Artigo de método

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução In Situ Hibridização

DOI:

10.3791/52799

⸱

17 de junho de 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNAs são freqüentemente localizada axônios vertebrados e sua tradução local é necessário para pathfinding axônio ramificação ou durante o desenvolvimento e para a manutenção, reparação ou neurodegeneração em períodos postdevelopmental. Análises de alto rendimento revelaram recentemente que os axônios têm um transcriptoma mais dinâmico e complexo do que o anteriormente esperado. Estas análises, no entanto, têm sido feitas principalmente em neurónios em cultura, onde axónios podem ser isolados a partir dos compartimentos somato-dendrítico. É virtualmente impossível de alcançar tal isolamento em tecidos completos in vivo. Assim, a fim de verificar o recrutamento de ARNm e a sua relevância funcional num animal inteiro, análises transcriptoma devem, idealmente, ser combinadas com as técnicas que permitem a visualização de ARNm in situ. Recentemente, as novas tecnologias ISH que detectam ARN a um nível de uma única molécula têm sido desenvolvidos. Isto é especialmente importante quando se analisa a localização subcelular de ARNm, Uma vez que os ARN são localizados, tipicamente encontrada em níveis baixos. Aqui, descrevemos dois protocolos para a detecção de ARNm axonally-localizadas utilizando um novo ultra-sensível tecnologia de RNA ISH. Nós combinamos RNAscope ISH com counterstain axonal usando imuno-histoquímica de fluorescência ou corantes histológicos para verificar o recrutamento de ATF4 mRNA para axônios in vivo no rato maduro e cérebros humanos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recrutamento mRNA axonal e tradução local permitir axônios de responder a estímulos extracelulares de uma forma temporal e espacialmente aguda 1. Síntese da proteína intra-axonal é melhor compreendida no contexto de neurodesenvolvimento, onde ele desempenha um papel crucial no crescimento do cone de comportamento 2-8, 9-11 pathfinding axonal retrógrado e sinalização 12,13. Mas muito menos se sabe sobre o significado funcional da síntese de proteínas axonal em neurónios pós-desenvolvimento, quando os níveis de mRNA e ribossomas axonal são muito reduzidas 14,15. Axônios vertebrados maduros têm sido pensado para ser traducionalmente inativo 16. No entanto, estudos recentes indicam que a tradução local é reativado em axônios maduras em condições patológicas. Por exemplo, um subconjunto de mRNAs é recrutado para axónios em regeneração após a lesão do nervo e a síntese de proteínas intra-axonal é necessária para a regeneração de axónios correcta destes 17. Além disso, o nosso grupo has demonstrou que mRNAs específicos são recrutados para os axônios após exposição local à doença de Alzheimer peptídeo Aâ 1-42, e tradução local do ATF4 fator de transcrição é necessária para propagar os efeitos neurodegenerativos de Ap 1-42 de axônios para a soma neuronal 18. Finalmente, análises de alto rendimento têm revelado que os axônios maduros têm um transcriptoma mais complexo e dinâmico do que o esperado 18-21, especialmente sob condições patológicas. À luz destes estudos, um método altamente sensível e específico para a detecção de mRNAs axonally localizados no sistema nervoso adulto é necessária.

Grande parte do trabalho sobre recrutamento mRNA e tradução local em axônios maduras foi realizada em neurônios cultivados. Isto é especialmente verdadeiro para as análises do transcriptoma de cultura uma vez que não existem métodos especializados que permitem o isolamento de axónios do compartimento da somato-dendrítico 18-20. Embora esses estudos tenham dado ins valiososight para o papel da tradução local em axônios maduros, a questão de saber se neurônios cultivados representam fielmente a situação in vivo ou se o recrutamento mRNA é uma resposta adaptativa dos axônios para condições de cultura ainda está aberta. Poucos estudos têm fornecido evidências de recrutamento mRNA para amadurecer axônios in vivo. Por exemplo, o transcrito que codifica para a proteína marcadora olfactiva tem sido detectada em axónios em neurónios sensoriais adultos 22. Um transgene contendo 3 'UTR do mRNA β-actina é transportado para axónios em neurónios do sistema nervoso periférico e central, nos ratinhos, e é localmente traduzido após períodos de desenvolvimento 23. Lamin b2 mRNA é localizada axônios da retina em Xenopues laevis girinos e seu esgotamento afeta manutenção axônio após o desenvolvimento axonal 21. Interferência com o transporte axonal do ARNm que codifica para o citocromo C oxidase IV altera o comportamento do rato 24. Finalmente, ATF4 ARNm é encontrado em um adultoXONs de ratos e cérebros humanos no contexto de Ap 1-42 induzida neurodegeneração 18.

