Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.
In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.
A técnica descrita permite a visualização in vivo de respostas celulares imediatamente após a indução de Rose Bengal fototrombose em um rato intacto. Rosa de Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) é um corante fotossensível utilizado para induzir apoplexia isquémica em modelos animais (ratinhos e ratos). Na sequência de uma injecção de bolus de RB através da veia da cauda e subsequente iluminação através de um crânio diluído com uma luz laser 564 nm, um trombo é induzida causando um acidente vascular cerebral fisiológico 1. O método foi originalmente descrito por Rosenblum e El-Sabban em 1977, e mais tarde foi adaptado por Watson em meados dos anos 1980 1,2. Em breve, Rosa Bengala é irradiado com luz verde de excitação (561 nm do laser no nosso caso), o qual gera a produção de espécies reactivas de oxigénio, que subsequentemente activa o factor de tecido, um iniciador da cascata de coagulação. A indução da cascata de coagulação produz uma les de isquemiaion que é patologicamente relevantes para acidente vascular cerebral clínico 3.
Acidente vascular cerebral tem uma fisiopatologia complexa, devido à interação de muitos tipos de células diferentes, incluindo neurônios, glia, endotélio e do sistema imunológico. Escolhendo a melhor técnica para estudar um processo celular particular requer várias considerações. Técnicas experimentais podem repartir-se em uma das três categorias: in vitro, in vivo e in silico com cada um tendo vantagens e desvantagens Estudos in vitro têm a desvantagem principal de remover as células de seu ambiente natural e, portanto, não pode reproduzir efeitos vistos em um intacto,. animal vivo. In vivo técnicas de permitir uma maior replicação experimental de estados de doença com o aumento da importância de translação. in silico geralmente refere-se a modelação por computador de uma doença ou de um processo celular, e ao mesmo tempo cada vez mais utilizada para estudar interacções medicamentosas potenciais para exameple, qualquer informação recolhida ainda deve ser testada em células ou tecidos vivos.
O modelo ideal de acidente vascular cerebral no ambiente de laboratório deve demonstrar características patológicas semelhantes aos observados na população humana. Enquanto existem características fisiológicas comuns de acidente vascular cerebral na população humana, existem também muitas diferenças, dependendo do tipo de lesão experimentado. AVC na população humana ocorre como pequenas ou grandes oclusões de vasos, lesões hemorrágicas e artéria para artéria ou cardio-embolias que resultam em volumes de infarto variadas, bem como as diferenças nos mecanismos relacionados a cada patologia. A vantagem da utilização de modelos animais de acidente vascular cerebral é a geração de enfartes reprodutíveis que imitam as características de acidente vascular cerebral humano. Os modelos mais comuns de animais de acidente vascular cerebral incluem a oclusão da artéria usando: Oclusão da artéria cerebral média (métodos de incandescência ou embólicos endovasculares) que modelos distal e o modelo MCAO fototrombose. As vantagens de umd desvantagens de cada modelo foram revistos em outro lugar (ver 4 e 5). Os modelos globais isquêmicas (MCAO), enquanto relativamente fácil de executar são menos relevantes para acidente vascular cerebral humano do que são modelos de acidente vascular cerebral focal. Além disso, estes métodos são altamente variáveis na indução de lesões enfarte cerebral reprodutíveis. O modelo fototrombose é altamente reprodutível, enquanto o experimentador controla seus experimentos bem, proporcionando uma clara vantagem sobre os modelos MCAo. No entanto, devido à microvasculatura insulto o modelo tenha sido descrita para apresentar uma penumbra isquémica mínima, a área em que as células são pensados para serem recuperáveis 6,7. Além disso, o edema vasogénico e formação de edema citotóxico também pode ser induzida a seguir a irradiação da área de imagem. Apesar destas limitações a técnica tem proporcionado uma nova visão sobre muitos processos fisiológicos seguintes acidente vascular cerebral 8, 9, 10, 11.
A capacidade de traduzir fisiopatologia curso experimental de animal para aplicação em seres humanos tem sido atormentado com o fracasso. No entanto, a utilização de modelos animais, tais como o modelo fototrombose, permite uma melhor compreensão da patofisiologia acidente vascular cerebral e a exploração de novas abordagens terapêuticas para proporcionar neuroprotecção após um acidente vascular cerebral. Pequenos acidentes vasculares cerebrais corticais e microinfartos produzidos pelo modelo photothrombotic …
The authors have nothing to disclose.
Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.
Reagents | |||
Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
[header] | |||
Equipment | |||
Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 |