
O protocolo fornecido neste artigo descreve a síntese e caracterização de um novo sistema de nanopartículas à base de lípidos, denominado ICMVs, e fornece o processo de validação da eficácia de formulações de vacinas à base de nanopartículas para induzir respostas de CD8 +, células T específicas de antigénio. ICMV síntese é completada em todas as condições aquosa, o que é uma grande vantagem em comparação com outros sistemas habitualmente utilizados nanopartículas poliméricas (por exemplo, poli (lactido-co-glic.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Perkin Elmer, desde que o custo de produção incorridos durante a publicação deste artigo.
Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder 1K22AI097291-01 e pelo Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translational dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número UL1TR000433. Nós também reconhecemos Prof. Darrell Irvine no MIT e Prof. Matthias Stephan no Fred Hutchinson Cancer Center por sua contribuição no trabalho inicial sobre as nanopartículas de vacinas e camundongos transgênicos OT-I / Luc.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1. Síntese e caracterização de ICMVs co-carregados com antígeno proteico e moléculas adjuvantes | |||
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[4-(p-maleimidofenil)butiramida] (sal de sódio) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | ||
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | ||
| Monofosforil Lipídio A (Sintético) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| Frascos de vidro de 20 ml | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumina (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propano (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Polietilenoglicol Tiolado (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Exame de drenagem linfonodal de ICMVs marcados com fluorescência com microscopia confocal | |||
| 1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina, 4-Clorobenzenossulfonato Sal (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT meio de congelamento | VWR | 25608-930 | |
| Criomoldes de tecido | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoramento da expansão de células T CD8+ específicas do antígeno, que expressam luciferase, após vacinação com nanopartículas com imagens de animais inteiros | |||
| C57BL/6 | Jackson | 000664 | |
| camundongos Albino C57BL/6 | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 | camundongos Jackson | 003831 | |
| 70 μ m coador de nylon | BD | 352350 | |
| EasySep™ Kit de Isolamento de Células T CD8+ de Camundongo | Células-Tronco | 19853 | |
| IVIS® sistema de imagem de animais inteiros | Perkin Elmer | ||
| 4. Coloração de tetrâmero peptídico-MHC de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para análise de citometria de fluxo de células T CD8+ específicas para antígenos | |||
| K2EDTA tubos | BD | 365974 | |
| ACK tampão de lise | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6- Dicloridrato de diamidino-2-fenilindol (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Citômetro de fluxo | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE
Solicitar permissão