Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade de diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinho (ESC) para progenitores neurais permite o estudo dos mecanismos que controlam especificação neural, bem como a geração de tipos de células neuronais maduros para estudo posterior. Neste protocolo, descrevem um método para a diferenciação de ESC para progenitores neurais utilizando, cultura em monocamada sem soro. O método é escalável, eficiente e resulta num rendimento de ~ 70% de células progenitoras neurais dentro de 4-6 dias. Ele pode ser aplicado a partir de várias estirpes CES cultivadas sob uma variedade de condições. Progenitores neurais podem ser autorizados a diferenciar ainda mais em neurônios funcionais e glia ou analisados por microscopia, técnicas de citometria de fluxo ou moleculares. O processo de diferenciação é passível de microscopia de lapso de tempo e pode ser combinada com o uso de linhas de repórter para monitorizar o processo de especificação neural. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre a preparação de meios e optimização densidade celular para permitir que o processo abe aplicado a maioria das linhas de ESC e uma variedade de recipientes de cultura de célula.
Introdução
As células estaminais embrionárias são células pluripotentes derivadas do embrião com a capacidade de proliferar indefinidamente in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células dos adultos após reintrodução num embrião fase adequada (através da formação de uma quimera), injecção em hospedeiros singénicos ou imunocomprometidos (através da formação de um teratoma) ou in vitro sujeitos a estímulos apropriados 1. A diferenciação in vitro de células estaminais embrionárias de ratinho em linhagens neurais foi descrita pela primeira vez em 1995 e envolveu a formação de agregados multicelulares suspensão (c....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação de mídia
NOTA: O protocolo baseia-se na utilização de uma mistura de dois meios separados: DMEM / F12 suplementado com suplemento N2 modificado e Neurobasal suplementado com suplemento B27, tipicamente numa proporção de 1: 1.
- Prepara-se o suplemento N2 modificado por mistura dos componentes num tubo de 15 ml. Não vórtice ou filtrar este; misturar por inversão do tubo até a solução ficar clara.
- Iniciar pipetando 7,2 ml de DMEM / F12, em seguida adicionar 1 ml de 25 mg / ml de insulina (fez-se em 0,01 M de HCl) e misturar bem por inversão do tubo. É preciso um par de minutos até que a solução é clara. ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Nesta experiência, utilizou-se a linha de células de 14 46C, células estaminais embrionárias de ratinho com um endógeno Sox1-repórter GFP, para controlar a diferenciação neuronal. Utilizando esta linha celular, expressão de Sox1, um marcador para células progenitoras neurais, pode ser detectado por fluorescência verde. Chapeamento de densidade é um fator crítico para alcançar a diferenciação neuronal. Células estaminais embrionárias de ratinho foram plaqueadas em placas de 6 poços em diferentes densidades var.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo de diferenciação neural monocamada tem sido usado por mais de uma década 6. O protocolo é altamente eficiente, composto de meio definido, e feito de um sistema de monocamada que torna o sistema mais aplicável para pré-clínica (por exemplo, o rastreio de fármacos) usa. No entanto, existem alguns factores críticos que determinam a eficiência de diferenciação. Este artigo aponta esses fatores ea solução para cada obstáculo.
Densidade das células após o plaqueamen.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Work foi financiado por uma bolsa de estudos de Desenvolvimento e Promoção da Ciência e Tecnologia do Ministério da Educação da Tailândia para W.W. e doações da Tenovus e do Anonymous Trust para M.P.S.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Soro bovino fetal | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Meio neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Reagente de dissociação celular StemPro Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Suplemento, sem soro | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulina | Sigma | I6634 | Reconstituir com HCl estéril 0,01 M |
| Apo-transferrina | Sigma | T1147 | Reconstituir com água estéril |
| Progesterona | Sigma | P8783 | Reconstituir com etanol |
| Putrescina | Sigma | P5780 | Reconstituir com água estéril |
| Selenito de sódio | Sigma | S5261 | Reconstituir com água estéril |
| Fração de albumina bovina V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamina | Life Technologies | 25030-081 | Certifique-se de que está completamente dissolvido antes de usar, pois a glutamina é geralmente sedimentada |
| Gelatina | Sigma | G1890 | |
| Placa de cultura de tecidos de 6 poços | Thermo Scientific | 140675 | |
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Thermo Prato | da Scientific 142475 | |
| Thermo Scientific | 167008 | ||
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Solução de aminoácidos não essenciais | Life Technologies | 11140-050 | |
| Piruvato de sódio | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma | M7522 | |
| Fator inibidor da leucemia | preparado internamente como em Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI) | Sigma | D9542 | Proteger da luz |
| Mouse anti β Anticorpo IgG de tubulina III | Covance | MMS-435P | |
| Anticorpo IgG anti-rato marcado com fluorescência | Life Technologies | A31571 | Proteger da luz |
| 25 cm2 frasco de cultura de tecidos | Thermo Scientific | 156367 |
Referências
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
