A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Resumo

Há uma falta geral de conhecimento sobre como as vacinas funcionam. Aqui, propomos o uso combinado de genética reversa e camundongos quiméricos da medula óssea para obter informações sobre as respostas imunes iniciais do hospedeiro às vacinas, com foco especial nas células dendríticas e na imunidade das células T.

Resumo

As vacinas são uma das maiores conquistas da humanidade e salvaram milhões de vidas no último século. Paradoxalmente, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos que medeiam as respostas imunes às vacinas, talvez devido ao sucesso geral da vacinação, que reduziu o interesse nos mecanismos moleculares e fisiológicos da imunidade vacinal. No entanto, vários patógenos humanos importantes, incluindo o vírus influenza, ainda representam um desafio para a vacinação e podem se beneficiar de estratégias imunológicas.

Embora a genética reversa da gripe tenha sido aplicada com sucesso à geração de vacinas vivas atenuadas contra influenza (LAIVs), a adição de ferramentas moleculares em preparações vacinais, como componentes traçadores para acompanhar a cinética da vacinação in vivo, não foi abordada. Além disso, a recente geração de modelos de camundongos que permitem a depleção específica de leucócitos durante estudos cinéticos abriu uma janela de oportunidade para entender os mecanismos imunológicos básicos subjacentes à proteção induzida pela vacina. Aqui, descrevemos como a combinação de genética reversa e modelos quiméricos de camundongos pode ajudar a fornecer novos insights sobre como as vacinas funcionam nos níveis fisiológico e molecular, usando como exemplo uma vacina contra influenza viva atenuada (LAIV) recombinante, adaptada ao frio e viva. Utilizamos LAIVs gerados em laboratório que abrigam traçadores celulares, bem como quimeras competitivas da medula óssea (BMCs) para determinar a cinética inicial da imunidade vacinal e os principais mecanismos fisiológicos responsáveis pelo início da imunidade adaptativa específica da vacina. Além disso, mostramos como essa técnica pode facilitar estudos de função gênica em animais únicos durante as respostas imunes às vacinas. Propomos que esta técnica possa ser aplicada para melhorar as estratégias profiláticas atuais contra patógenos para os quais são necessárias contramedidas médicas urgentes, por exemplo, influenza, HIV, Plasmodium e vírus da febre hemorrágica, como o vírus Ebola.

Introdução

A geração de memória imunológica, na ausência de doença é a base fisiológica de vacinação eficiente ^1. Recentemente, sistemas de abordagens baseadas em biologia têm revelado que as vacinas de sucesso, como a vacina contra a febre amarela, induzir uma forte indução de resposta imune inata e ativação de vários subconjuntos de células dendríticas (DCs), que por sua vez, levam a multilinhagens ativação de antígeno células T específicas ^2,3. Uma vez que as DCs são a única população de células imunitárias, com a capacidade para activar células T ingénuas específicas de antigénio ^4, o estudo da sua função durante a vacinação é fundamental para compreender as respostas imunitárias a vacinas e para conceber estratégias futuras contra patógenos desafiantes.

Um sistema que permite o rastreio de diferentes subconjuntos DCs durante as respostas imunitárias a vacinas seria desejável, a fim de estabelecer uma cinética precisas de migração DC para tecidos linfóides, e, por conseguinte, para fornecerinsights sobre os mecanismos fisiológicos responsáveis ​​pela iniciação da imunidade adaptativa específicas de vacina. Com base genética inversa abordagens oferecem a possibilidade de gerar modificado, as vacinas vivas atenuadas que podem ser utilizadas experimentalmente com esta finalidade. Desde sua implantação, em investigação sobre a gripe, genética inversa à base de plasmídeo tem sido amplamente utilizada para gerar linhagens recombinantes de gripe, incluindo LAIVs. Os protocolos padrão para resgatar os vírus influenza recombinantes requerem multi-transfecção de linhas celulares altamente transfectáveis ​​com plasmídeos que produzem ambisense (tanto positivo como negativo de ARN senso) contendo os segmentos virais oito da gripe, bem como um sistema de amplificação no permissiva tais como Madin-Darby de rim canino ( ) células MDCK e / ou frango ovos embrionados ^5. No entanto, a aplicação da genética reversa para gerar ferramentas moleculares para o estudo dos mecanismos imunológicos das vacinação permanece inexplorado.

