Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

Resumo

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia óptica semi-invasiva para a indução de um coágulo fototrombótico de Rosa Bengala no córtex somatossensorial de um camundongo in vivo. Os aspectos técnicos do procedimento de imagem são descritos desde a indução de um evento fototrombótico até a aplicação e coleta de dados.

Resumo

As técnicas de imagem in vivo aumentaram em utilização devido aos recentes avanços em corantes de imagem e tecnologias ópticas, permitindo a capacidade de visualizar eventos celulares em um animal intacto. Além disso, a capacidade de induzir estados fisiológicos de doenças, como acidente vascular cerebral in vivo, aumenta sua utilidade. A técnica aqui descrita permite a avaliação fisiológica das respostas celulares no SNC após um AVC e pode ser adaptada para outras condições patológicas em estudo. A técnica apresentada usa a excitação a laser do corante fotossensível Rosa Bengala in vivo para induzir um evento isquêmico focal em um único vaso sanguíneo.

O protocolo de vídeo demonstra a preparação de uma janela craniana de crânio fino sobre o córtex somatossensorial em um camundongo para a indução de um evento fototrombótico Rosa Bengala, mantendo a lesão na dura-máter subjacente e no cérebro no mínimo. A preparação cirúrgica é inicialmente realizada sob um microscópio de dissecação com uma plataforma cirúrgica/de imagem feita sob medida, que é então transferida para um microscópio confocal equipado com um adaptador de objetiva invertida. Imagens representativas adquiridas utilizando este protocolo são apresentadas, bem como sequências de lapso de tempo de indução de AVC. Essa técnica é poderosa porque a mesma área pode ser visualizada repetidamente nos dias subsequentes, facilitando estudos longitudinais in vivo de processos patológicos após o AVC.

Introdução

A técnica descrita permite a visualização in vivo de respostas celulares imediatamente após a indução de Rose Bengal fototrombose em um rato intacto. Rosa de Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) é um corante fotossensível utilizado para induzir apoplexia isquémica em modelos animais (ratinhos e ratos). Na sequência de uma injecção de bolus de RB através da veia da cauda e subsequente iluminação através de um crânio diluído com uma luz laser 564 nm, um trombo é induzida causando um acidente vascular cerebral fisiológico ^1. O método foi originalmente descrito por Rosenblum e El-Sabban em 1977, e mais tarde foi adaptado por Watson em meados dos anos 1980 ^1,2. Em breve, Rosa Bengala é irradiado com luz verde de excitação (561 nm do laser no nosso caso), o qual gera a produção de espécies reactivas de oxigénio, que subsequentemente activa o factor de tecido, um iniciador da cascata de coagulação. A indução da cascata de coagulação produz uma les de isquemiaion que é patologicamente relevantes para acidente vascular cerebral clínico ^3.

Acidente vascular cerebral tem uma fisiopatologia complexa, devido à interação de muitos tipos de células diferentes, incluindo neurônios, glia, endotélio e do sistema imunológico. Escolhendo a melhor técnica para estudar um processo celular particular requer várias considerações. Técnicas experimentais podem repartir-se em uma das três categorias: in vitro, in vivo e in silico com cada um tendo vantagens e desvantagens Estudos in vitro têm a desvantagem principal de remover as células de seu ambiente natural e, portanto, não pode reproduzir efeitos vistos em um intacto,. animal vivo. In vivo técnicas de permitir uma maior replicação experimental de estados de doença com o aumento da importância de translação. in silico geralmente refere-se a modelação por computador de uma doença ou de um processo celular, e ao mesmo tempo cada vez mais utilizada para estudar interacções medicamentosas potenciais para exameple, qualquer informação recolhida ainda deve ser testada em células ou tecidos vivos.

