Usando contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia de alta resolução, uma observação ex vivo do espancamento de cílios ependymal móveis localizados dentro dos ventrículos do cérebro do rato é demonstrado pelo live-imagiologia. A técnica permite que uma gravação da frequência de batimento ciliar ângulo único e batendo bem como as suas propriedades de estimulação do cálcio intracelular oscilação.
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Artigo de método
Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células ependimárias Multiciliated alinhar os ventrículos no cérebro adulto. Função ou estrutura de cílios ependimária anormal está associado com várias deficiências neurológicas. A corrente ex vivo de imagens ao vivo da motilidade técnica cílios ependymal permite um estudo detalhado da dinâmica ciliares seguir várias etapas. Essas etapas incluem: ratos eutanásia com dióxido de carbono de acordo com protocolos de The University of Animal Care Institucional de Toledo e Comitê de Uso (IACUC); craniectomia seguido por remoção do cérebro e dissecção cérebro sagital com um vibratome ou lâmina afiada para obter secções muito finas através dos ventrículos laterais do cérebro, onde os cílios ependimária podem ser visualizadas. A incubação das fatias do cérebro de uma placa com fundo de vidro personalizado contendo meio de Eagle modificado (DMEM) / alta concentração de glicose de Dulbecco a 37 ° C na presença de 95% / 5% de O2 / CO2 mistura é essencial para manter o tecido vivo duranteo experimento. Um vídeo do espancamento cílios é então gravado utilizando um de alta resolução de contraste de interferência diferencial microscópio. O vídeo é então analisado quadro a quadro para calcular a freqüência de batimento ciliar. Isso permite a classificação distinta das células ependimárias em três categorias ou tipos com base na sua freqüência de batimento ciliar e ângulo. Além disso, esta técnica permite o uso de análise de imagem de fluorescência de alta velocidade para caracterizar as propriedades únicas de oscilação de cálcio intracelulares de células ependimais, bem como o efeito de agentes farmacológicos sobre as oscilações de cálcio e a frequência de batimento ciliar. Além disso, esta técnica é adequado para imagiologia de imunofluorescência para a estrutura ciliar e localização de proteínas ciliar estudos. Isto é particularmente importante em estudos de diagnóstico da doença e fenótipo. A principal limitação da técnica é atribuída à diminuição no movimento ciliar móveis vivo como o tecido cerebral começa a morrer.
Introdução
Os cílios são organelos à base de microtúbulos sensoriais que se estendem a partir da superfície da célula para o meio extracelular. Dependendo da sua organização de microtúbulos, cílios podem ser classificados em dois tipos - "9 + 0" ou "9 + 2". Funcionalmente, com base na sua motilidade, estes podem ser classificados como motilidade ou não-móveis cílios 1. Cílios é um termo comumente usado para designar "9 + 0" cílios não-móveis. Estes têm nove microtúbulos doublet paralelas (indicado por '9') e um par central de microtúbulos está ausente no interior da bainha central (indicado por "0"). No entanto, alguns "9 + 0" cílios, cílios, como nodal, que regulam lateralidade embrião são móveis 2. Por outro lado, os cílios móveis são caracterizados, para além das nove dupletos microtúbulos paralelas, por um par central adicional de dupletos microtúbulo e com proteínas do motor associado dineína para facilitar a motilidade. Além disso, alguns "92 "cílios, como cílios olfatórios são não-móveis 3. Células ependimárias que revestem os ventrículos cerebrais e no canal central da medula espinhal são caracterizados por cílios móveis que impulsionam o líquido cefalorraquidiano (LCR) ao longo dos ventrículos cerebrais 4.
O objetivo geral deste método é facilitar o estudo da dinâmica cílios e anormalidades estruturais móveis. Saúde e desenvolvimento do cérebro dependem fortemente a circulação eficiente de líquor dentro dos ventrículos cerebrais. Por exemplo, o fluxo de FCS normal e equilíbrio de fluidos necessitam de batimento normal e funcional cílios ependimária 5,6, o que por sua vez, desempenham papéis críticos na regulação do movimento direccional de células neuronais e migração de células estaminais 7. Como tal, a função dos cílios ependimária anormal ou estrutura pode conduzir ao fluxo CSF anormal, que está associada com hidrocefalia, uma condição médica na qual há uma acumulação anormal de CSF nos ventrículos do bchuva. Isto pode, por conseguinte, causar aumento da pressão intracraniana e alargamento progressivo da cabeça, convulsões, visão em túnel, e deficiência mental 8.
As vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes é que ele permitiu, pela primeira vez para relatar três tipos de células ependymal distintas: I, II, e III, com base em sua única freqüência de batimento ciliar e batendo ângulo. Estas células ependimárias são localizados dentro de certas regiões nos ventrículos cerebrais. Além disso, os efeitos da idade e agentes farmacológicos, tais como álcool e cilostazol na alterando os tipos de células ependimais ou suas localizações pode ser demonstrada, o que não era possível antes de esta classificação de células ependimais. Cilostazole é um inibidor da fosfodiesterase-3, uma enzima que metaboliza cAMP em AMP e também regula o cálcio intracelular 9. Usando a análise de imagens de fluorescência de alta velocidade permite imagens e de quantificação do intracelular exclusivoPropriedades de oscilação de cálcio das células ependimárias. Por exemplo, tanto o álcool e o cilostazol alterou significativamente a frequência de batimento ciliar ependimal, bem como as oscilações de cálcio intracelulares propriedades, que por sua vez, pode conduzir a uma mudança no volume do fluido cerebrospinal de substituição pelos cílios ependimária 10. Em resumo, esta técnica foi a chave para proporcionar a primeira evidência de três tipos distintos de células ependimais com diferentes propriedades de oscilação de cálcio.
Na seção seguinte, um panorama detalhado passo-a-passo do procedimento é fornecida, prestando muita atenção a preparação do tecido e manuseio.
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Protocolo
Os procedimentos para o uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da Universidade de Toledo, em conformidade com as orientações do Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional dos Institutos Nacionais de Saúde e do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Extração de cérebro, Seccionamento e Preparação de tecidos
- Sacrifício de tipo selvagem estirpe de ratinhos C57BL / 6 por profundamente eutanásia com CO2 asfixia por 5 min. Assegurar morte por deslocamento cervical.
- Limpe a cabeça de rato com etanol 70%.
- Execute craniectomia usando tesouras e pinças esterilizadas por primeira puxando a pele fora, começando com o topo da cabeça para expor o crânio.
- Então, quando o crânio é exposta, remover o crânio por raspagem a peça-a-peça óssea, a partir do lado posterior e movendo-se para o lado anterior. Seja cauteloso para não destruir os ventrículos cerebrais.
- Recolher todo o cérebro.
- Inserir o cérebro em um prato de 100 milímetros de Petri contendo DMEM / alta de glucose suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e solução de penicilina / estreptomicina a 1% contendo 10.000 unidades / ml de penicilina e 10.000 ug / ml de estreptomicina e pré-aquecido a 37 ° C.
- Corte o cérebro sobre o plano sagital mediano à mão com uma lâmina afiada, e obter a primeira seção de 100-200 mm de cada metade usando um vibratome.
- Lavar o tecido cerebral com uma solução pré-aquecida até 37 ° C de fosfato tamponado salino (PBS 1x).
- Colocar imediatamente a secção do cérebro em meio DMEM / Glucose de alta pré-aquecido a 37 ° C.
2. Ao vivo de imagem Configuração e instalação
- Coloque as secções de tecido de cérebro em placas de cultura de 30 milímetros de fundo de vidro contendo 1 ml de meio DMEM / alta concentração de glicose. Ajuste ambiente câmara fechada do microscópio a 37 ° C, 95% / 5% de O2 / CO2 teor (Figura 1 ).
- Usando uma lente de imersão em óleo objetivo 60X, recolher as células ependimárias / imagens cílios colocando primeiro uma gota de óleo na lente objetiva 60X e incidindo sobre as células com DIC normal transmitida luz.
- Em seguida, segue a direcção do movimento da bolha de DMEM como um guia para a localização dos cílios ependimária móveis como agressões ciliares criar uma espécie de movimento de espuma na área. Escolha uma área que contém as células saudáveis com cílios móveis no ventrículo lateral do cérebro usando o filtro DIC. Uma vez que o cílios ependimária são encontrados, ajustar a luz e concentrar para se obter uma imagem satisfatória.