A geraçãode novos modelos de ratos, permitindo a depleção específica de subconjuntos de células imunes, incluindo CDs, abriu novas possibilidades para compreender os mecanismos imunológicos básicos subjacentes proteção provocada por vacina. A comparação entre as funções de subconjunto DC em camundongos e humanos revelou que, em grande medida, mouse e DCs humanas são funcionalmente homóloga ^6,7, estes resultados sugerem fortemente que o desenvolvimento de modelos de mouse que permite a depleção específica de DCs no estado estacionário e durante condições inflamatórias, pode servir para entender a fisiologia das respostas DC em seres humanos. Nos últimos anos uma série de modelos de ratos têm sido gerado transportando transgenes que expressam o receptor da toxina da difteria de símio (DT) (DTR) sob o controlo da região do promotor de um gene de interesse ^8,9. Desde tecidos de ratinho não expressam naturalmente DTR, estes modelos permitem esgotamento condicional de subconjuntos de células que carregam o gene alvo de interesse sobre inoculação em camundongos com DT. Assim, a nossa ability para esgotar as DCs específicas e outros leucócitos in vivo durante processos fisiológicos, foi grandemente melhorada pelo desenvolvimento de ro baseado no DTR. No entanto, enquanto estes modelos de ratinhos transgénicos têm sido amplamente utilizados para compreender a ontogenia do sistema imunitário, a sua aplicação para o desenvolvimento de vacinas tem sido pouco testada. Aqui, através da combinação de gripe genética reversa e quimeras de medula óssea competitivos baseados em DTR, propomos um método para estudar a cinética de imunidade da vacina, bem como a função do gene individual durante as respostas imunes às vacinas in vivo. A aplicação desta tecnologia para a avaliação pré-clínica de novas vacinas contra doenças infecciosas desafiadoras poderia ajudar a racionalizar o desenho da vacina e para testar vacinas candidatas in vivo.

Protocolo

Experimentos em animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados e seguir as orientações da lei alemã de protecção animal. Todos os funcionários que realizam experiências com animais passaram programas de treinamento de acordo com a categoria B ou C da Federação das Associações Europeias de Ciências Animais de Laboratório.

1. Geração de recombinante vivo atenuado Vacinas contra Influenza por genética reversa

NOTA: O protocolo detalhado para a geração de vírus influenza recombinantes por genética reversa foi descrito em estudos anteriores ⁵ e está fora do âmbito do presente relatório. Resumidamente, resgate de vacinas contra a gripe adaptados ao frio (CAV) é feito em um armário de biossegurança classe II sob nível de biossegurança 2 contenção (BSL2), e envolve etapas detalhadas abaixo. O protocolo de transfecção e a infecção resulta que de Martinez-Sobrido et al. ^5.

1. Gerar um influenza adaptada ao frio reassortantvacina utilizando como fundo do adaptado ao frio estirpe A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), bem como a hemaglutinina (HA) e neuraminidase uma modificado (AN) da A / PR / 8/34 (H1N1), a linhagem A ( Figura 1A). A alteração no gene de NA consiste de uma substituição com base em PCR de uma sequência conservada no talo proteína (resíduos 65-72) por uma sequência de ADNc que codifica a curto ovalbumina de galinha (OVA) péptido -derived SIINFEKL (Figura 1B). O péptido SIINFEKL é um péptido altamente imunodominante no contexto do MHC de classe H-2b resposta de ratinhos C57BL / 6 ¹² I-restringida.
2. Placa 10 ⁶ 293T células por poço em placas de 6 poços, usando DMEM 10% de soro fetal de bovino (FBS), suplementado com 1% de penicilina / estreptomicina (P / E).
3. Prepare a mistura de transfecção de plasmídeo: Adicione 1 ug de cada um dos plasmídeos que codificam para os ADNc de PB2, PB1, PA, NP, M, NS de influenza A / Ann Arbor / 6/60 e uma estirpe ug dos plasmídeos que codificam para o NA -SIINFEKL eHA de influenza A / PR / 8/34. Adicionar pré-aquecido OptiMEM (15 ul, para um volume final de 100 ul / poço).
4. Incubar mistura de transfecção durante 30 min à TA.
5. Adicionar 100 ul da mistura de transfecção / cavidade e incubar durante 16 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.
6. Mudar meio celular por DMEM 0,3% BSA 1% P / L a 33 ° C e 5% de CO ₂ durante 5 h.
7. Adiciona-se 10 ⁶ influenza células MDCK permissivas em DMSO contendo 1 ug / ml de tripsina de pâncreas de bovino tratada com L-1-tosilamida-2-feniletil-clorometilcetona (TPCK-tripsina). Manter as co-culturas 293T-MDCK para 2-3 dias a 33 ° C e 5% de CO _2.
8. Recolher os sobrenadantes de células MDCK-293T co-culturas e clara por centrifugação a 260 xg durante 5 min.
9. Inocular 9 - galinha 10 dias de idade, ovos embrionados em condições estéreis. Para fazer isso, fazer um furo na parte superior da casca do ovo, tal como indicado por Martinez-Sobrido et ai. ^5.
10. Cubra a sagacidade casca de ovoh cera derretida usando um cotonete de algodão e incubar os ovos de galinha inoculadas durante 3 dias a 33 ° C.
11. Colher o fluido alantóico dos ovos embrionados infectados: Lavam-se as cascas com etanol a 70%. Abra o ovo com uma rachadura muito suavemente na parte superior e remover a membrana alantóide usando uma pinça estéril. Use uma pipeta de 10 ml para recolher tanto líquido quanto possível (tipicamente 6-10 ml). Centrifuga-se a 260 xg durante 10 min a 4 ° C e transferir o fluido alantóico foi afastada para novos tubos.

