Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Resumo

Ensaio enzyme-linked immunospot cultivadas interferão-γ longo termo é usado como uma medida das respostas de memória central e correlaciona-se com a resposta à vacina anti-micobacterianos de protecção. Com este ensaio, as células mononucleares de sangue periférico são estimuladas com antigénios micobacterianos e interleucina-2 durante 14 dias, permitindo a diferenciação e a expansão das células T de memória central.

Resumo

Células efetoras e T de memória são gerados através de programação do desenvolvimento de células naïve após o reconhecimento antígeno. Se a infecção é controlada até 95% das células T geradas durante a fase de expansão são eliminados (isto é., A fase de contracção) e células T de memória permanecem, por vezes durante toda a vida. Nos seres humanos, dois subconjuntos funcionalmente distintos de células T de memória têm sido descritos com base na expressão de receptores de homing de nódulos linfáticos. Células T de memória central expressar receptor de quimiocinas CC 7 e CD45RO e estão localizados principalmente em áreas de células T de órgãos linfóides secundários. Células T de memória Effector expressar CD45RO, falta receptores CCR7 e exibição associados com homing linfócitos para os tecidos periféricos ou inflamados. Células T efetoras não expressam ou CCR7 ou CD45RO mas no encontro com citocinas efetoras antígeno produto, como o interferon-γ. Ensaios de libertação de interferão-γ são utilizados para o diagnóstico da tuberculose bovina e humana edetectar principalmente efectora e respostas de células T de memória efectora. Memória da central de respostas de células T por células T CD4 ⁺ para a vacinação, por outro lado, pode ser usado para prever a eficácia da vacina, tal como demonstrado com a infecção pelo vírus da imunodeficiência símia de primatas não-humanos, tuberculose em ratinhos, e a malária em seres humanos. Vários estudos com ratos e seres humanos, bem como dados não publicados em gado, demonstraram que os ensaios ELISPOT de interferão-γ medir as respostas das células T de memória central. Com este ensaio, as células mononucleares do sangue periférico são cultivadas em reduzir a concentração de antigénio durante 10 a 14 dias (de longo prazo de cultura), permitindo respostas efectoras para o pico e diminuir; facilitando células T de memória centrais para diferenciar e expandir dentro da cultura.

Introdução

As células efectoras e T de memória são gerados através de programação de desenvolvimento de células T CD4 + naive após o reconhecimento do antigénio. A diferenciação das células T CD4 + naive em células produtoras de citoquinas requer o reconhecimento do patógeno pelas células imunes inatas, a apresentação do antigénio às células T, co-estimulação da transcrição e modificações que resultam na produção de citocinas polarizada. Por exemplo: as células apresentadoras de antigénio produzem interleucina (IL) -12 em resposta a agentes patogénicos intracelulares, os quais, em conjunto com o reconhecimento do antigénio, promove a diferenciação de células T em células T auxiliares 1 (Th1) ^1,2 células por sinalização através do transdutor e activador de sinal transcrição 4 (STAT4) e T box expressa em células T (T-bet), levando à activação das células, a produção de IL-2, a expansão clonal e interferão (IFN) produção -γ ^3,4. Se a infecção é controlada, até 95% das células T geradas durante a fase de expansão são eliminados (isto é, contracçãocélulas em fase) e T de memória permanecem, às vezes por toda a vida ^{5. 6} Sallusto et ai., Revelou dois subconjuntos funcionalmente distintos de células T de memória em humanos com base na expressão de receptores de homing de nódulos linfáticos. Células T de memória central (MTC) expressar receptor de quimiocinas CC (CCR) -7 e CD45RO e estão localizados principalmente em áreas de células T de órgãos linfóides secundários. Tcm têm limitado função efectora, de um limiar de baixa activação e reter elevada produção de IL-2 e a capacidade proliferativa. Células T efetoras de memória (TEM) expressar CD45RO, falta receptores CCR7 e exibição para homing para os tecidos periféricos ou inflamadas. As células efectoras não expressam ou CCR7 ou CD45RO mas prontamente produzir citocinas efectoras, tais como IFN-γ, após o reconhecimento do antigénio.

Ensaios de libertação de IFN-γ (IGRA) são utilizados para o diagnóstico da tuberculose bovina e humana ^7. Mycobacterium bovis é o principal agente da tuberculose bovina (BTB), enquanto ca humanases da tuberculose são principalmente causadas por Mycobacterium tuberculosis. Com estes testes, sangue completo ou células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são estimuladas com antigénios micobacterianos, durante 16 a 24 horas e a produção de IFN-γ no sobrenadante é medida por ELISA ou por meio da detecção de células produtoras de IFN-γ usando técnicas ELISPOT. Como resultado da breve período de estimulação (isto é., De 16 a 24 h) e a produção de citocinas rápida, ensaios ex vivo de detectar principalmente efectoras e TEM respostas. Isto foi confirmado por análise de citometria de fluxo das populações de células nestas culturas ^8-10.

