As tecnologias recombinantes permitiram que os projetistas de materiais criassem novas proteínas artificiais com funcionalidades personalizadas para aplicações de engenharia de tecidos. Por exemplo, proteínas artificiais da matriz extracelular podem ser projetadas para incorporar domínios estruturais e biológicos derivados de ECMs nativos. Aqui, descrevemos a construção e purificação de proteínas aECM contendo repetições semelhantes à elastina.
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Artigo de método
Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de
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Resumo
Resumo
A tecnologia recombinante é uma plataforma versátil para criar novas proteínas artificiais com propriedades ajustáveis. Na última década, muitas proteínas artificiais que incorporaram domínios funcionais derivados da natureza (ou criados de novo) foram relatados. Em particular, proteínas artificiais de matriz extracelular (aECM) foram desenvolvidas; essas proteínas aECM consistem em domínios biológicos retirados da fibronectina, lamininas e colágenos e são combinadas com domínios estruturais, incluindo repetições semelhantes à elastina, repetições de seda e colágeno. Até o momento, as proteínas aECM têm sido amplamente investigadas para aplicações em engenharia de tecidos e reparo de feridas. Recentemente, Tjin e colegas de trabalho desenvolveram proteínas aECM específicas para integrina projetadas para promover a fixação e propagação de queratinócitos da pele humana. Em seu trabalho, as proteínas aECM incorporam domínios de ligação celular retirados da fibronectina, laminina-5 e colágeno IV, bem como repetições semelhantes à elastina flanqueadoras. Eles demonstraram que as proteínas aECM desenvolvidas em seu trabalho eram candidatas promissoras para uso como substratos em pele artificial. Aqui, descrevemos o design e a construção de tais proteínas aECM, bem como seu processo de purificação usando as características termorresponsivas da elastina.
Introdução
Por várias décadas, materiais sintéticos e naturais foram explorados para uso como andaimes na engenharia de tecidos1,2. Embora os materiais sintéticos, como polímeros, ofereçam excelente integridade estrutural e propriedades mecânicas ajustáveis, eles geralmente têm bioatividade insuficiente para promover o crescimento e a infiltração dos tecidos. Por outro lado, materiais naturais como proteínas de matriz extracelular (MEC) têm excelente atividade biológica, mas têm limitações como variabilidade lote a lote, degradação rápida e problemas de imunogenicidade. Dessa forma, as proteínas recombinantes são desejadas, uma vez que podem ser projetadas para mimeti....
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Protocolo
1. Clonagem de plasmídeos que codificam para Recombinante AECM Proteínas
- Desenhar a sequência de aminoácidos do domínio funcional (por exemplo, o domínio de ligação celular e repete-elastina semelhantes). Locais de restrição que flanqueiam as extremidades desenho dos domínios funcionais para facilitar a sub-clonagem utilizando software livre de acordo com as instruções de software (por exemplo, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Aqui, seleccionar locais de restrição únicos que não estão presentes no domínio funcional para confinar a digestão para os locais pretendidos. Escolha locais de restrição que aparecem no local de ....
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Resultados
Na concepção de proteínas de fusão que contêm repetições de elastina semelhante, é importante para manter um teor de elastina geral, bastante grande fracção da proteína de fusão 18. Isto é para assegurar que a construção de proteína de fusão retém as suas características elásticas do tipo, a fim de utilizar CIT para purificação. A concepção e as sequências descritas nesta secção foram especificamente proteínas MECa retirado do trabalho por Tjin et ai. 14. Neste trabalho, três proteínas AEC.......
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Discussão
Engenharia de proteína recombinante é uma técnica versátil para criar novos materiais de proteína usando uma abordagem bottom-up. Os materiais à base de proteínas podem ser concebidos para ter várias funcionalidades, adaptado de acordo com a aplicação de interesse. Devido ao aumento do avanço nas tecnologias de clonagem e de expressão de proteínas, tornou-se relativamente simples (e de baixo custo) para criar uma variedade de proteínas artificiais de uma maneira reprodutível e escalonável. O domínio semelhante a elastin.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer financiamento do Ministério da Educação ACRF Tier 1 (RG41) e start-up bolsa da Universidade Tecnológica de Nanyang. Baixo e Tjin são financiados pelo Bolsista de Investigação (RSS) a partir de Nanyang Technological University, Cingapura.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | Vetores de expressão T7 com resistência à ampicilina |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | antibióticos adicionais - cloranfenicol |
| Isopropil-beta-D-tiogalactosídeo (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 1 M solução estoque com água autoclavada, fazer fresco antes da indução. |
| Kit de minipreparação QIAprep Spin | Qiagen | 27106 | kit de isolamento de plasmídeo |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Ampicilina | Affymetrix | 11259 | |
| Cloranfenicol | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™ gel kit de recuperação de DNA | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold strain | Agilent Technologies | 200315 |
Referências
- Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63....
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Reimpressões e permissões