Imunidade 2. Rastreamento vacina específica-

1. Rastreamento de células dendríticas portadores de péptidos (DCs)
   1. Para a vacinação rato, anestesiar ratos com 5% de isoflurano em oxigênio, utilizando um vaporizador de precisão. Usar uma pipeta de 200 uL para administrar 50 uL de PBS contendo 10 ³ unidades formadoras de placas (pfu) da vacina expressando o ptido SIINFEKL através de gotículas directamente para as narinas do rato.
   2. Três dias após a vacinação, euthanize ratinhos através de anestesia de isoflurano, seguido por deslocação cervical.
   3. Levante a pele do rato na linha média, logo abaixo da caixa torácica com uma pinça e cortar uma pequena incisão através da pele com uma tesoura. Do ponto de incisão, fazer um 3-5 cm de comprimento cortar através da pele em direção a cabeça eo rabo, em seguida, duas incisões de 2 cm da linha média lateralmente a partir de cada extremidade. Retire a pele para revelar as cavidades peritoneal e torácica. Cuidadosamente cortar através das membranas que rodeiam o peritoneu para expor o tórax.
   4. Para aceder ao mediastino cortar o diafragma e a parte inferior da caixa torácica. Encontrar e remover dois gânglios linfáticos do mediastino (MLNS), ligeiramente dorsal e lateralmente ao lado do timo, medially adjacente à artéria braquiocefálica, perto do lado ventral da traquéia.
   5. Para colher os MLNS usar uma pinça curva. Coloque uma pinça debaixo dos gânglios linfáticos e puxá-los para cima suavemente. Coloque gânglios linfáticos em uma placa de 6 poços contendo 1 ml de DMEM e remover quaisquer connective ou tecido gordo em torno do nó.
      1. Amole cada amostra cuidadosamente com duas agulhas 26 G ligados a seringas de 1 ml. Para provocar o linfonodo, segure-a com uma agulha ao quebrar aberto o linfonodo com a outra agulha. Quando isso for feito corretamente, as células concentradas estourando a partir do nó de linfa são facilmente observado na mídia. Passe todo o material de tecido através de um filtro de nylon de 70 mm para obter suspensões de células individuais.
   6. As suspensões de células únicas de centrífuga de 10 min a 260 xg numa centrifugadora refrigerada. Ressuspender o sedimento celular em 2 ml de glóbulos vermelhos de Lise (RBCL) Tampão para lisar as células vermelhas do sangue. Permitir que a lise continuar durante 3 minutos à temperatura ambiente.
   7. Neutralizar RBCL tampão através de centrifugação e ressuspensão de células em 2 ml de PBS gelado.
   8. Células da placa em forma de U-placas de 96 poços a uma concentração de 10 ⁷ células / ml num volume final de 100 ul.
   9. Para análise de citometria de fluxo, de células bloco Fc-receptores usando1 ug de anticorpos CD16 / CD32 anti-rato por 10 ⁶ células durante 15 minutos em gelo.
   10. Placas de centrífuga e descartar sobrenadantes por placa passar rapidamente. Incubar poços individuais com a combinação de anticorpo superfície de escolha. Normalmente para a detecção de células dendríticas em nódulos linfáticos, o cocktail de anticorpos deve incluir: 0,25 ug de anticorpos anti-CD11c, 0,25 ug de CD11b, 0,5 ug de MHC de classe II, 0,25 ^ g de CD103 e 0,15 ug de CD8a em um volume final de 100 ul.