Ex vivo respostas de IFN-γ são rotineiramente incluídos no âmbito da avaliação painel resposta imune de vacinas contra a tuberculose, incluindo aqueles usados ​​para avaliar as respostas de gado. A maioria das vacinas eficazes tuberculose bovina eliciar respostas de IFN-γ específicos, mas não todas as vacinas que induzem respostas de IFN-γ são protective. Além disso, os níveis de IFN-γ eliciada pela vacinação, como medido antes da infecção, não se correlaciona necessariamente com a protecção. Por exemplo, diferentes estirpes de BCG podem ter diferentes capacidades para induzir a ex vivo, a resposta de IFN-γ, apesar de os níveis de protecção semelhantes ^11. Assim, ex vivo IGRAs são valiosos para o diagnóstico da tuberculose e para acessar a imunogenicidade da vacina; no entanto, a sua utilização como indicadores de eficácia da vacina é limitada. Respostas TCM para vacinação, por outro lado, pode ser usado para prever a eficácia da vacina, tal como demonstrado com a infecção pelo vírus da imunodeficiência símia (SIV) em primatas não-humanos, ^12,13 tuberculose em ratos ¹⁴ e malária em humanos ^15,16.

Depois de uma resposta imune eficaz, resultando na depuração de agentes patogénicos, o TCM são mantidas e proporcionar uma protecção para uma eventual segunda infecção com o mesmo agente. Uma notável exceção a este cenário é M. tuberculose INFEcção dos seres humanos em que os pacientes que recebem a terapia anti-micobacteriana curativa são suscetíveis a re-infecção ^17,18. Além disso, os eventos que regulam a memória imunológica durante infecções crónicas, em que a estimulação antigénica persiste, não são bem compreendidos ^19. Durante infecções crónicas, tais como com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e a tuberculose, uma resposta significativa de TCM está associada a um resultado favorável (por exemplo, a latência com tuberculose e doença subclínica com HIV) ^20,21. Vários estudos com ratos e seres humanos demonstraram que a cultura ensaios ELISPOT de IFN-γ a longo prazo medir as respostas Tcm ^16,20-22. Com este ensaio, as PBMC foram cultivadas em reduzir a concentração de antigénio durante 10 a 14 dias, permitindo respostas efectoras para o pico e diminuir; Tcm facilitando a diferenciação e expansão no interior da cultura.

Cultivadas ensaios ELISPOT de IFN-γ longo prazo também têm sido utilizados em veterináriainvestigação, contudo o fenótipo das células que respondem tem sido difícil de avaliar devido à falta de reagentes críticos, especialmente um anticorpo para CCR7. Vacinas eficazes tuberculose bovina [por exemplo. utilizando uma dose única de M. bovis bacilo de Calmette Guerin (BCG), vacina BCG seguido por subunidade Antigen 85A-viral em vector, atenuadas ou M. bovis ΔRD1] eliciar respostas a longo prazo cultivadas-γ ELISPOT de IFN após a vacinação que se correlacionam com protecção (isto é, menor carga micobacteriana e diminuiu patologia associada-TB) contra o subsequente desafio com M. virulenta bovis ^23,24. Além disso, os números de células secretoras de IFN-γ específicas do antigénio dentro de longo prazo culturas de PBMC são superiores aos 12 meses, mas diminui a 24 meses após a vacinação BCG de bezerros neonatais, correlacionando-se com o grau de protecção pós detectável M. bovis desafio ^25. Neste cenário, o IFN-γ cultivadas ELISPOT é uman ferramenta importante para prever a eficácia da vacina, fornecendo um meio de priorizar candidatos a vacina para ensaios de eficácia de alto custo. Além disso, as técnicas ELISPOT em cultura pode ser adaptado para vários hospedeiros, agentes patogénicos e citocinas, alterando antigénios ou anticorpos para uma variedade de fins, em diferentes áreas de investigação.

