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Artigo de método

Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

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⸱

DOI:

10.3791/52889

⸱

19 de junho de 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a detecção de integrons de classe 1 e seus de genes associados em alimentos.

Resumo

A resistência aos antibióticos é uma das maiores ameaças à saúde noséculo 21. A aquisição de genes de resistência por meio da transferência lateral de genes é um fator importante na disseminação de diversos mecanismos de resistência. Entre os elementos de DNA que facilitam a transferência lateral, os integrons de classe 1 têm sido amplamente responsáveis por espalhar determinantes de resistência a antibióticos entre patógenos Gram negativos. No total, esses integrons adquiriram e disseminaram mais de 130 genes diferentes de resistência a antibióticos. Com o uso contínuo de antibióticos, os integrons de classe 1 tornaram-se onipresentes em comensais e patógenos de humanos e seus animais domesticados. Como consequência, eles agora podem ser encontrados em todos os fluxos de dejetos humanos, onde continuam a adquirir novos genes e têm o potencial de voltar para os humanos por meio da cadeia alimentar. Este protocolo detalha uma abordagem simplificada para detectar integrons de classe 1 e seus de genes de resistência associados em alimentos, usando cultura e PCR. Usando este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de: coletar e preparar amostras para fazer culturas enriquecidas e rastrear integrons de classe 1; isolar colônias bacterianas únicas para identificar isolados positivos para integrons; Identificar espécies bacterianas que contenham integrões de classe 1; e caracterizar esses integrons e seus de genes associados.

Introdução

A descoberta dos antibióticos foi uma das maiores conquistas científicas do século 20. No entanto, o uso e abuso de antibióticos levou à rápida evolução de bactérias resistentes aos antibióticos, e estes agora representam uma séria ameaça para a saúde pública no século 21. O surgimento de cepas bacterianas resistentes à maioria das opções de tratamento levanta a possibilidade de que estamos entrando em uma era onde as drogas antimicrobianas não são mais eficazes 1,2.

A maquinaria genética que confere resistência aos antibióticos é um sistema antigo, anterior a seres humanos e pressões de seleção de antibióticos por milhões de anos 3. Elementos genéticos móveis, tais como plasmídeos, transposões, ilhas genômicas, elementos conjugativos integrativas e integrons podem disseminar genes de resistência a antibióticos (ARG) tanto dentro como entre espécies bacterianas 4. Destes, integrões têm desempenhado um papel central na propagação de Arg, apesar dafato de que eles dependem de plasmídeos e transposons de mobilização e de inserção no genoma bacteriano 5. Integrons capturar cassetes de genes que utilizam um íntegron-integrase, e, em seguida, expressar as cassetes utilizando um promotor codificado íntegron 6,7 (Figura 1). Integron gene cassetes são pequenos elementos móveis consistindo de quadros individuais de leitura abertas (ORF), cujos produtos podem conferir resistência a antibióticos ou desinfectantes 8. Classe 1 integrons são os integrons mais comumente recuperados a partir de isolados clínicos 5, onde têm adquiriu coletivamente mais de 130 diferentes cassetes de genes de resistência a antibióticos 9.

A propagação da classe 1 integrons em comensais e patogênicas de bactérias associadas a humanos gera fluxos de resíduos humanos que contêm um grande número destes elementos genéticos 10. Estima-se que 10 19 bactérias que contêm uma classe integrons são liberados via lodo de esgoto cada ano in o Reino Unido 11. Portanto, não é surpreendente que uma classe integrons conferem resistências a antibióticos estão agora a ser detectado em microbiota das aves selvagens, peixes e outros animais selvagens nativos 12-14. Soltar integrons volta para o ambiente constitui uma ameaça grave de saúde pública, desde a aquisição de novos cassetes de genes e rearranjos complexos com outros elementos móveis continua a ocorrer, particularmente em estações de tratamento de esgoto e outros corpos d'água 15-18. O ambiente natural, em seguida, torna-se um terreno fértil para o recrutamento de novos determinantes de resistência e patógenos oportunistas 19,20. Bactéria contendo integron novos e novos ARGs pode circular de volta para a comunidade humana através de água e alimentos contaminados 21,22. Vigilância de ARGs ambientais é uma estratégia fundamental para a compreensão e manejo da resistência aos antibióticos no futuro 23. Em particular, deve ser dada atenção aos géneros alimentícios que são comidos crus oulevemente cozidos, uma vez que estes apresentam a maior ameaça para a transmissão de novos elementos celulares e patógenos.