O modelo ideal de acidente vascular cerebral no ambiente de laboratório deve demonstrar características patológicas semelhantes aos observados na população humana. Enquanto existem características fisiológicas comuns de acidente vascular cerebral na população humana, existem também muitas diferenças, dependendo do tipo de lesão experimentado. AVC na população humana ocorre como pequenas ou grandes oclusões de vasos, lesões hemorrágicas e artéria para artéria ou cardio-embolias que resultam em volumes de infarto variadas, bem como as diferenças nos mecanismos relacionados a cada patologia. A vantagem da utilização de modelos animais de acidente vascular cerebral é a geração de enfartes reprodutíveis que imitam as características de acidente vascular cerebral humano. Os modelos mais comuns de animais de acidente vascular cerebral incluem a oclusão da artéria usando: Oclusão da artéria cerebral média (métodos de incandescência ou embólicos endovasculares) que modelos distal e o modelo MCAO fototrombose. As vantagens de umd desvantagens de cada modelo foram revistos em outro lugar (ver ⁴ e ^5). Os modelos globais isquêmicas (MCAO), enquanto relativamente fácil de executar são menos relevantes para acidente vascular cerebral humano do que são modelos de acidente vascular cerebral focal. Além disso, estes métodos são altamente variáveis ​​na indução de lesões enfarte cerebral reprodutíveis. O modelo fototrombose é altamente reprodutível, enquanto o experimentador controla seus experimentos bem, proporcionando uma clara vantagem sobre os modelos MCAo. No entanto, devido à microvasculatura insulto o modelo tenha sido descrita para apresentar uma penumbra isquémica mínima, a área em que as células são pensados ​​para serem recuperáveis ^​​6,7. Além disso, o edema vasogénico e formação de edema citotóxico também pode ser induzida a seguir a irradiação da área de imagem. Apesar destas limitações a técnica tem proporcionado uma nova visão sobre muitos processos fisiológicos seguintes acidente vascular cerebral ^{8, 9, 10, 11.}

Protocolo

Nota: Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso da Universidade do Texas Saúde Science Center San Antonio animal Institucional e foram consistentes com as diretrizes chegar.

1. A anestesia para Cortical Preparação

1. Posicione o mouse em uma câmara de indução com 2-3% isoflurano misturado com o oxigênio para induzir a anestesia. Observe a diminuição da taxa de respiração como o mouse é induzida. Beliscar das garras do mouse para determinar se o mouse está pronto para passar para o cone do nariz. Nota: nível de Anestesia é um passo crítico em qualquer preparação in vivo e os cuidados devem ser tomados para não induzir a um nível que vai causar isquemia global.
2. Uma vez que o mouse é suficientemente anestesiados, transferir o animal para o / plataforma de imagem cirurgia e colocar o nariz do rato no cone do nariz e aplicar 1-1,2% isofluorano para manter um estado de anestesia. Certifique-se de que o mouse está deitado em uma co temperaturantrolled almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal (37 ° C +/- 0,5 ° C) durante os procedimentos restantes. Coloque veterinário pomada sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
3. Monitorar a fisiologia do rato utilizando um sistema de oximetria de pulso utilizando o clipe cauda ou pé fornecido com o sistema. Verifique se a taxa respiratória é mantida entre 50-65 respirações / min. Verifique se a freqüência cardíaca permanece entre 300-450 bpm e saturação de oxigênio é mantida entre 97-98% para garantir a sobrevivência a longo prazo do animal.
4. Quando o mouse está devidamente anestesiados, raspar o cabelo ao longo do crânio usando cortadores elétricos, remover pêlos residual e limpo, com betadine, seguido de um algodão embebido em álcool. Repita este procedimento até três vezes para garantir um ambiente cirúrgico estéril.

2. Procedimento Cirúrgico

1. Com o couro cabeludo completamente limpo e barbeado, fazer uma incisão de 5 mm de o couro cabeludo do mouse para revelar o fissu cranialres e para localizar bregma.
2. Use um aplicador de algodão estéril para remover quaisquer fáscia remanescentes recobrem crânio.
3. Cole um anel feito de aço inoxidável personalizado (Figura 1) com adesivo de tecido para o osso que cobre o córtex parietal utilizando as coordenadas estereotáxicas de Bregma: -1 a -3 mm e lateral: 2-4 mm. Nota: A cola define tipicamente dentro de 2 minutos após a colocação do anel para o osso.
4. Apor o anel a um suporte estereotáxico (Figura 2) para estabilizar o rato e para impedir o movimento durante o exame.
5. Sob um microscópio de dissecação cirúrgica grau, perfurar lentamente uma seção 1-2 mm no crânio usando uma ferramenta dremel-like velocidade controlada (Meisinger 3,9 milímetros broca) certificando-se de manter o nível de área como ele é perfurado. Conseguir isso usando um padrão zig-zag. Para evitar a acumulação de calor, ajustar a velocidade de perfuração para baixo e faça pausas frequentes.
6. Quando o crânio cranial se torna luminosa da aparência, continuar o desbastedo crânio usando uma lâmina de bisturi, utilizando o mesmo padrão em zig-zag para manter o nível da superfície adelgaçada para facilitar a remoção suave de camadas finas de crânio craniana. Com a ponta da lâmina de bisturi fazer pequenos movimentos lineares com uma leve pressão para remover as camadas finas de osso de cada vez. Continue até a vasculatura é claramente visível através do microscópio de dissecção.
7. Se o experimentador perfura através ou quebrar o crânio durante o processo de desbaste, sacrificar o animal, devido aos danos provável que o córtex subjacente.
   Nota: O crânio do rato é de cerca de 300 um de espessura e é composta por duas camadas finas de um osso compacto (externa e uma camada interna) e uma camada de osso esponjoso ensanduichada entre as duas camadas de osso compacto. A camada externa de osso compacto e a maior parte do osso esponjoso são removidos dentro da área de perfuração a 5 milímetros, resultando em uma camada de 50 um aproximado de osso compacto restante (ver Figura 2B). Visualizção da vasculatura irá garantir que o crânio intactos diluído final é aproximadamente de 50 um de espessura. O crânio é, portanto, ainda presente quando diluído para esta espessura.