Protocolo

1. Prepare as seguintes soluções

1. Prepare RPMI completo (cRMPI) por adição de soro fetal de bovino (FBS) a uma concentração de 10% (volume / volume), glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), aminoácidos não-essenciais (0,1 mM), penicilina -streptomycin (100 unidades / ml de penicilina e 0,1 mg / ml de estreptomicina) e 2-mercaptoetanol (50 mM) em meio RPMI 1640.
2. Preparar 2 X citrato de ácido dextrose, por mistura de citrato de sódio (77 uM), ácido cítrico (38 mM), e dextrose (122 uM), em água destilada.
3. Prepare Ca2 ⁺ Mg2 ⁺ fosfato livre solução salina tamponada (PBS) pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na ₂ HPO ₄ (dibásico, 10 mM), KH ₂ PO ₄ (monobásico, 2 mM) em água destilada; ajustar o pH para 7,2.
4. Prepare PBS 1% (PBS BSA a 1%) por adição de albumina de soro bovino em PBS (volume / peso, 1 g / 100 ml de PBS).
5. Prepare PBS + 0,05% Tween 20(PBST) por adição de 0,05% de Tween 20 em PBS (volume / volume, 500 mL de Tween 20/1 L de PBS).
6. Prepare mM Tris HCL pH 8,2 tampão de 100 por mistura de Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) em água destilada.
7. Preparar a solução de etanol 35% por diluição de álcool etílico (pureza ≥99.5%) em água destilada (volume / volume, 35 ml de álcool etílico / 100 mL de água destilada).
8. Filtrar esterilizar cRPMI, 2 x dextrose de citrato ácido, PBS, PBS 1% de BSA utilizando filtros de 0,22 um.

2. Células cultivadas de longo prazo (14 dias Protocol)

(Dia um)

1. Preparar soluções de antigénio em duas vezes a concentração final em cRPMI. Escolha Antigen é crítica e deve ser adaptado para a finalidade do estudo.
2. Diluir recombinante M. tuberculose e antigénios TB10.4 antigénio Ag85A a 2 ug / ml (de cada antigénio; a concentração final é de 1 ug / mL).
3. Diluir M. bovis derivado de proteína purificada(PPD-B, Prionics AG) a 10 ug / ml (a concentração final é de 5 ug / mL).
4. Dilui-se o início secretora alvo recombinante antigénica 6 (ESAT-6) e proteína de filtrado de cultura de 10 (CFP-10) proteína de fusão (Reşat-6: CFP10) a 2 ug / ml (concentração final de 1 ug / mL).
   NOTA: Estes antigénios são imuno-IFN-γ indução de antigénios de micobactérias tuberculosa e podem ser incluídos para estimular PBMC a partir de M. bovis animais infectados. BCG ou M. bovis ΔRD1 animais vacinados não respondem a Reşat-6: CFP10, como a região que codifica para estes antigénios (ou seja, RD1) é suprimida nestas estirpes. Reşat-6: CFP10 utilizada neste estudo foi uma simpática oferta do Dr. C. Minion, Universidade do Estado de Iowa. TB10.4 Ag85A e antigénio estão presentes em antigénios imunodominantes virulento e M. vacina bovis estirpes ^37. PPDB, como um derivado de proteína purificada, é um complexo de vários antigénios, incluindo antigénios partilhados com micobactérias não-tuberculosa. Infecanimais ted irá responder potencialmente a todos os antigénios (ou seja: TB10.4, Ag 85A, Reşat-6: e CFP10 PPDb), enquanto que os animais vacinados não deve responder a Reşat-6: CFP10 ^11.
5. Placa de 500 ul / poço de solução de antigénio em quadruplicado para cada animal numa placa de 24 poços. Para este protocolo, utilize antígenos como uma piscina; assim utilizar todos os poços contêm todos os antígenos e sem controlos (tais como, nulo ou mitogénio) este passo. Incubar a placa a 39 ° C / 5% de CO _2. A temperatura normal do gado é de 39 ° C; Assim, alguns investigadores utilizam 39 ° C para a cultura de células de bovinos. Além disso, em certos casos, com células humanas, a cultura de células a 39 ° C proporciona benefício adicionado ^26,30.
6. Seringas pré-carga acoplada com 16 ou 18 g de agulhas hipodérmicas com 6 ml de 2 X de ácido-citrato-dextrose; e recolher 60 ml de sangue bovino por punção venosa jugular.
7. Isolar PBMC por centrifugação em gradiente de densidade padrão das frações do sangue periférico creme leucocitárioajustar a concentração celular a 4 x 10 ⁶ células / ml, tal como descrito por Maue et ai. ²⁷
8. Adicionar células (500 ul / poço) em antigénio pré-carregado placa de 24 poços, em quadruplicado para cada animal (passo 2.5). Incubar a placa a 39 ° C / 5% de CO _2.

(Dias de três e sete)

9. Utilizando uma técnica estéril, remover cuidadosamente 500 ul do sobrenadante de cada poço sem perturbar a camada de células.
10. Reconstituir o volume bem por adição de 500 ul / poço de cRPMI contendo IL-2 (30 U / mL, isto é, 15 U / poço de IL-2 humana recombinante Sigma I7908). Incubar a placa a 39 ° C / 5% de CO _2.

(Dias 10 e 12)

11. Utilizando uma técnica estéril, remover 750 ul de sobrenadante de cada poço. Reconstituir o volume com 750 ul / poço de cRPMI (sem IL-2). Incubar a placa a 39 ° C / 5% de CO _2.