Transcriptoma análises de alto rendimento têm provado ser útil para identificar perfis de mRNA em axônios isolado in vitro, mas tem limitações para estudos in vivo uma vez que em tecidos completos axônios nunca são encontrados isoladamente, mas misturado com corpos celulares neuronais, células gliais e outros tipos de células. Assim, essas análises têm de ser combinadas com as técnicas de imagem que confirmem a localização subcelular de mRNAs. RNA de hibridação in situ (ISH ARN) permite a detecção e a visualização de sequências de RNA específicas em células e tecidos. No entanto, os ensaios de ARN ISH originais foram adequado apenas para a identificação de ARN altamente abundantes 25, que é raramente o caso para o ARNm axonally localizadas. Para as últimas décadas crescentes esforços têm sido postas em desenvolvimento novas tecnologias que permitem a detecção de ARNm no nível de uma única molécula 25,26. Por exemplo, Singer e seus colegas desenvolveram sondas ISH para detectar mRNAs em células individuais, que consiste em 5 não sobrepostas marcado por fluorescência 50-meros (para obter detalhes consulte o 27). A principal diferença entre as técnicas acima mencionadas e aquela aqui descrito é que a posterior usa 20 Z-estrutura dupla (não linear), que tipicamente têm como alvo sondas ~ 1 kb da região de ARN de interesse assegurar a especificidade e baixos níveis de fundo. As sondas são então hibridados com sequências pré-amplificador e do amplificador que estão, finalmente, marcados com fluorescência ou conjugados com enzimas que permitem reacções cromogénicos. Estes passos de amplificação melhorar a relação sinal-para-ruído em comparação com outras tecnologias de ISH 28. Aqui nós descrevemos dois protocolos utilizando RNAscope combinada ou com fluorescência imunocitoquímica ou com corantes histológicos permitindo counterstaining axonal. Ambos os protocolos são adequados para visualizar localização axonal de ATF4 mRNA em mo adultoe utilizar os cérebros humanos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Columbia e orientações aplicáveis ​​para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas. Nota: Prepare todos os buffers utilizados para os procedimentos ISH em água RNase ou tratada com DEPC. Esta recomendação não é estritamente necessário após ISH foi concluída, mas sugere-se que buffers ainda são preparadas com água bidestilada autoclavado e / ou esterilizado por filtragem.

1. Detecção de ATF4 mRNA localizada Cholinergic axônios no Adulto do rato do cérebro usando fluorescência Hibridização In Situ (FISH) Seguido por imuno-histoquímica