Neste protocolo, uma abordagem simplificada para a detecção, identificação e caracterização de classe 1 integrons e suas cassetes de genes associados nos alimentos são descritas (Figura 2). Usando uma combinação de reacção cultura e polimerase em cadeia (PCR), integrões pode ser rapidamente detectada em comunidades bacterianas e complexos isolados individuais. Métodos de identificação das espécies de bactérias e a conformação ea identidade das cassetes de genes associados a integron são dadas. O método é adequado para uma ampla variedade de alimentos de origem vegetal e animal, e exemplos de fluxos típicos são dados para cada um destes tipos de alimentos.

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Protocolo

Os géneros alimentícios que são comidos crus ou levemente cozidos são de maior preocupação para a saúde humana. Exemplos incluem hortaliças, frutas, mariscos e crustáceos.

Coleção 1. Amostra

  1. Recolha de amostras sob condições que minimizam a contaminação, e armazenadas em sacos separados, limpas durante o transporte. Uma vez recolhidas, as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C e processados ​​dentro de 24 horas.

2. Enriquecido Cultura Preparação

  1. Frutas e vegetais:
    1. Colocar aproximadamente 10 g de material em um saco de plástico durável. Se a transformação de matérias maior, concentrar-se na pele do fruto ou legume. Adicionar 90 ml de tampão 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,0 e processo num misturador de pás durante 30 s. Em alternativa, o material pode ser agitada manualmente, se um misturador de pás não está disponível.
    2. Recolhe-se o líquido em dois tubos Falcon de 50 ml. Tubos de centrifugação a 4.000 xg por 7 min de bactérias de pelotização.
    3. Remova cuidadosamente o sobrenadante e suspender as bactérias peletizadas em 30 ml de Luria estéril Bertani (LB).
    4. Incubar num agitador de O / N, que prende um tubo a 25 ° C e o outro a 37 ° C. As culturas deverão ser agitados a 200 oscilações por minuto (OPM). Armazenar as culturas a 4 ° C até serem necessárias.
  2. Seafood:
    1. Dissecar o estômago (ostras) ou do tracto digestivo (camarão), utilizando fórceps e pinças estéreis e colocar num tubo de 1,5 ml esterilizado, contendo 200 ul de tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0. Macerar o exemplo para criar um homogeneizado.
    2. Pipetar 5 ml de caldo LB estéril em dois tubos de 5 ml, e inocular cada um com o homogeneizado de marisco.
    3. Incubar num agitador de O / N, que prende um tubo a 25 ° C e o outro a 37 ° C. As culturas deverão ser agitados a 200 opm. Armazenar as culturas a 4 ° C até serem necessárias.

3. As culturas de rastreio para integrons

NOTA: Os protocolos de PCR convencionais são utilizados ao longo desta metodologia, utilizando tampões fornecidos com a enzima, e uma concentração final de MgCl2 de 2,5 mM. Se necessário, Lorenz (2011) 24 delineou PCR otimização e solução de problemas métodos em uma edição anterior desta revista.

  1. Preparação de ADN fervido:
    1. Dispensar 100 l de cultura enriquecido em um estéril 0,5 ml tubo de PCR. Aquece-se a amostra a 99 ° C durante 10 min, utilizando um banho-maria ou bloco de aquecimento. Encaixe frio em gelo durante 2 min.
    2. Microcentrífuga a 14000 xg durante 5 min para sedimentar os detritos celulares. Retornar ao gelo. As amostras de ADN podem ser congeladas a -20 ° C até serem necessárias, mas deve ser descongelada em gelo.
  2. Rastreio de classe 1 integrons usando PCR:
    NOTA: culturas mistas do O / N incubação são selecionados para a classe 1 integrons usando o protocolo HS463a / HS464 PCR (Tabela 1).
    1. Descongelar todos os reagentes de PCR em gelo, longe de qualquer potencial de souRCEs de ADN contaminante. Compõem 48 ul PCR mastermix por amostra, incluindo controlos negativos (Tabela 2). Dispense 48 ul de PCR master mix para cada tubo, usando dicas de barreira.
    2. Adicionar 2 mL de ADN descongeladas para tubos de PCR individuais, utilizando pontas de barreira. Executar programa adequado no termociclador de PCR.
    3. Para avaliar os resultados da amplificação, electroforese 7 uL de produto de PCR num gel de agarose a 2% e executar vertida em tampão TBE (90 mM Tris-borato, 2 mM de EDTA). Incluem um marcador de peso molecular, tais como uma escada de 100 pb.
    4. Adicione mancha do gel com um corante de ADN, e visualizar utilizando um transiluminador de UV. Verificar que não houve nenhuma amplificação no controlo negativo. A banda forte em torno de 470 pb para qualquer determinada amostra indica que a cultura mista contém bactérias que carregam uma classe 1 integron. Colónias puras vai agora ser isolado a partir de qualquer cultura mista que devolvido um PCR positivo.