3. Ensaio ELISPOT (Dia Três Protocolo)

(O primeiro dia (12 ^° dia de protocolo de cultura de longo prazo))

1. Rotular a placa ELISPOT adequadamente para cada conjunto de amostras, a fim de evitar erros, quando o plaqueamento de células: células de longo prazo mais células apresentadoras de antigénio (APCs), as células de longo prazo sem APC e ex vivo células / curto prazo (Figura 1). Repetições para cada tratamento (ou seja, estimulação antigênica) deve ser feito pelo menos em duplicado.
2. Preparar a solução de anticorpo de captura por diluição de ratinho anti-bovino anticorpo IFN-γ (MCA2112, clone CC330) em PBS (8 ug / ml).
3. Usando um pipetador multicanal de pré-molhar os poços da placa de ELISPOT com 15 ul / poço de etanol a 35% durante 1 min. Para evitar danos da membrana, não toque no fundo dos poços com pontas de pipeta em qualquer momento durante o ensaio.
4. Lavar a placa seis vezes com 300 ul / poço de PBS. Fluido de lavagem deve ser descartada por placa de inversão. Lavagens deve ser feito rapidamente, não permitindo poços de placas de a secar.
5. Pipetar 100 ul / cavidade de captura de anticorpo anti-IFN-γ (a partir do passo 1 acima). Incubar a 4 ° CO / N (manter a placa dentro de um saco de armazenamento com zíper).

(O segundo dia (13 ^° dia do protocolo de cultura de longo prazo))

6. Preparar soluções de antigénio em duas vezes a concentração final. Os tratamentos são os seguintes: sem estimulação (cRPMI), PPD-B (20 ug / ml, concentração final: 10 ug / ml), cocktail de proteínas de TB10.4 e Ag85A (2 ug / mL de cada proteína, concentração final: 1 fig / ml de cada uma das proteínas), Reşat-6: CFP10 (para a infecção por M. bovis, 2 ug / ml, concentração final: 1 fig / mL) e um controlo positivo, tal como pokeweed (20 ug / ml, concentração final: 10 ug / ml). Outros mitogénio pode ser usada em vez de PWM (por exemplo, Concanavalina A).
   NOTA: para esta etapa antígenos compor quatro tratamentos diferentes e são not usado como uma piscina (como no passo 2.5). Os quatro tratamentos são: NS, PPDb, coquetel de proteínas (TB10.4 e Ag85A constituem um tratamento) e PWM.

4. Cultura de Células de curto prazo e de células aderentes (APCs) Isolamento

1. Recolha de 60 ml de sangue a partir dos mesmos animais sangrados no dia 1 (em: a cultura de longo prazo, o protocolo de 14 dias) e isolar as PBMC, como antes.
2. Ajustar a concentração de células a 2 x 10 ⁶ células / ml. Tubos rótulo claramente para evitar má alocação quando chapeamento células. Estas células serão utilizados para APCs isolamento e também como cultura de células de curto prazo (passo 6.5). Tubos etiqueta com tanto o número de animais eo tipo de cultura (neste caso: ex vivo, a curto prazo ou células frescas).
3. Retire o excesso de anticorpo de captura do ELISPOT placa por inversão. Lavar as placas 6 vezes com 300 mL PBST.
4. Remover o máximo PBST possível. Pipetar 50 ul de suspensões de células aos poços marcados como células de longo prazo mais APCs. Bloco outro welsl com 200 ul / poço de cRPMI. Incubar 90 min a 39 ^° C ou Pré-quente cRPMI ou 39 ^° C (necessário para as etapas subseqüentes). PBMC frescas não utilizados para células aderentes (APCs) isolamento será necessária nos passos subsequentes e devem ser armazenados.

5. As células cultivadas

1. Durante os 90 minutos de incubação (etapa 4.4, cultura de curto prazo e passo de isolamento de células aderentes), a colheita de células cultivadas de longo prazo.
2. Usando 5 ou 10 pipetas ul, meios de pipetas com células cima e para baixo para separar as células, combinar o quadruplicado replica de cada animal em um único tubo de 15 ml. Centrifugar os tubos durante 5 min a 400 g.
3. Após centrifugação, desprezar o sobrenadante por inversão do tubo. Desalojar sedimento celular. Adicionar 5 ml de PBS, gentilmente re-suspensão da pelota, se necessário. Voltar a centrifugar. Repita o passo de lavagem duas vezes. Elimine o sobrenadante por inversão do tubo e suavemente as células em 1 ml cRPMI re-suspensão. Ajustar a concentração de célulasa 2 x 10 ⁵ culas / ml.