3. Microscópio Set-up

1. Use um sistema de microscópio invertido (sistemas de dois fótons convencional, ou confocal), que tem um inversor objetivo. Nota: É também possível utilizar um microscópio vertical padrão. O factor limitante será o espaço entre a fase e os objectivos. Modificações na fase pode ser necessário para realizar essa configuração.
2. Fixe a plataforma cirúrgica / de imagem para um palco feito sob encomenda que está localizado ao lado da base do microscópio. Nota: A plataforma é feita através de uma tomada de laboratório para permitir o movimento vertical da plataforma cirúrgica / imagiologia sob a objectiva. A tomada de laboratório é montado numa placa afixada a quatro postes cilíndricos. (Ver Figura 2).
3. Posicione o inversor objectivo contendo uma 20Xobjectiva sobre a janela craniana. Utilizar uma fonte de luz externa para encontrar a janela craniana, olhando através da ocular do microscópio e posicionar o objectivo na área da imagiologia. Nota: A área de imagem será indicado pela presença da vasculatura.
4. Para objectivos à base de água, utilizar artificial fluido espinal cerebral (aCSF) (NaCl 130 mM; KCl 30 mM; 12 mM de KH ₂ PO _4; 200 mM de _NaHCO3; HEPES 30 mM; e glucose 100 mM) como o meio, devido à potencial fugas na cavidade craniana durante imagiologia (Figura 3).

4. Rosa Bengala Dye Preparação, Administração e indução do AVC

1. Prepare uma nova solução / ml 20 mg de Rosa Bengala no fluido cerebrospinal artificial (aCSF); filtrar e esterilizar antes da administração. Não reutilize ou guarde o Rosa Bengala, uma vez que tem sido mista. Faça uma solução nova para cada experimento.
2. Dê uma injecção na veia da cauda de 0,1 ml Rosa Bengala, enquanto senlatar a janela craniana com um laser de 561 nm para assegurar a injecção adequada da solução. Nota: Rosa Bengala serão visualizados dentro de 5 segundos após a injecção na vasculatura do cérebro. O navio inteiro deve ser preenchido com Rose Bengal.
3. Após a injecção adequada de corante Rosa de Bengala escolher um recipiente apropriado para a trombose com base no diâmetro do vaso (40-80 mm) para assegurar a reprodutibilidade de um volume de lesão em particular. Diferenciar entre artérias e veias, olhando para a direção do fluxo sanguíneo: artérias vai passar de diâmetro maior para embarcações de menor diâmetro, veias mover do menor para embarcações de maior diâmetro. Isto é facilmente conseguido através da visualização, uma vez Rose Bengal é injetado.
4. Altere a definição do microscópio da seguinte forma:
   1. Aumente o tempo de permanência. Nota: Isto irá variar dependendo do sistema de microscópio que está sendo utilizado.
   2. Aumentar a potência do laser a 100%.
   3. Coletar imagens de sequência temporal em 1 frame / seg usando ovelocidade máxima de digitalização.
5. Digitalizar o rato até um coágulo estável é formado no interior do vaso. Nota: Isso normalmente é alcançado dentro de 5 min de digitalização contínua (ver Figura 4).
6. Após a indução de formação de coágulo utilizando Rosa de Bengala, remover o rato da área de imagem para trás para o microscópio de dissecação. Retire cuidadosamente o anel de aço inoxidável do crânio craniana. Examine a janela do crânio para qualquer sangramento. Se ocorrer sangramento, encerrar o experimento.
7. Use 6,0 sutura monofilamento para fechar a incisão sobre o crânio. Coloque pomada antibiótica ao longo da linha de sutura para prevenir a infecção. Injectar Buprenex (0,05 mg / kg) por via subcutânea a cada 12 horas durante três dias para o manejo da dor.
8. Devolver o mouse para uma câmara de recuperação após a remoção do anestésico até que esteja totalmente acordado e se movendo livremente.
9. Devolver o mouse para uma gaiola limpa para uma investigação mais aprofundada em um momento posterior.