  1. Preparação de amostras para fatias de cérebro congeladas fixo-paraformaldeído
    1. Por exemplo a seguir, preparar fatias de cérebros de camundongos congelados fixos.
      1. Resumidamente, sacrificar ratos nove meses de idade, pela anestesia com cetamina (100 mg kg -1 de peso corporal) e xilazina (10 mg kg -1 weig corpoHT) seguido por infusão transcardial de 4% de paraformaldeído em PBS (pH 7,4).
      2. Remover cérebros e pós-correção em paraformaldeído a 4% durante 24 horas a 4 o C.
      3. Após a fixação, lavar as amostras três vezes em PBS e cryoprotect em 30% de sacarose em PBS (pH 7,4) durante 24 horas a 4 o C.
      4. Cérebros Incorporar em outubro congelamento composto, em série na seção de 20 um em um criostato e montar em poli-D-lisina tratados lâminas de microscópio. Mantenha fatias do cérebro a -20 ° C até o uso.
    2. Remover fatias do cérebro fixadas com paraformaldeído a partir do congelador e secar ao ar durante 30 min à TA.
    3. Lavar três vezes com PBS 1x.
    4. Numa hotte, re-fixar fatias do cérebro do 20 min com 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente.
      NOTA: CUIDADO: 4% de paraformaldeído é tóxico e devem ser manuseados e descartados apropriadamente seguindo os protocolos de segurança.
    5. Lavar três vezes com PBS 1x.
    6. Desidratar fatias de cérebro.
      1. Prepare a 50%, 75% e 100%soluções de etanol.
      2. Imergir as lâminas em etanol a 50% durante 5 min à TA.
      3. Imergir as lâminas em etanol a 75% durante 5 min à TA.
      4. Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min à TA.
      5. Imergir as lâminas em fresco etanol a 100% durante 5 min à TA. Nota: Em alternativa, as lâminas podem ser armazenadas em etanol a 100% a -20 ° C até 1 mês.
  2. Teste FISH seguido de imunohistoquímica usando induzida pelo calor antígeno / desmascaramento RNA
    1. Antes de começar preparar todo o material necessário:
      1. Aqueça o forno de hibridação a 40 ° C e colocar num tabuleiro contendo água destilada no forno para criar um ambiente humidificado.
      2. Pegue uma caixa de slides e colocar toalhas de papel embebido em água destilada para dentro para umidificar a caixa de slide. Coloque a caixa de slides no forno de hibridização.
      3. Remover as sondas (ambos sondas negativos e de destino) de geladeira e aqueça-os no forno de hibridação para 10 min. Deixe esfriar as sondas down à temperatura ambiente.
      4. Equilibrar reagentes de amplificação AMP 1-4 (incluídos no kit de reagentes multiplex fluorescente) à TA.
      5. Preparar a solução de recuperação de antigénio de: citrato de sódio 10 mM (pH 6), 0,05% de Tween 20. Nota: A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente indefinidamente e ser utilizado para a coloração futuro.
      6. Preparar o tampão de lavagem 1x diluição da solução estoque 50x (incluídos no kit de reagentes multiplex fluorescente) em água isenta de RNase ou tratada com DEPC.
        NOTA: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 1 mês e ser utilizado para a coloração futuro. Tampão de lavagem 50x pode precipitar. Se assim for, o calor 50x tampão de lavagem a 40 ° C durante 10 min antes da preparação da solução 1x.
    2. Retirar as lâminas a partir de etanol a 100% e ar seco, durante 5 min à TA.
    3. Prepare um frasco coplin contendo 50 ml de solução de recuperação antigênica. Imergir as lâminas em solução de recuperação antigênica e ferva-os durante 10 minutos em um forno de microondas.
      NOTA: Como alternativa lugar desliza horizontalmente em um 100 milímetrosdiâmetro prato de vidro redondo contendo 100 ml de solução de recuperação.
      1. Encha um copo de 1 L com água destilada e colocá-lo no microondas.
        NOTA: A água vai "tampão" o calor quando se realiza desmascaramento.
      2. Colocar as lâminas em solução de recuperação antigênica dentro do microondas. Ferva desliza em potência alta por 5 min. Imediatamente após amostras pararam de ebulição, calor desliza novamente em alta potência para extra de 5 min.
      3. Esfriar lâminas à temperatura ambiente.
        NOTA: passo crítico: ebulição duração e procedimento deve ser determinada pelo utilizador, dependendo das características de micro-ondas. Quanto mais rápido a ebulição começa maiores as chances de solução de evaporação. Neste caso recomenda-se que as amostras são fervidas durante períodos de tempo mais curtos do que mais duas vezes para completar um tempo de desmascaramento total de 10 min. Pelo contrário, se o aquecimento realizado a potência média ou baixa, desmascaramento pode ser realizada uma vez durante 10 min. No entanto, se as amostras não ferver continuously para um total de cerca de 10 min, isto pode resultar em desmascaramento parcial de ambos os ARN alvo e proteína a ser detectada.
    4. Lave as lâminas três vezes com PBS 1x.
    5. Adicionar 2-3 gotas (~ 100? L) de sonda dapB definida como aquelas fatias do cérebro utilizadas para avaliar a coloração de fundo. Nota: O conjunto de sonda dapB tem como alvo um gene bacteriano e não deve reconhecer qualquer RNA mamíferos.
    6. Adicionar 2-3 gotas de direccionamento a sonda definida como aquelas fatias do cérebro utilizadas para detectar o ARN de interesse. Nota: um conjunto de sondas alvo resíduos de 20 - 1381 do rato ATF4 ARNm é utilizado neste exemplo.
    7. Lâminas de cobertura com parafilme para evitar a evaporação da sonda, colocá-los na caixa de slides umidificado dentro do forno de hibridação e incubar-los a 40 o C durante 2 horas.
      NOTA: OPCIONAL: fatias de cérebro adicionais podem ser hibridados com um conjunto sonda segmentação do mouse Polr2A e utilizados como controlos positivos.
    8. Wash SLIdes duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    9. Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 1-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação.
    10. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    11. Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 2-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação.
    12. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    13. Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação de AMP 3-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação.
    14. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    15. Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 4-FL para cada fatia do cérebro, cobrir slides com parafilme, colocá-los noCaixa de lâminas e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação.
    16. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente e duas vezes com PBS 1x.
    17. Adicionar 100-200 ul (ou volume suficiente para cobrir completamente as fatias) de uma solução de bloqueio contendo 3 mg / ml de BSA, 100 mM de glicina e 0,25% de Triton X-100 em PBS (pH 7,4) às lâminas, cobri-los com parafilme e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
    18. Adicionar 100-200 ul de anticorpo anti-ChAT em ​​solução diluída (1/100) para as lâminas de bloqueio, cobri-los com parafilme e incubar durante 2 dias a 4 o C. Certifique-se de que fatias de cérebro não sequem. Se necessário, re-aplique a solução de anticorpo anti-chat para fatias de cérebro de 24 horas após a incubação.
    19. Lave as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente.
    20. Adicione 100-200 ul do anticorpo secundário Alexa conjugado apropriado (. Por exemplo, Alexa-594 burro anti-cabra para este exemplo particular) para os slides, cubra com filme plástico e incubcomeu durante 1 h à TA.
    21. Lave as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente.
    22. Lavagem das lâminas uma vez com água destilada.
    23. Mount slides com meio de montagem contendo DAPI.
    24. Visualize fatias de cérebro sob um microscópio de fluorescência.