6. Galvanização fresco e PBMC cultivadas

1. Após a 90 min de incubação, agitar placas na placa shaker durante 30 segundos. Remover as células não aderentes por placa de inversão. Pipetar 150 ul / poço de cRPMI quente (a partir do passo 4, em: células de curto e de células aderentes (APCs) passo de isolamento).
2. Agite placas e descarte de fluidos de lavagem. Repita lavagem 3 vezes. Adicionam-se 100 ul / poço de cada antigénio em poços apropriados (pré-marcado).
3. À placa de células, pipetar 100 ul / poço de suspensão de células em cultura a longo prazo (2 x 10 ⁵ culas / ml) nas cavidades marcadas como células de longo prazo mais APCs. Certifique-se de que as células de longo prazo foram adicionados neste passo são do mesmo animal, tal como a APC já está no bem. Não misture pilhas cultivadas a longo prazo da APC e de diferentes animais.
4. Pipetar 100 ul / cavidade da suspensão de células em cultura a longo prazo (2 x 10 ⁵ culas / ml) em poços sem APCs para a avaliação do requisito para a resposta a APC cultura a longo prazo.
5. Adiciona-se 100 ul / poço de células de curto prazo (isolada de fresco e ajustado a 2 x 10 ⁶ células / ml) para avaliação da resposta ex vivo. Incubar as placas de O / N a 39 ^° C / 5% de _CO2. Certifique-se de que as placas estão mentindo plana e não se acumulam placas.
   NOTA: Se a análise de fenótipo celular é desejada, a citometria de fluxo pode ser realizada como um ensaio acessória. As células são plaqueadas em placas de 96 poços de fundo (L em vez de placas de ELISPOT) tal como descrito para o ensaio de ELISPOT. Captura de anticorpos adsorção (passos 3,4-3,5) deve ser ignorada. As células são então incubadas O / N a 39 ° C / 5% de CO2 e um protocolo de coloração de células padrão realizado. Reagentes de coloração celular estão incluídos na tabela de reagentes.

Dia três ^(14º dia do protocolo de cultura de longo prazo)

6. Diluir o anticorpo de detecção (ratinho anti-IFN-γ bovina, clone CC302) a 5 ug / ml em PBS 1% BSA. Descartar fluidos de poços e lava-se as placas: seis vezes com PBST (300 ul / poço), a colocação no agitador de cada vez durante 10 segundos antes e entre lavagens, uma vez com dH ₂ O (300 ul / poço), um adicional de 6 vezes com PBST (300 ul / poço) e duas vezes com PBS (300 ul / poço). Depois as células são removidas das placas, e se não há preocupações de segurança biológica aplicar, os procedimentos podem ser realizados fora cabines de segurança biológica.
7. Fluido de lavagem de descarte. Remover o máximo de fluido de lavagem possível tocando placa sobre papel absorvente. Adicionar anticorpo de detecção (100 ul / poço).
8. Incubar as placas durante 120 min a 39 ^° C ou Durante este passo de incubação, preparar a solução de fosfatase alcalina seguindo as instruções do fabricante. Trinta minutos antes da sua utilização (isto é, 90 minutos após a adição de anticorpo de detecção com poços) diluir o reagente em PBST. Inverter o tubo suavemente para misturar os reagentes e incubar à TA.
9. Após o 120 min de incubação, descartar o excesso de anticorpo de detecção por placa de inversão. Lavar a placa 6 vezes com PBST (300 ul / poço). Remover o máximo de fluido de lavagem possível tocando placa sobre papel absorvente.
10. Adicionam-se 100 ul / poço de uma solução de fosfatase alcalina (a partir do passo 3 acima). Incubar as placas durante 45 minutos à TA. Descartar fluido e lavar cada placa seis vezes com PBST (300 ul / poço).
11. Preparar a solução de substrato de acordo com as instruções do fabricante (Vector substrato Azul AP III): Diluir em reagentes mM de Tris HCL, pH 8,2 tampão 100. Pipetar 50 ul / poço de solução de substrato.
12. Incubar à temperatura ambiente até a cor azul começa a desenvolver (aproximadamente 30 min). Descarte fluido e lavar as placas com grandes quantidades de dH ₂ O. Remova a placa inferior para expor membrana, lavagem de poços para trás e permitir que a placa secar ao ar.
13. Ler as placas num analisador de imagem ou immunospot leitor ELISPOT (Tabela 1), ou manualmente, utilizando-se um estereomicroscópio. Como alternativa, mantenha placasno escuro à temperatura ambiente até que a leitura. Devido à elevada estabilidade do substrato da reacção, a qualidade é preservada durante vários anos.
    NOTA: As células e concentrações de antígenos foram otimizados para evitar poços com pontos incontáveis ^{​​23,24,27,37.} É possível que a formação de manchas incontáveis ​​ocorrer em diferentes configurações ou devido à variação biológica. Se for esse o caso, a concentração de células devem ser optimizadas de modo uma resposta de contagem local legível é obtido.

7. As placas de Leitura e Análise de Dados

1. Realizar análise de acordo com a placa de ELISPOT guia Cellular Technology Limited (CTL) leitor (Tabela 1). Depois de as contagens de pontos são obtidos para cada um dos poços, calcular a média entre duplicados. A resposta imune específica para cada estímulo antigénico é calculada subtraindo o número médio de manchas em poços não-estimulada a partir de poços que estimulada com antigénio.