   11. Para gating negativo, adicionar 0,25 ug de anticorpos anti-CD3, CD19, ou NK1.1 uma linhagem de cocktail (Figura 2A). Estratégias de propagação alternativas, bem como os protocolos para uma compensação adequada de vários corantes fluorescentes podem ser encontradas no site do Projeto Genoma imunológica. Para além dos marcadores de superfície de escolha, adicionar 1 ug de um anticorpo contra H-2K ^b obrigado a SIINFEKL para o cocktail. Este anticorpo disponível comercialmente irá permitir a visualização de DCs in que o péptido SIINFEKL é ligado à superfície de MHC de classe I.
   12. Incubar as células com anticorpos de superfície durante 30 minutos em gelo. Proteja placa da luz. Placas de centrifugar a 260 xg durante 5 minutos e lavar com 2 ml de PBS, duas vezes. Células transferir para tubos de citometria de fluxo para análise.
2. Avaliação de proliferação de células T específicas de vacina
   1. Obtenção de células T dadoras de ratinhos disponíveis comercialmente TCR transgénica (murganhos OT-I) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) em que todas as células T CD8 + geradas são específicos para o péptido SIINFEKL. Eutanásia ratinhos por anestesia com isoflurano seguido por deslocação cervical. Colheita do baço através da realização de uma incisão na cavidade abdominal. Coloque baço / s em 2 ml de DMEM / baço e remover tecido conjuntivo e gordura.
   2. Gerar suspensões de células individuais de baço a seguir o procedimento descrito no 2.1.2 e 2.1.3.
   3. Para enriquecer ainda mais a suspensão de células individuais em células T, se aplicam os protocolos de separação de esférulas magnéticasutilizando tanto os procedimentos de selecção positiva ou negativa ^12. Para diferenciar doador de células receptoras, utilize ratos cong�icas de modo que, por exemplo, ratinhos receptores expressar a CD45.1 marcador de leucócitos, enquanto as células T do doador expressar CD45.2 ^12.
   4. Para identificar as células T, incubá-las em 1 ml de PBS contendo 5 uM de éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) numa densidade celular óptima de 5 x 10 ⁶ células / ml. Incubar as células durante 20 min a 37 ° C, protegido da exposição à luz. Após a incubação, as células de centrifugação a 260 xg durante 5 min, o sobrenadante de descarte, e ressuspender as células em 3 ml de soro fetal de bovino (FBS) para neutralizar CFSE.
   5. Células centrifugar a 260 xg durante 10 min e ressuspender em o volume adequado de PBS de modo a que 100 uL de solução contém 2 x 10 ⁶ células. Infundir beneficiários ratos cong�icas com 2 x 10 ⁶ células / rato via retro-orbital injeção sinusal ^13.
   6. Euthanize ratos receptores nos dias 3, 4 e 5 de pós-vacinação utilizando anestesia de isoflurano, seguido por deslocação cervical. Colher gânglios linfáticos do mediastino e preparar suspensões de células individuais para citometria de fluxo, tal como indicado na 2.1.2-2.1.5.
   7. Identificar células dadoras por coloração das suspensões de células individuais em 100 uL de um cocktail contendo anticorpos: 0,25 ug de anticorpos, CD4 e CD8 anti-ratinho CD3; 0,5 ug de anti-murganho ou anticorpo CD45.1 CD45.2 (dependendo do fenótipo das células do doador). Deixar o canal FL-1 do citómetro de fluxo aberto (FITC) para determinar o perfil de diluição CFSE ¹² (Figura 2B).