4. Triagem de colônias Individual para Classe 1 integrons

  1. Diluições em série e placas espalhadas:
    NOTA: Para isolar colónias simples a partir das culturas mistas de PCR-positivas, a cultura mista é diluída em série de 10 vezes em tampão de fosfato de sódio, e depois plaqueadas para recuperar as colónias individuais.
    1. Adicionar 1 ml de cultura mista a 9 ml de tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0 e misturar por inversão. Adicionar 1 ml da diluição para uma mais 9 ml de tampão de fosfato, e repetir até uma diluição em série de 10 -8 é atingido.
    2. Espalhe 100 ul dos 10 -4 a 10 -8 diluições em agar LB, em duplicado. Incubar as placas de O / N à mesma temperatura utilizada para a cultura mista inicial. As placas podem então ser armazenadas a 4 ° C até ser necessário, no entanto, é melhor para processar as colónias individuais relativamente prontamente.
  2. Selecção de colónias únicas e o ADN fervido preparação:
    1. Escolha colónias individuais das placas de diluição em série, SElecting como muitos tipos diferentes de colónias possível, usando critérios como tamanho da colônia, forma e cor. Use palitos esterilizados para selecionar colônias individuais da placa propagação.
    2. Toque no palito para a colônia, e depois transferir para um tubo de PCR contendo 100 ml de água estéril. Se um grande número de colónias estão a ser pesquisadas, em seguida, as colónias podem ser preparados num tabuleiro de microtitulação. Girar o palito entre os dedos para deslocar algumas das células na água.
    3. Usando o mesmo palito, inocular uma placa de LB com uma raia da colônia. Um grande número de colónias pode ser armazenada em placas marcadas se cada raia é de cerca de 1 cm de comprimento. Repita os passos 1 a 3 até que você tenha selecionado um número apropriado de isolados.
    4. Incubar a placas LB O / N, à mesma temperatura que o utilizado para a cultura enriquecido inicial. As culturas podem depois ser armazenado a 4 ° C até serem necessárias.
    5. Para a preparação de DNA a partir das suspensões bacterianas, siga os passos como UOtlined na secção 3.1. Para o rastreio de lisados ​​de cultura pura, execute o HS463a / HS464 PCR, conforme descrito no ponto 3.2. Os isolados que retornar um PCR positivo será utilizado para a preparação de ADN genómico (seção 5), e para análises posteriores.

5. As colónias individuais Genomic DNA Extração de Integron-positivos Usando Bead Batendo 25

  1. Inocular 5 ml de caldo de LB com uma amostra de cultura pura isolada na secção 4.2. Incubar S / N, agitando à mesma temperatura que foi utilizado para a cultura enriquecido inicial.
  2. Células de pelotas em 4000 g durante 7 min, em seguida, remover o sobrenadante. Volte a suspender as células sedimentadas em 1 ml de solução CLS-TC em um Lysing Matrix E tubo de preparação rápida. Usando uma máquina de talão de espancamento, processar a amostra em 5,5 m / s por 30 s.
  3. Tubo de centrifugação a 14000 xg durante 5 min e recuperar 700 ul de sobrenadante para um tubo esterilizado de 1,5 mL.
  4. Adicionar 700 ul de matriz obrigatório diluído 1: 5 com 6 M guanidinium tiocianato e misturar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 1 min, o sobrenadante de descarte.
  5. Adicionar 800 ul de lavagem com etanol sal (etanol a 70%, acetato de sódio 0,1 M) e agitar com vortex até que o sedimento é ressuspenso completamente. Lavar durante 5 min à temperatura ambiente, centrifugar a 14.000 xg durante 1 min e descartar o sobrenadante. Assegurar-se que o sobrenadante foi removido, utilizando uma micropipeta, se necessário, em seguida deixar secar ao ar durante 5 min.
  6. Ressuspender o sedimento em matriz de 200 ul de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 7,6), pipetando para cima e para baixo. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 3 min e a transferência de 160 uL do ADN eluído em um tubo estéril. Executar uma alíquota da extracção do ADN genómico em um 2% w / v de gel de agarose para verificar a integridade e rendimento da extracção do ADN. O ADN genómico purificado é armazenado a -20 ° C e descongelados em gelo, quando necessário para o teste de PCR.