Resultados

Cerca de um mês infecção pós-aerossol com M. bovis (10 ⁴ unidades formadoras de colónias), a partir de PBMC infectados (n = 8) e animais de controlo (n = 8) foram cultivadas na presença de antigénios e IL-2 durante 13 dias. Desenvolvimento de respostas Tcm após a infecção foi determinada utilizando o ensaio ELISPOT de IFN-γ. Representante de TCM (na presença ou ausência de APCs) e ex vivo de IFN-γ respostas ELISPOT a partir de animais infectados (três animais) e um animal não infectado (um animal) são mostrados na Figura 1. A longo prazo IFN-γ sucesso ELISPOT resultados do ensaio em células produtoras de IFN-γ (SPOT-células formadoras, SFC) em condições estimuladas e quase ausência de uma resposta a partir de animais não infectados e em condições não estimuladas. Além disso, uma forte resposta das células T deve ocorrer em resposta a PWM. Respostas específicas para M. bovis foram avaliadas por PPD-B ou Reşat-6: CFP10 estimulação antigénica. Como mostrado na Figura1, robusto TCM e ex vivo as respostas ao PPD-B e 6-Reşat: CFP10 foram detectados a partir de todos os três M. bovis infectados com animais. O mínimo de TCM e ex vivo respostas foram detectados a partir do animal de controlo. Além disso, a presença de APC era necessária para respostas óptimas Tcm por animais infectados, como demonstrado pelas respostas muito reduzidos por células de longa duração cultivadas na ausência de APC autólogas. Resposta de IFN-γ por PBMC a partir de M. bovis animais infectados e não infectados são apresentados na Figura 2. O número de SFC de cada animal foi calculada como o número médio de SFC em amostras em duplicado em resposta ao PPD-B menos a respectiva resposta a meios isolados. As respostas foram estimados por 10 ⁶ células. As respostas foram diferentes (P <0,05) com base no estado de infecção, a presença ou ausência de APCs e duração da cultura (isto é., A longo prazo contra a cultura ex vivo de cultura).

Adquirir imagem de placas
1.	Ligue máquina
2.	Open "Immuno Capture" software versão 6.3.
3.	Passo 1: selecione o tipo de placa.
4.	Passo 2: placa de carga.
5.	Passo 3: selecione as opções de digitalização.
6.	Passo 4: iniciar a digitalização.
7.	Obter uma imagem panorâmica de placa.
8.	Ejetar placa.
9.	Saia do software "Immuno Capture".
Contando as unidades formadoras de manchas
1.	Abra "Immuno ponto de captura" software versão 5.0.
2.	Selecionar objec Tipo de t: normal.
3.	Escolha um módulo de contagem: contagem inteligente.
4.	Passo 1: placa de carga.
5.	Passo 2: definir parâmetros de contagem: a precisão do teste de reconhecimento de local em poços com pontos diferentes.
6.	Iniciar contagem automática.
Controle de qualidade
1.	Open "Immunospot Capture" software versão 5.0.
2.	Escolha um módulo de contagem: controle de qualidade.
3.	Passo 1: placa de carga.
4.	Passo 2: Analisar poços destacado individualmente.
5.	Termine controle de qualidade.

Tabela 1 - aquisição de imagem leitor Autoimmun Diagnostika ELISPOT e celular contando procedimento.

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Figura 1. Imagem de poços de um IFN cultivadas longo prazo γ ELISPOT. Ensaio-γ IFN Culta ELISPOT foi realizada approximatelyone mês após o desafio com virulento M. bovis (três animais). Os animais não-infectadas foram incluídas como controlos (um animal) linhas de células de longo prazo foram geradas por estimulação de PBMC com um cocktail de Ag85A recombinante (1 ng / ml), TB10.4 (1 ug / ml), Reşat-6.: CFP10 (1 ug / ml) e PPD-B (5 ug / ml) durante 13 dias, seguido por transferência para placas de ELISPOT na presença ou na ausência de APC autólogas. Células de curto prazo consistia em PBMC isolado no dia 13 e banhado diretamente em placas ELISPOT. Células a longo prazo e a curto prazo foram estimuladas com PPD-B (10 ug / ml), Reşat-6: CFP10 (1 ug / ml), por si só forma ou mitogénio pokeweed (5 &# 956; g / ml) durante 24 h.