3. ratos quiméricos para dissecar Responses vacina específica do gene

NOTA: A geração de quimeras de medula óssea competitivos utilizando modelos de rato com base em DTR permite a discriminação de funções específicas de células durante a resposta imune às vacinas. Aqui nós mostramos uma estratégia adicional pelo qual combinação de DTR-expressando doador cells com células de ratos knockout licenças para estudar funções específicas de genes durante a imunidade em compartimentos celulares específicos. No exemplo que geramos camundongos com deleção específica de receptor toll-like 3 (TLR3) em Langerina ⁺ CD103 ⁺ DCs.

1. Preparação de células de medula óssea dadoras
   1. Trabalhar sob um armário de biossegurança nível II. Evitar a contaminação por meio de instrumentos exclusivamente autoclavados.
   2. Para gerar medula óssea ratos quiméricos, use CD45.1 congénica ⁺ camundongos C57BL / 6 do sexo feminino como destinatários, e usar TLR3 ^{- / -,} Langerina-DTR / EGFP, ou ratinhos wt expressar CD45.2 ⁺ como doadores. Utilizando murganhos dadores e receptores cong�icas permite a diferenciação de células dadoras e receptoras através de citometria de fluxo e isso permite que o enxerto a ser avaliada.
   3. Para a obtenção de células de medula óssea do dador, eutanásia ratinhos dadores com anestesia isoflurano seguido por deslocação cervical. Com uma tesoura afiada realizar incisões em torno dos tornozelos, de modo que o mmusculatura ouse está exposto.
   4. Utilizando uma pinça sem corte puxar a pele do rato e pele delicadamente do tornozelo em direção aos quadris de modo que os músculos das pernas são visíveis.
   5. Com uma tesoura afiada cortar rato pernas na altura dos quadris e acima da cabeça do fêmur.
   6. Coloque as pernas numa placa de Petri e em gelo. Trabalhar rápido e remover todos os músculos para expor os ossos.
   7. Fêmures e tíbias distintas. Inserir os ossos, numa solução de etanol a 70% durante 5 minutos para remover possíveis bactérias e colocá-los imediatamente na outra placa de Petri contendo 5 ml de DMEM isento de soro. Osso cortar termina usando uma tesoura afiada e lave a medula óssea para a DMEM. Para fazê-lo, descarga 1 ml de DMEM para dentro do osso através da inserção de uma agulha de 26 G ligada a uma seringa de 5 ml. Certifique-se de que os ossos olhar branco (vazio) após a lavagem.
   8. Recolhe todas as células da medula óssea de ratos dadores em 10 ml de DMEM. Gerar suspensões de células isoladas a partir de células de medula óssea por passagem da colheita por meio de um filtro celular de 70? M.
   9. Clorelha suspensões de células únicas de células de medula óssea por centrifugação a 260 xg durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga refrigerada. Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de PBS. Destroem glóbulos vermelhos usando solução RBCL como descrito em 2.1.3 e 2.1.4.
   10. Contagem de células de medula óssea utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado. Avaliar a viabilidade celular por determinação de células mortas através de coloração com azul de tripano ^13. Idealmente, uma única produz animais cerca de 3 x 10 ⁷ células brancas do sangue / rato, com uma viabilidade de pelo menos 80%.
   11. No caso de quimeras totais de medula óssea, preparar TLR-3 ^- células doadoras ou em peso ^{- /.} A concentração óptima de células é de 2 x 10 ⁷ células / ml desde 2 x 10 ⁶ células em 100 ul de PBS vai ser utilizado para transplante. Se não for utilizada imediatamente, preservar células doadoras a -80 ° C, utilizando técnicas de congelação lenta e com FBS a 10% de DMSO. Para o modelo quimérico mista, misture pilhas Langerina-DTR-doadores e TLR3 ^{- / -} Células do doador em uma proporção 75:25. Prepara-se uma mistura de 75: 25 Langerina-DTR: em peso de células da medula óssea para gerar ratinhos de controlo.
2. Rato irradiação e transplante
   1. Irradiar camundongos fêmeas entre 6-8 semanas de idade em uma fonte de irradiador de césio-137. Dê camundongos duas doses de 550 rad 4 horas de intervalo. Irradiação de Split minimiza toxicidade hepática aguda e, portanto, reduz a letalidade do rato devido ao protocolo de irradiação.
   2. Após a irradiação, manter os ratos sob tratamento com antibióticos para duas semanas. Dar antibióticos com a água potável a 2,5 - 5 mg de Baytril / kg.
   3. 2-4 horas após a segunda irradiação, os ratinhos transplantados com células de medula óssea do dador, por via intravenosa. Realizar a injecção de células de dador através de retro-orbital injecção seio ¹³ e sob anestesia com isoflurano utilizando o volume máximo de 100 uL de PBS contendo 2 X 10 ⁶ células.
   4. Quatro semanas após o transplante, enxerto em avaliar uma amostra de 100ul de sangue periférico por citometria de fluxo utilizando uma máquina capaz de ler pelo menos duas cores. Para distinguir entre o dador e células de receptores de rádio-resistentes, disponíveis comercialmente usam CD45.1 marcado por fluorescência e anticorpos anti-ratinho CD45.2 utilizando diluições entre 1/100 e 1/200. O enxerto de células dadoras óptima deve ser de pelo menos 80% do total de células hematopoiéticas no sangue periférico.
3. Depleção de vacinação e direcionados
   1. Vacinar os ratos com a vacina contra influenza viva atenuada recombinante via intranasal. Para a vacinação rato, anestesiar ratos com 5% de isoflurano em oxigênio, utilizando um vaporizador de precisão. Usar uma pipeta de 200 uL para administrar 50 uL de PBS contendo 10 ³ unidades formadoras de placas (pfu) da vacina.
   2. Para gerar o modelo final do rato, o tratamento de ratinhos com 50 ng de DT diluída em 50 ul de PBS, intranasalmente. Administrar DT gota a gota, directamente para as narinas de ratinhos anestesiados, tal como descrito em 3.3.1. Tratar miCE com doses diárias que iniciam o tratamento no dia -2 antes da vacinação até o dia 2 pós-vacinação (Figura 3B).