2. Detecção de ATF4 mRNA localizado para axônios em amostras de cérebro usando Chromogenic Hibridização In Situ (CISH) Seguido por Luxol rápido azul e violeta Cresyl contracoloração

  1. A preparação da amostra para amostras de cérebros humanos embebidos em parafina e fixados em formalina
    1. Fatias Asse em forno seco a 60 ° C durante 1 hora.
    2. Desparafinar fatias de cérebro em um exaustor.
      NOTA: CUIDADO: Os reagentes são tóxicos e deve ser manuseado e descartado seguindo as diretrizes de segurança apropriadas
      1. Imergir as lâminas em xileno agente de compensação alternativa duas vezes durante 10 minutos.
      2. Imergir as lâminas em etanol a 100%, duas vezes durante 1 min.
      3. UMAIR-seco fatias 5 min à TA. NOTA: Como alternativa amostras pode ser seco a temperatura ambiente O / N, mas deve ser utilizada dentro de 24 horas.
  2. Diaminobenzidina (DAB) à base de ensaio ISH cromog�ico seguido por Luxol rápido mancha azul violeta e cresyl usando induzida protease-induzida pelo calor e RNA desmascaramento
    1. Antes de começar preparar os materiais necessários:
      1. Aqueça o forno de hibridação a 40 ° C e colocar num tabuleiro contendo água destilada para criar um ambiente humidificado.
      2. Pegue uma caixa de slides e colocar toalhas de papel embebido em água destilada para dentro para umidificar a caixa de slide. Coloque a caixa de slides no forno de hibridização.
      3. Prepare 1x Pretreat 2 por diluição da solução estoque 10x (incluídos no kit de reagentes CISH) em água isenta de RNase ou tratada com DEPC. Se o pré-tratamento é realizado em uma placa quente, adicionando 100 ml de solução de pré-tratamento para um prato de 100 mm de diâmetro de vidro para aumentar a superfície de contacto entre o prato e a placa quente (pré-tratamento seé realizada em um forno de microondas, um frasco Coplin pode ser usado em vez conforme especificado no ponto 1.2.3). Solução de aquecimento para 100 ° C e mantê-lo não mais de 30 min a ferver antes de submergir amostras.
      4. Calor sondas positivos e negativos 10 min a 40 o C e arrefecer à temperatura ambiente.
      5. Equilibrar reagentes de amplificação AMP 1-6 (incluídos no kit de reagentes CISH) à TA.
      6. Preparar o tampão de lavagem 1x diluição da solução estoque 50x (incluído no Kit de Reagentes CISH) em água destilada. Nota: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 1 mês e ser utilizado para a coloração futuro.
    2. Adicionar ~ 4 gotas (~ 120 ul) de um Pré-tratar a cada fatia de cérebro, cobrir com parafilme e incubar à TA durante 10 min.
    3. Lavar 3 a 5 vezes em água destilada fresca.
    4. Execute desmascaramento induzida pelo calor:
      1. Lâminas de transferência para quente Pretreat 2 (incluído no Kit de Reagentes CISH) de solução e deixe ferver por 15 minutos. Nota: Ebulição pode ser executada em um prato quente assegurandoebulição contínua ou em um forno seguindo os passos críticos especificados no ponto 1.2.3).
    5. Imediatamente transferir lâminas para água destilada e lava-se 3-5 vezes.
    6. Lavagem das lâminas de 3 a 5 vezes em fresco etanol a 100%.
    7. Fatias de ar seco 5 min a RT. Nota: Em alternativa pode ser seco fatias O / N.
    8. Realizar desmascaramento induzida por protease:
      1. Adicionar 4 gotas de 3 Pré-tratar (incluído no Kit de Reagentes CISH), cobrir com parafilme e incubar 30 min a 40 ° C no forno de hibridação.
    9. Lavagem das lâminas de 3 a 5 vezes em água destilada fresca.
    10. Adicionar 4 gotas da sonda dapB definido para essas fatias do cérebro utilizadas para avaliar a coloração de fundo.
    11. Adicionar 4 gotas da sonda alvo definido para essas fatias do cérebro utilizadas para detectar o ARN de interesse.
      NOTA: Um conjunto de sonda alvo resíduos de 15 - 1256 do ATF4 ARNm humano é utilizado neste exemplo. OPCIONAL: fatias de cérebro adicionais podem ser hybridized com um conjunto de sonda alvo PPIB humano e utilizado como controle positivo.