Figura 2. Os resultados representativos de um IFN-cultivadas a longo prazo γ resposta ELISPOT para M. bovis derivado de proteína purificada (PPD-B). Cultured ensaio de IFN-γELISPOT foi realizada approximatelyone mês após desafio virulento com M. bovis (oito animais). Os animais não-infectadas foram incluídas como controlos (células oito animais a longo prazo foram geradas por estimulação de PBMC com um cocktail de Ag85A recombinante (1 ng / ml), TB10.4 (1 ug / ml), Reşat-6: CFP10 (1 ug / ml) e PPD-B (5 ug / ml) durante 13 dias, seguido por transferência para placas de ELISPOT, na presença ou ausência de APCs autólogas. As células de curto prazo consistia em PBMC isolado no dia 13 e plaqueadas directamente na placa ELISPOT . a longo prazo e shocélulas rt prazo foram estimuladas com PPD-B (10 ug / ml) ou apenas meio, durante 24 h. Respostas específicas de cada animal (SFC / 10 ⁶ células) são apresentados como resposta ao PPD-B (média de amostras em duplicado) menos a resposta aos meios de comunicação por si só.

Discussão

A produção de IFN-γ em ensaios ELISPOT em cultura a longo prazo é geralmente devido a TCM em seres humanos, mas como esta resposta se desenvolve em cultura é pouco compreendida. Tcm Se estão presentes na circulação e expansão in vitro, ou se as respostas Tcm resultar da diferenciação de células efectoras e TEM Tcm em cultura durante não é conhecido. No entanto, estudos com amostras de seres humanos mostraram que células T CD4 ⁺ a partir de ensaios ex vivo e em cultura de IFN-γ ELISPOT a longo prazo têm especificidades de epitopo não relacionadas, o que implica que as respostas Tcm não se desenvolvem a partir de células efectoras ^28. Obviamente, a duração da resposta pode variar, mas, se a depuração de agentes patogénicos é conseguido, eventualmente, tanto ex vivo e respostas Tcm declinar. Além disso, as respostas de culturas de longo prazo medido mais cedo e muito depois de escorvamento antigénico (quando a resposta efectora é inferior) é apresentada para correlacionar, indicando que circula populações Tcm cedo e muito depois de antipriming génica in vivo permanece relacionada. Por outro lado, a magnitude da resposta ex vivo não parece estar relacionada com a magnitude da resposta de memória ^29. Estes resultados sugerem que em cultura as respostas IFN-γ longo prazo ELISPOT resultar da expansão in vitro de TCM e uma diminuição de respostas efectoras associadas na amostra, em vez de a diferenciação de células efectoras em Tcm fenótipo.

Com o gado, a contribuição relativa dos efectores de memória e subconjuntos para as respostas detectadas pelos longo prazo ensaios ELISPOT de IFN-γ não é conhecido. Estudos recentes indicam uma correlação entre a vacina induziu respostas de IFN-γ a longo prazo cultivadas ELISPOT e proteção contra a infecção experimental subsequente com M. bovis ^23-24. Tem sido relatado que o IFN-γ fracas respostas ELISPOT de longo prazo para a vacinação estão associadas com a falta de protecção ^30. Ambos vivem e matarvacinas ed induzir ex vivo IFN-γ ELISPOT respostas semelhantes, mas a vacinação com BCG ao vivo provoca respostas mais fortes a longo prazo cultivadas-γ ELISPOT de IFN do que fazer preparações de vacinas mortas. Curiosamente, as vacinas vivas são protetores enquanto formulações mortos não fornecem proteção contra o desafio virulento com tuberculosas ^{31-32, 33.}

Avaliação das respostas Tcm também é viável por triagem destas células a partir de PBMC. Enriquecimento directo do TCM a partir de PBMC, no entanto, requer dispositivos caros, pessoal altamente treinado e é difícil uma vez que estas células não são numerosos na corrente sanguínea. Cultura de longo prazo de PBMC fornece enriquecimento do TCM sobre o TEM e células efetoras sem dispositivos caros; No entanto, porque estas populações de células T são expandidas in vitro podem ser menos representativo in vivo de respostas de memória. É possível aceder a respostas de memória de IFN-γ (usando a cultura de longo prazo ou Tcm tipoing) por estratégias diferentes do ELISPOT ensaios, tais como: ELISAs citocinas ^34, matrizes citocina talão (CBA), coloração intracelular (ICS), ou matrizes de proteína citocina (CPA). Estes métodos; no entanto, são geralmente menos sensíveis do que os Ensaios ELISPOT ^35.

Uma vantagem de ELISPOT é a sua capacidade para detectar a captura imediata da citocina logo após a sua libertação prevenção de diluição no sobrenadante e degradação por clivagem enzimática ou a absorção de citocina por outras células. Ensaios ELISPOT detectar células individuais que produzem citocinas que fornecem resultados precisos mesmo em baixo sinal para cenários de ruído (ou seja, de baixa respostas específicas) ^35. Além disso, com o ICS, a detecção de citocinas antes da sua libertação pode resultar numa falsa identificação de células produtoras de citocinas (por exemplo., Devido a modulação pós-tradução, antes de ou durante o processo de secreção) ^34. Os inibidores de transporte empregadas com ICS ensaios para minimizar a secreção de citocinadurante a estimulação pelo antigene (conhecidas como proteínas de paragem de Golgi) limitar a duração da estimulação das células, devido à toxicidade celular destas proteínas em última análise, a produção de citoquinas de impacto ^35.

