Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Summary

A síntese de anticorpos monoclonais humanos é o primeiro passo em estudos destinados a desvendar os mecanismos fisiopatológicos das respostas imunes mediadas por auto-anticorpos. Desenvolvemos um protocolo para gerar anticorpos monoclonais de imunoglobulina G humana (IgG) recombinantes a partir de células B classificadas no sangue, incluindo isolamento de células B, clonagem de anticorpos e síntese in vitro.

Abstract

Encontrar novos métodos para gerar anticorpos monoclonais humanos é um campo de pesquisa ativo que é importante para as ciências básicas e aplicadas, incluindo o desenvolvimento de imunoterápicos. No entanto, as técnicas para identificar e produzir tais anticorpos tendem a ser árduas e, às vezes, o par de cadeias pesada e leve dos anticorpos é dissociado. Aqui, descrevemos um protocolo relativamente simples e direto para produzir anticorpos monoclonais recombinantes humanos a partir de células mononucleares do sangue periférico humano usando a imortalização com o vírus Epstein-Barr (EBV) e a ativação do receptor Toll-like 9. Com uma coloração adequada, as células B produtoras de anticorpos podem ser isoladas para posterior imortalização e expansão clonal. Os transcritos de anticorpos produzidos pelos clones de células B imortalizados podem ser amplificados por PCR, sequenciados como pares de cadeias pesadas e leves correspondentes e clonados em vetores de expressão de imunoglobulinas. Os anticorpos obtidos com esta técnica podem ser ferramentas poderosas para estudar respostas imunes humanas relevantes, incluindo autoimunidade, e criar a base para novas terapêuticas.

Introduction

O objetivo deste artigo é descrever em detalhe uma metodologia para gerar e caracterizar anticorpos monoclonais IgG humanas obtidas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC).

O interesse em estudar anticorpos humanos tem crescido em muitos campos diferentes de pesquisa. Em particular, muitos grupos de pesquisa estão interessados ​​na patologia causada por auto-anticorpos ^1-3. Clonámos e caracterizado auto-anticorpos patogénicos ^1. O estudo de auto-anticorpos podem ajudar a identificar as suas metas e desenvolver estratégias terapêuticas, por exemplo, utilizando anticorpos concorren....

Protocol

O consentimento informado foi obtido dos participantes do estudo. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional.

1. Isolamento de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC)

1. Centrifugar 25 ml de sangue heparinizado dos participantes a 900 xg durante 15 min, o mais rapidamente possível após a extracção de sangue. Se houver menos sangue, reduza os reagentes em conformidade. Execute todos os próximos passos em uma capa.
2. Transferir o soro para um tubo limpo. Ele pode ser usado em passos posteriores para a congelação de PBMC ou no caso de doentes auto-imunes, para testar a auto-anticorpos.
3. Diluir....

Results

O gate de triagem após coloração das células positivas de CD22 e IgG é mostrado na Figura 1 Nesta imagem da área das células duplamente positivas -. Células B produtoras de anticorpos IgG - é seleccionado para classificar todas essas células em um tubo separado. Na análise, cerca de 1% do total de PBMC correspondem a esta população positiva dupla. O número de células classificadas obtidos dependerá do número de células obtidas na secção 1.

Os diferentes resultados após 5 sem.......

Discussion

Neste texto, todos os passos para a geração de anticorpos IgG a partir de PBMC humanas são apresentados em detalhe. Este protocolo inclui algumas vantagens em relação às técnicas anteriormente publicados. Uma das vantagens é que o anticorpo produzido mantém as cadeias pesada e leve correspondentes ao par original no clone de células B. A identificação de anticorpos IgG pode ser feito em qualquer tipo de dador humano, e não há necessidade de exacerbação da resposta imunitária devido à vacinação ^5. A utilização.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histopaque-1077	Solução Sigma-Aldrich	10771	contendo polissacarose e diatrizoato de sódio
FACSAria II classificador de células	BD Biosciences
96 placas de micro poço de fundo em U	Costar	3799
Instituto Memorial Avançado de Roswell Park (RPMI) 1640 médio	Gibco, Life Technologies	12633-020
30% v/v sobrenadante contendo EBV da linha celular B95-8	ATCC	CRL-1612	3.4 x 108 cópias/ml
CpG2006	Células Wi38 ODN	7909
	Sigma-Aldrich	90020107
Interleucina-2	Roche
placas ELISA	Greiner Bio-One, Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragmento Específico (não conjugado)	Jackson ImmunoResearch	109-006-008
4% de leite em pó desnatado (Bloqueador de Grau Blotting)	Biorad	170-6404
IgG Humano	Sigma	I 2511	Imunoglobulina purificada por IgG HUMANA, 5,6 mg/ml
Cabra F(ab)2 IgG anti-humana Fcγ (conjugado com peroxidase (PO))	Jackson ImmunoResearch	109-036-008
Leitor ELISA (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	2030-0050
IgM Anti-Humano AffiniPure Rabbit conjugado com peroxidase, Fc5µ	Jackson ImmunoResearch	309-035-095
Sistema de Síntese Direta de cDNA de Células SuperScript III	Invitrogen	18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700	Kit
	Kit	Roche 11828665001
	Promega	A3500
Taq DNA Polimerase Taq Recombinante	TAKARA	R001A
Primers (2 μ l)	Sigma
Ultrapure Agarose	Invitrogen	16500-500
100 bp ladder	Invitrogen	15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biorad	170-8100
QIAquick PCR kit de purificação	QIAGEN	28106
BigDye Terminator v3.1 kit de sequenciamento de ciclo	Applied Biosystems	4337455
placa de reação de 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-well)	Applied Biosystems	4346906
Analisador genético ABI300	Applied Biosystems	4346906
células competentes DH5α (E. coli)	Invitrogen	18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)	Invivogen	pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp)	Invivogen	pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3.875 bp)	Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3.883 bp)	Meio SOC Invivogen	pfuse2ss-hcll2
	Invitrogen	15544-034
Meio de ágar à base de LB suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)	Invivogen	fas-zn-s
Meio líquido à base de Terrific Broth (TB) suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo TB)	Invivogen	fas-zn-l
DNA Miniprep kit	Omega Bio Technology	D6942-02
Nanodrop (Espectrofotômetro ND1000)	Meio
LB suplementado com Blasticidina (Ágar Fast-Media Blast Agar)	Invivogen	fas-bl-s
Meio líquido à base de Caldo Fantástico (TB) suplementado com Blasticidina (Fast-Media Blast TB)	Invivogen	fas-bl-l
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	20.000 U/ml, em 10x NEBuffer EcoRI
NheI	New England Biolabs	R0131S	10.000 U/ml, em 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladder	New England Biolabs	N3200S	0.1-10.0 kb, 1.000 μ g/ml
XmaI	New England Biolabs	R0180S	10,000 U/ml, em 10x CutSmart Buffer
BsiWI	New England Biolabs	R0553S	10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII	New England Biolabs	R0174S	5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer
FastAP Fosfatase Alcalina Termossensível	Thermo Scientific	EF0651	1 U/µ l, em 10x FastAP Buffer
DH5α células competentes	Invitrogen	18263-012
PE Mouse Anti-Human IgG	BD Pharmingen	555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22	Fisher scientific	BDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106
BigDye Terminator v3.1	Applied Biosystems	4337455