Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

Edmund Ong; Catherine Cahill

doi:10.3791/52824

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Artigo de método

Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

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DOI:

10.3791/52824

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3 de julho de 2015

Edmund Ong¹^,² , Catherine Cahill¹^,²^,³

¹Department of Anesthesiology and Perioperative Care, University of California Irvine, ²Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, ³Department of Pharmacology, University of California Irvine

Neste artigo

Resumo

Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.

Resumo

O tráfego intracelular de receptores é uma coleção de processos complexos e altamente controlados. O tráfego de receptores modula a sinalização e a capacidade de resposta geral das células aos ligantes e é, por si só, influenciado por condições intra e extracelulares, incluindo a sinalização induzida por ligantes. Otimizado para uso com células cultivadas em monocamada, mas extensível a fatias de tecido flutuantes, este protocolo usa imunomarcação e análise de colocalização para rastrear alterações no tráfego de receptores intracelulares após intervenções crônicas/prolongadas e agudas, incluindo tratamento com drogas exógenas. Após o tratamento medicamentoso, as células são duplamente imunomarcadas para o receptor e para marcadores para os compartimentos intracelulares de interesse. A microscopia confocal sequencial é então usada para capturar fotomicrografias de dois canais de células individuais, que são submetidas a análise de colocalização computadorizada para produzir pontuações quantitativas de colocalização. Essas pontuações são normalizadas para permitir o agrupamento de réplicas independentes antes da análise estatística. Fotomicrografias representativas também podem ser processadas para gerar figuras ilustrativas. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfego de receptores induzidos.

Introdução

Receptores, especialmente receptores acoplados a proteína G (GPCRs), são rotineiramente tráfico intracelularmente, de e para a superfície da célula ^1. Estes processos complexamente orquestradas e rigidamente controlados ditar complementos de receptores disponíveis das células e regulam a atividade do receptor temporais, a dessensibilização, e ressensibilização ^2-4. Mais importante, estes processos são sensíveis a ambientes celulares, incluindo a actividade do receptor induzida por drogas ou inactividade. Isto é, as acções de ligandos nos receptores podem alterar o tráfico intracelular desses receptores, alterando desse modo a capacidade de respo....