Com o referido - CBA, CPA e os CEI são técnicas úteis para medir simultaneamente múltiplas citoquinas e / ou para a determinação da superfície da célula expressão do marcador (isto é, com o ICS.). Portanto, estes métodos podem ser utilizados em combinação com o ensaio ELISPOT de IFN-γ ^36. Embora a tuberculose bovina estudos de eficácia de vacinas anteriores respostas Tcm medido através de ensaio de ELISPOT, a detecção de respostas Tcm por outras técnicas provavelmente produzir resultados comparáveis. Importantemente, o ensaio ELISPOT é menos dispendioso e mais simples de realizar do que CBA, CPA e técnicas de análise de ICS ^34. A contagem manual do SFC é uma alternativa à contagem automatizada, e placas de ELISPOT pode ser armazenado à temperatura ambiente durante longo período de tempo com uma perda mínima de qualidade, antes ou depois de mancha cONTAGEM ^37.

A longo prazo cultivadas-γ IFN resposta ELISPOT foi aplicado para avaliar as respostas de memória por humanos, e gado, ao avaliar as respostas vacina contra a tuberculose ^{14-16,31-32,33.} Tcm respostas também são assumidos como desempenham papéis significativos na resposta do hospedeiro a vários outros agentes infecciosos de bovinos, tais como:. Mycoplasma mycoides subsp mycoides ^42, Anaplasma marginale ³⁸ e o vírus respiratório sincicial bovino ^39. Potencialmente, o ensaio ELISPOT a longo prazo pode ser adaptado para outras espécies animais, citocinas e infecções. Estas aplicações mais amplas será especialmente útil para aplicações de imunologia veterinária, devido à disponibilidade limitada de corrente de reagentes específicos.

Tcm respostas são cruciais para a proteção contra várias infecções, mas medindo-los mais cedo após a infecção / imunização (para a previsão evolução da doença ou a eficácia da vacina) may ser complicado. Análise da resposta imunitária ex vivo e sob as condições de estimulação antigénica curtos será mais frequentemente representam as respostas efectoras, devido à sobreposição de memória e respostas efectoras, especialmente durante o início da formação da memória imunológica. No contexto das doenças crónicas em que a carga de antigénio é contínuo, as respostas ex vivo irá avaliar as respostas das células efectoras, ou uma combinação de memória e células efectoras de respostas. O ensaio de cultura de longo prazo de ELISPOT de IFN-γ, descrito aqui, provavelmente permite a medição das respostas Tcm em vez de células T efectoras ou respostas de células T CD4 ⁺ combinadas. Em resumo, o ensaio a longo prazo cultivadas-γ ELISPOT de IFN proporciona um método valioso para estimar respostas de memória de células T e tem sido utilizado com sucesso para avaliar as respostas de memória de várias espécies para uma grande variedade de agentes infecciosos ^{12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Citrato de sódio (di-hidratado)	Vários
Ácido cítrico (monohidratado)	Vários
Dextrose	Vários
ELISPOT Placa PVDF	Vários
Vectastain ABC - ndash; Kit de substrato de		AK-5000
Vector	Vector Vector Laboratories	SK-5300
Ag85A	Lionex	LRP-0004.3	23, 24, 25, 37
TB 10.4	Lionex	LRP-0061.6	23, 24, 25, 37
PPDb	Prionics AG	7600055
rESAT-6: CFP10	Gentil presente Dr. Minion, Iastate		23, 24, 25, 27,  37
Camundongo anti-bovino IFN-&gama; Clone CC302	Serotec	MCA1783B	23, 24, 25, 27,  37
Camundongo anti-bovino IFN-&gama; Clone biotinilado CC330	Serotec	MCA2112	23, 24, 25, 27,  37
Clone anti-bovino de camundongo CD4 CC8	Serotec	MCA1653GA
Clone de CD45RO de camundongo anti-bovino IL116A	Serotec	MCA2434GA
Clone anti-humano CCR7 de rato 3D12	Abcam	ab95665
Clone anti-bovino de camundongo IFN-γ-Pe CC302	Serotec	MCA1783PE
Cabra anti-rato IgG2a- Alexa Fluor 350	Invitrogen	A-21130
Cabra anti-rato IgG3 APC-CY7	SouthernBiotechnology	1080-193
Cabra anti-rato IgG-APC	Invitrogen	A10540
BD Cytofix/Cytoperm™	BD Biosciences	554714
BrefeldinA	Sigma-Aldrich	B7651
Pokeweed Mitogen	Sigma-Aldrich	L8777
Interleucina humana recombinante 2	Sigma-Aldrich	I7908