Resultados

Geração de vacinas contra a gripe vivos atenuados recombinantes pode ser conseguida por transf ecção de plasmídeos que codificam os oito segmentos de vírus influenza, sob o controlo de promotores bidireccionais ^5. Uma vacina contra a gripe adaptada ao frio geralmente contém seis segmentos de uma estirpe adaptada ao frio, assim como a HA e NA da gripe de estirpe de escolha (por exemplo, H1N1) (Figura 1A). O princípio de frio adaptação baseia-se na replicação de vírus restrito a 33 ° C...

Discussão

Neste estudo, descrevemos como genética e modelos quiméricos ratinho inversa pode ser utilizada para elucidar os mecanismos fisiológicos e moleculares de imunidade induzida pela vacina. Genética reversa Influenza é estabelecida em muitos laboratórios e tem desempenhado um papel principal na compreensão patogênese da gripe, replicação e transmissão ^17. Um ponto-chave em nosso protocolo é resgate de vacinas contra a gripe adaptados ao frio que expressam epitopos estrangeiros. Embora a estratégia de introdução d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco&agudo; s Meio Eagle Modificado (DMEM 1x)	Gibco RL-Life Technologies	41965-039
OptiMEM	Gibco RL-Life Technologies	31985-047
Lipofectamina 2000	Invitrogen-Life Technologies	11668-027
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U / ml)	PAA	p11-010
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A2153
Ovos embrionados	Valo biomedia Gmbh
PBS (1x)	Sigma-Aldrich	D8537
70 μ Filtros de Nylon	M Greiner-Biorad	542-070
Tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBCL) 10x	BD Bioscience	555899
CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)	BD Pharmigen	553142
APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)	Biolegend	141605
PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)	BD Biosciences	553802
eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md / 114.15.2)	eBioscience	48-5321-82
Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1 / 70)	Biolegend	101216
PerCp / Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)	Biolegend	121416
PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)	eBioscience	12-0453-82
V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)	BD Bioscience	562130
PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)	eBioscience	46-0081-80
APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611)	Biolegend	100325
eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)	eBioscience	48-0041-80
CFSE Corante de proliferação	eBioscience	65-0850-85
Baytril 2.5%	Bayer	65-0850-85
Dymethil-Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Ovalbumina	Sondas moleculares	O23020
Toxina Diphteria (DT)	Sigma-Aldrich	D0564
Tripsina-TPCK	Sigma-Aldrich	T1426
BD FACsCanto II Citômetro de fluxo	BD Biosciences
FlowJo software de análise de células 9.5	Flowjo inc.
Mancha azul de tripano (0,4%)	Life technologies	T10282
Contador Automático de Células Countess	Invitrogen-Life Technologies	C10227