- Defina os parâmetros de imagem ao vivo de acordo com um propósito específico usando software de imagem Metamorph. No presente demonstração, adquirir vinte imagens de quatro bits com o conjunto de binning câmera para 1 x 1 combinado com 60X objetiva e 5-10 tempo de exposição ms.
- Recolher as imagens DIC abrindo a abertura microscópio para um nível óptimo de forma a ter um mínimo de exposure tempo. Observe as imagens ao vivo da câmera para fornecer aquisição de imagem rápida e imediata, sem atraso. Calcula-se a velocidade de batimento ciliar com base no requisito de os tempos de exposição mínimos a obter suficiente contraste de imagem.
3. Visualização e Análise de Dados
- Calcular o número de batimentos ciliares através da contagem do número de pancadas em 1 min. Para fazer isso, diminuindo a velocidade de vídeo e contando o número de batidas, utilizando um contador de células ou ferramenta semelhante.
- Para calcular a frequência de espancamentos, multiplicar o tempo de exposição em que o vídeo é gravado pelo número de quadros ou imagens de lapso de tempo adquiridos para obter o número de segundos. (Exemplo: o tempo de exposição 5 ms 200 frames = 1.000 ms ou 1 seg).
- Calcular o número de pancadas em um segundo para obter a frequência que é expressa como o número de bater por uma seg. Fazer isso através da divisão do número de espancamentos cílios mais de um segundo de tempo entreval (Exemplo: cílios bate 50 vezes em um vídeo gravado em 200 frames tempo de exposição de 5 ms ou seja, 5 ms x 200 quadros = 1 seg; agora dividir 50 batimentos por 1 segundo = 50 Hz).
- Calcule o ângulo de batimento ciliar por avaliar o caminho percorrido pelos cílios ependymal durante tanto os cursos de potência e recuperação. Executar esta de acordo com um método previamente descrito, com modificações menores 11. O movimento preciso de cílios individual é observada durante o ciclo de batimento completa.
- Numa folha de etilo colocado sobre o monitor, desenhar uma linha horizontal ao longo da borda ependimal e uma linha vertical através da posição de linha média dos cílios no início do curso de expansão.
- Traçar a posição precisa do quadro a quadro cílio como ele se move para a frente durante o golpe de energia. De um modo semelhante, o movimento de traçar o cílios durante o curso de recuperação.
- Calcule o ângulo de batimento ciliar do desvio máximo do cílio da linha média durante tele curso de potência, bem como o curso de recuperação.
4. O cálcio gravação de sinal
- Depois de cortar o cérebro, brevemente enxaguado a fatia de cérebro com 1x PBS ou PBS de Dulbecco (pH 7,0). Preparar uma solução fresca de Fluo-2 para evitar a extinção de fluorescência e para obter uma boa relação sinal-para-ruído.
- Preparar uma solução-mãe mM de Fluo-2 solução em dimetilsulfóxido (DMSO), misturar e agitar com vortex a solução durante pelo menos 5 minutos para assegurar que Fluo-2 é homogeneamente dissolvido em DMSO.
- Dilui-se a solução stock de Fluo-2 em 500 ml de DMEM / alta de glucose suplementado com 2% B27 pré-aquecido a 37 ° C, a uma concentração final de 20 mg / ml.
NOTA: B-27 é um suplemento sem soro optimizado contendo vitamina A, antioxidantes e cocktail de insulina usado para suportar a viabilidade a curto ou a longo prazo do hipocampo e outros neurónios do SNC. - Incubar imediatamente a fatia de cérebro com 20 mg / ml de Fluo-2 durante 30 min a 37 ° C em uma placa com fundo de vidro.
- Para determinar a concentração de carga óptima de cálcio fluoróforo Fluo-2 e para evitar toxicidade celular corante de cálcio, as células com falta de ATP, e verificar a viabilidade celular através da determinação do decurso de tempo e magnitude do pico de sinais de cálcio em resposta a ATP.
- Gravar o vídeo de oscilação de cálcio a uma taxa de captura de 5 ms para um mínimo de 1 seg (200 quadros por segundo), com excitação e emissão de comprimentos de onda de 488 nm e 515 nm, respectivamente (Filme 2).