    12. Colocar as lâminas na caixa de corrediça e incubar durante 2 horas. a 40 ° C no forno de hibridação.
    13. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    14. Adicionar 4 gotas de AMP um reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação.
    15. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    16. Adicionar 4 gotas de AMP 2 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação.
    17. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    18. Adicionar 4 gotas de reagente de AMP 3 para cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação.
    19. Lavagem das lâminas duas vezes com 1x erah tampão durante 2 minutos à TA.
    20. Adicionar 4 gotas de AMP 4 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação.
    21. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    22. Adicionar 4 gotas de AMP 5 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme e incubar 30 min a RT.
    23. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    24. Adicionar 4 gotas de AMP 6 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme e incubar 15 min a RT.
    25. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente.
    26. Misturar um volume igual de BROWN-1 e BROWN-2 reagentes (incluído no Kit de Reagentes CISH), adicione ~ 120 ml de solução para cada fatia do cérebro, cubra com parafilme e incubar 10 minutos à temperatura ambiente.
    27. Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente e enxaguar uma vez em água destilada.
      NOTA: As etapas críticas: as seguintes etapas são fundamentais paraobter uma contracoloração axonal óptima sem mascarando a presença de grânulos de ARN.
    28. Antes de executar counterstain verificar a presença de mRNA de interesse sob um microscópio de campo claro. Definir zonas de referência em amostras de cérebro nas quais a monitorizar a presença de pontos lacrimais durante todo o procedimento de contraste.
    29. Pré-aqueça o Luxol rápido solução de azul a 60 o C.
    30. Colocar as lâminas em Luxol azul rápido e incubar 30 min a 60 o C.
    31. Lavar várias vezes em água destilada.
    32. Dip slides para várias vezes em solução de carbonato de lítio 0.05% para iniciar a diferenciação.
    33. Dip desliza duas vezes em fresco etanol a 75%.
    34. Enxágüe em água destilada.
    35. Verifique fatias de cérebro sob um microscópio de campo claro. Note-se que a matéria cinzenta e branca deve começar a ser distinguíveis grânulos e RNA ainda visíveis como azul escuro / puncta preto. Verifique se axónios começam a aparecer como fibras de luz azul.
    36. Repita os passos 2.2.28 a 2.2.32. Perform incubações com Luxol solução de azul rápido em 10-20 mínimo de etapas, acompanhando atentamente a counterstain ea presença de grânulos de RNA. Nota: Tipicamente, contracoloração óptima é adquirido em 60 - 90 minutos (tempo total de incubação), mas o tempo pode ser encurtado se suspeita-se que os grânulos de ARN pode ser mascarado pela Luxol rápido mancha azul (ver Figura 2 para os exemplos).
    37. Incubar as lâminas em solução de violeta de cresilo, durante 10 min à TA.
    38. Lavar as lâminas em água destilada.
    39. Dip slides para 5 a 10 vezes em etanol a 70%.
    40. Desidratar fatias do cérebro através de 3 mudanças rápidas de etanol a 100%.
    41. Numa hotte, fatias de cérebro claras através da incubação de duas vezes em xileno agente de remoção alternativa, durante 2 minutos e uma terceira vez durante 5 min à TA.
    42. Mount fatias cerebrais em meio de montagem permanente à base de xileno.
    43. Analisar amostras sob um microscópio de campo claro.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma breve resumo dos procedimentos descritos acima é mostrado na Figura 1.