5. Imagem longitudinal sobre subsequentes Dias

1. Empregam métodos a seguir para realizar imagem longitudinal em dias subsequentes pós-fototrombose.
   1. Anestesiar o rato como descrito na Seção 1 dos métodos.
   2. Após a anestesia adequada re-abrir o couro cabeludo, removendo quaisquer suturas residuais para reabrir a pele que recobre o campo de imagem previamente perfurados.
   3. Use um aplicador de algodão estéril para remover quaisquer fáscia remanescentes recobrem crânio.
   4. Cole um anel personalizado feito de aço inoxidável (Figura 1) com adesivo tecidual ao osso que recobre o campo de imagem anterior.
   5. Apor o anel a um suporte estereotáxico (Figura 2) para estabilizar o rato e para impedir o movimento durante o exame.
   6. Localizar a vasculatura subjacente ao crânio previamente diluído. Use injecção na veia da cauda de FITC-dextrano para verificar a presença do coágulo induzido anteriormente.
   7. Use 6,0 sutura monofilamento para fechar a emCision sobre o crânio. Coloque pomada antibiótica ao longo da linha de sutura para prevenir a infecção. Injectar Buprenex (0,05 mg / kg) por via subcutânea a cada 12 horas durante três dias para o manejo da dor.
   8. Devolver o mouse para uma câmara de recuperação após a remoção do anestésico até que esteja totalmente acordado e se movendo livremente.

6. A verificação do Curso de Indução (post-mortem)

1. Na conclusão do estudo, verificar o volume sistólico utilizando cloreto de (TTC) Coloração de 2,3,5-trifeniltetrazólio, como mostrado na Figura 5. O método completo pode ser encontrado em ^12.

Resultados

O objectivo deste método foi de induzir um acidente vascular cerebral isquémico em modelos animais (ratinhos e ratos) depois de uma injecção de bolus de RB através da veia da cauda e iluminação posterior de um crânio diluído com uma luz laser de 561 nm. As imagens na Figura 4 demonstram a progressão de formação de coágulo dentro de um único vaso a seguir à irradiação da área a 0, 1, 1,5 e 2 min. Antes da formação do coágulo todo o vaso é branco devido ao fluxo livre Rose Bengal. Após a indução de irradi...

Discussão

A capacidade de traduzir fisiopatologia curso experimental de animal para aplicação em seres humanos tem sido atormentado com o fracasso. No entanto, a utilização de modelos animais, tais como o modelo fototrombose, permite uma melhor compreensão da patofisiologia acidente vascular cerebral e a exploração de novas abordagens terapêuticas para proporcionar neuroprotecção após um acidente vascular cerebral. Pequenos acidentes vasculares cerebrais corticais e microinfartos produzidos pelo modelo photothrombotic são clinica...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurano Anestésico	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 10 mM de glicose e 26 mM de NaHCO3 (pH 7,4).
[header]
Tesoura de dissecação	Produtos bioindustriais	500-410
Tesoura de operação 14 cm	Produtos Bioindustriais	12-055
Fórceps Dumont High Tech #5 estilo, reto	Produtos Bioindustriais	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Plataforma para Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Suporte de barra de orelha de configuração estereotáxica	Stoelting/Cyborg	51654
Máquina de anestesia para roedores Labvent Dispomed	DRE, Inc.	15001
Vaporizador de isoflurano Tech IV	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Tubo respiratório de circuito de banho	DRE, Inc	86111B
Adaptador de roedores para tubo de banho	DRE, Inc	891000
Regulador O2 para tanques de oxigênio	DRE, Inc	CE001E
Câmara de indução de roedores	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in com agulha P-3	Suture Express	1639G
Objetiva inversor Adaptador óptico Tecnologias			LSM
Broca Foredom Dupla voltagem 110/120	Foredom	134.53
Broca Meisinger 3.9 mm	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)

de equipamentos