- Para distinguir o sinal de Fluo-2 cálcio de autofluorescência ou artefatos de movimento, assegurar que as intensidades emitidos em 515 nm é monitorizada separadamente.
NOTA: Fluo-2 não é o cálcio fluoremetric adequado para quantificar o cálcio intracelular. No entanto, é um corante de cálcio dinâmica excelente para detectar mudanças rápidas de cálcio, tais como oscilações de cálcio. Para a quantificação mais precisa de cálcio, recomenda Fura-2. No entanto, as alterações dinâmicas de Fura-2 estão limitadas pela sua raciométricanatureza do corante. - Siga as fórmulas fornecidas pelo fabricante para calcular exatamente os valores de cálcio intracelulares livres. Exemplo [Ca2 +] = K d × (R - R min) / (Rmax - R). Onde K d é a constante de dissociação do corante a partir do cálcio libertado, R é a fluorescência medida a 488, e Rmin e Rmax é a proporção de fluorescência no mínimo e máximo de concentração de iões 12.
5. imunofluorescência Microscopia
- Fixar as secções de cérebro com solução salina tamponada de fosfato contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e sacarose a 2% durante 10 min. Em alternativa, fixar todo o cérebro com 4% PFA seção e, em seguida, em 50 seções mm utilizando um criostato.
- Lavar o tecido três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez.
- Incubar a fatia do cérebro com um solutiem 0,1% de Triton-X em 1x PBS durante 5 min, em seguida, lavar três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez.
- Incubar a fatia cerebral com o anticorpo primário do rato, um antiacetylated-tubulina, utilizado a uma diluição de 1: 5000 em FBS a 10% em 1x PBS, durante uma hora à temperatura ambiente (TA) ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar o tecido três vezes com 1x PBS durante 5 min de cada vez.
- Incubar a fatia de cérebro de anticorpo secundário, IgG anti-rato fluoresceína, a uma diluição de 1: 500 em FBS a 10% em solução de PBS 1x durante 1 h à TA.
- Antes de observação sob um microscópio de fluorescência, a secção de contraste com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) durante 5 min para corar o núcleo (ou ADN) 13. Para minimizar fotobranqueamento, imagem as seções imediatamente com tempo mínimo de exposição possível.
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Resultados
Medir a função dos cílios ependymal no cérebro do rato vivo
O método descrito neste protocolo é usado para monitorar a função dos cílios ependymal e estrutura no tecido fresco dissecado do cérebro do rato, bem como para monitorar e estudar freqüência de batimento ciliar. Os passos seguidos para alcançar uma experiência completa estão descritos em um fluxograma esquemático (Figura 1). É altamente recomendável que o experimento é conduzido dentro de um curto espaço de tempo, a...
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Discussão
Descrito aqui é um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato, tanto para live-imagem e microscopia de fluorescência que fornece uma observação atenta rápido e sensível dos cílios ependymal dentro dos ventrículos cerebrais. Esta técnica não é limitada apenas ao ventrículo lateral; que poderia ser utilizado para observar o cílios nas outras ventrículos cerebrais. Esta técnica de imagem fornece uma transmissão ao vivo que se assemelha o movimento do CSF por batimento ciliar num ambiente ex vivo. Além ...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Charisse Montgomery por seu serviço de edição. O trabalho de A. Alomran preenche parcialmente os requisitos para um mestrado em Farmacologia.Este trabalho é financiado pelo fundo inicial interno da Universidade de Toledo para WA e NIH grant (DK080640) para SMN
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM/GLICOSE ALTA | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Fosfato tamponado salina | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldeído | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Montagem Média com DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetilado anticorpo a-tubulina | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| Anticorpo anti-rato FITC | Vector Labs | FI-2000 | |
| Placa de cultura de células | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Lamínula (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems Leica | CM1860 | |
| Microscópio de fluorescência invertida | Nikon | Óleo Nikon TE2000 | 60X |
| Vidro de cobertura do microscópio 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Meio de montagem com DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI cubo de filtro | Chroma Technology |
Referências
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476(2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5(2013).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