Detecção óptima de mRNA ATF4 grânulos em axónios colinérgicos usando desmascaramento induzida por calor

Ao avaliar a localização axonal de ARNm, que é crítico para ser capaz de identificar os axónios e para ser capaz de visualizar baixas RNAs abundantes. A tecnologia de ARN ISH aqui descrito permite a detecção de RNAs com uma resolução de uma única molécula. Os pr...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste relatório, descreve-se a utilização de uma tecnologia de ISH alta-resolução na detecção de axonally localizada ATF4 ARNm. Estes estudos anteriores publicados e mostram que esta tecnologia é compatível com a detecção de proteína à base de anticorpo em tecidos de embriões inteiros ou mesmo 33. É importante notar que foi recentemente usada para a detecção de ARNm dentro do arco dendrites dos neurónios do hipocampo 34. Também podem ser combinados com corantes para a coloração hi...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Alzheimer's Association (NIRG-10-171721; para U.H.), Instituto Nacional de Saúde Mental (MH096702; para U.H.), Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NS081333; para C.M.T.), e prêmios de estudo piloto do Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer financiado pelo Instituto Nacional de Envelhecimento da Universidade de Columbia (AG008702; para J.B. e Y.Y.J.), que também apóia o Banco de Cérebros de Nova York. Agradecemos aos membros do laboratório Hengst pelos comentários e discussões

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
sonda personalizada direcionada aos resíduos 20-1.381 do camundongo Atf4 mRNA (NM_009716)Diagnóstico Celular Avançado-sonda
personalizada direcionada aos resíduos 15-1.256 do < humano i>< / i> mRNA (NM_001675.2)Diagnóstico Celular Avançado-sonda
de controle negativo - DapBDiagnóstico Celular Avançado310043sonda
sonda de controle positivo-camundongo Polr2A (opcional)Diagnóstico Celular Avançado312471sonda
controle positivo sonda PPIB humano (opcional)Diagnóstico Celular Avançado313901sonda
RNAscope Kit de Reagente Multiplex Fluorescente (para detecção de fluorescência)Diagnóstico Celular Avançado320850in situ kit
de hibridizaçãoKit de reagentes RNAscope 2.0 HD - MARROM (para detecção cromogênica)Diagnóstico Celular Avançado310035in situ kit de hibridização
Anticorpo anti-ChAT policlonal de cabraMilliporeAB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain KitAmerican MasterTechKTLFB
Clearify agente de limpeza (substituto de xileno)American MasterTechCACLEGAL
Montagem ProLong Gold com suporte DAPILife TechnologiesP36935
DPX Sigma6522
de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506(2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079(2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55(2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

Artigos relacionados