Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

Resumo

Este protocolo é para a extração e concentração de proteína e DNA de biomassa microbiana coletada da água do mar, seguida pela geração de peptídeos trípticos adequados para análise proteômica baseada em espectrometria de massa em tandem.

Resumo

Tecnologias metaômicas, como metagenômica, metatranscriptômica e metaproteômica, podem ajudar na compreensão da estrutura e do metabolismo da comunidade microbiana. Embora poderosa, a metagenômica sozinha só pode elucidar o potencial funcional. Por outro lado, a metaproteômica permite a descrição do metabolismo e função in situ expressos de uma comunidade. Aqui descrevemos um protocolo para lise celular, isolamento de proteínas e DNA, bem como digestão e extração de peptídeos de células microbianas marinhas coletadas em uma unidade de filtro de cartucho (como a unidade de filtro Sterivex) e preservadas em uma solução de estabilização de RNA (como RNAlater). Em estudos proteômicos baseados em espectrometria de massa, a identificação de peptídeos e proteínas é realizada comparando espectros de massa em tandem de peptídeos com um banco de dados de sequências de nucleotídeos traduzidas. Incluir o metagenoma de uma amostra no banco de dados de pesquisa aumenta o número de peptídeos e proteínas que podem ser identificados a partir dos espectros de massa. Portanto, neste protocolo, o DNA é isolado do mesmo filtro, que pode ser usado posteriormente para análise metagenômica.

Introdução

Os microrganismos são onipresentes e desempenham um papel essencial nos ciclos biogeoquímicos da Terra ^1. Atualmente, existem inúmeras abordagens moleculares disponíveis para a caracterização de estrutura da comunidade microbiana e função. O mais comum é a análise do gene 16S rRNA sequ�cias amplificado por PCR a partir de ADN ambiental ^{2 - 4.} Uma desvantagem da análise do gene 16S rRNA é que ela só fornece informações sobre a identidade filogenética e estrutura da comunidade, com pouca informação sobre a função metabólica. Em contraste, abordagens como Metagenômica, metatranscriptomics e metaproteômica fornecer informações sobre a estrutura da....

Protocolo

1. Prepare Reagentes

1. Preparar a solução de extracção SDS-: M de Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, glicerol a 5%, EDTA 10 mM e SDS a 1%. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
2. Prepare os reagentes necessários para o banco de gel de poliacrilamida.
   1. Prepare a 1,5 M de Tris-HCl pH 8,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente.
   2. 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente.
   3. Prepare 10% SDS. Filtrar esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente.....

Resultados

Como demonstração, foi realizado o protocolo em duas amostras de água do mar coletadas da superfície e camada de clorofila máxima do oceano costeiro no Norte do Canadá. Enquanto no mar, 6-7 L de água do mar foi passado através de um 3 um GF / D pré-filtro, em seguida, as células microbianas foram recolhidos para uma unidade de cartucho de filtro de 0,22 um, seguindo o protocolo de Walsh et ai. ^20. As células foram imediatamente armazenadas numa solução de estabilização de ARN, até processamento poste.......

Discussão

Preservação das amostras é essencial para estudos metaproteomic e trabalho anterior demonstrou que uma solução de estabilização de ARN é um tampão de armazenamento útil para armazenar as células antes da extracção da proteína ^28. Idealmente, as amostras iria ser preservado in situ para negar mudanças na expressão de proteínas durante o manuseamento ^33,34. Na verdade, in situ têm sido desenvolvidas tecnologias de amostragem e de fixação, que permitem a recolha autónoma e preservaçã.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sterivex -GP 0,22 μ m unidade de filtro	Millipore	SVGP01050	Amostragem
RNAlater Solução de Estabilização	Ambion	AM7021	Amostragem
Tris	Bio Basic	77-86-1 ou TB0196-500G	Extração de Proteína / SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Extração de Proteína
SDS	Bio Basic	15-21-3	Extração de Proteína / SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Extração de Proteína
Glicerol	Fisher Scientific	56-81-5	Extração de Proteína
Filtro Amicon 10K	Millipore	UFC801024	Extração de Proteína
Metanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Precipitação de Proteína
Acetona	Fisher Scientific	67-64-1	Reagente
de Precipitação de Proteína MPC	Epicentro	mmP03750	Precipitação de DNA
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	Precipitação de DNA
Kit de ensaio Qubit dsDNA BR	Life Technologies	Q32850	Quantificação de DNA
Kit de ensaio de proteína Qubit	Life Technologies	Q33211	Quantificação de proteína
sacarose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrilamida	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoetanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Caleidoscópio Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrila	VWR	CABDH6044-4	In-gel Tripsina digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Tripsina digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Tripsina digest
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Tripsina digest
HPLC grau H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Tripsina digest
Iodoacetamida	Bio Basic	144-48-9	In-gel Tripsina digest
Tripsina	Promega	V5111	In-gel Tripsina digest
Protein LoBind Tube 1,5 ml	Eppendorf	22431081	In-gel Tripsina digest
2 ml frasco ROBO 9 mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	Digestão de tripsina em gel
Inserção do BM dos PP, nenhuma mola	Digestão do Em-gel da Tripsina	4025P-631	da vida Candian Life

do Ciência