6. PCRs de Diagnóstico e seqüenciamento de DNA

NOTA: ODNA genómico preparado na seção 5 será usado para todos os PCRs de diagnóstico, e para confirmar o teste positivo para a classe 1 integrons.

  1. Descongele DNA genômico em gelo, vortex brevemente a amostra de DNA e pulso rotação a 14.000 xg por 20 s. Repetir a PCR para o gene da integrase íntegron-classe 1 usando HS463a / HS464 (Tabela 1), confirmando que o isolado é positivo para o amplicão 471 pb (Secção 3.2).
  2. Identificação de culturas positivas ao nível de espécie é conseguida por análise da pequena subunidade do gene de rRNA (16S ADNr). Amplificar o gene 16S utilizando os iniciadores F27 / r1492 (Tabela 1). Confira os produtos de PCR utilizando eletroforese. Todos os alvos bacterianos deve gerar um 16S amplicon de cerca de 1450 pb.
  3. Sequência do amplicão do gene 16S rRNA para determinar a identidade das espécies, mas uma vez que não é provável que sejam múltiplos PCR positivos a partir do passo 6.2, e muitos destes positivos serão as mesmas espécies bacterianas, vamos primeiro distinguir as diferentes espécies using digestão de restrição do produto de PCR 16S.
    1. Digerir uma aliquota do PCR 16S com a enzima de restrição Hinf 1. Qualquer enzima que reconhece sítios de clivagem 4 pb vai fazer, mas Hinf 1 gera boa diversidade de alvos 16S, e é uma enzima confiável e barata.
  4. Configurar uma restrição de 30 ul digerir mastermix (Tabela 2) em um tubo estéril e adicionar 20 l de produto de PCR 16S purfied-un. Incubar em um banho de água a 37 ° C O / N. Verificar o produto da digestão num gel de agarose a 2%.
  5. Pontuação dos padrões de digestão produzidos por Hinf 1. Os isolados com o mesmo perfil de restrição 16S são susceptíveis de ser da mesma espécie. Em vez de seqüenciar todos os produtos de PCR 16S, seqüência, no máximo, três representantes de cada padrão de restrição Hinf 1.
  6. Purifica-se os produtos de PCR 16S utilizando um kit comercial. Um único conjunto de exonuclease de cadeia pode ser usado, mas com base em coluna ou métodos de precipitação também funciona bem para remover unincprimers orporated e ADN de cadeia simples. Sequência os amplicons 16S usando R910 iniciador (Tabela 1), que estabelecem as reações como especificado pelo serviço de sequenciação.
  7. Use a sequência de DNA resultante para interrogar o banco de dados de DNA NCBI com a função blastn ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Mais do que 97% de identidade de nucleótidos geralmente é tomado como a identidade das espécies.

7. Mapeamento e Caracterização de integrons e cassete Arrays

NOTA: Classe 1 integrons que emanam de ecossistemas dominados pelo homem tendem a ser os integrons mais comuns em todas as suas amostras. Estes integrons todos têm uma origem única recente e, portanto, têm uma sequência de DNA altamente conservado 5.

  1. Diferenciar entre uma classe 1 integrões que emanam a partir de fontes humanas e as que ocorrem naturalmente em amostras ambientais através da realização de umPCR com iniciadores definido intI1F165 / intI1R476 10 (Tabela 1).
    NOTA: Classe 1 integrons de bactérias comensais clínicos ou irá gerar um produto de ~ 300 pb, enquanto classe ambiental 1 integrons não irá gerar qualquer produto.
  2. Caracterizar os integrons clínicos, amplificando a matriz cassete com conjunto de primers HS458 / HS459. Esta PCR amplifica a região entre intI1 e segmento conservado a 3 'no terminal da maior parte das matrizes de cassetes. Uma vez que o número e identidade de cassetes é variável, o tamanho do produto de PCR também irá variar.
  3. Purifica-se produtos de amplificação e a sequência de ADN utilizando cada um dos iniciadores de amplificação. Use seqüências para interrogar bases de dados de ADN utilizando a função blastn ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Certifique-se de nomear de cassetes siga nomenclatura padronizada 9, uma vez que muitos depoimentos dados para cassete gene integrons usar nomes inconsistentes ou ambíguas. Dê especial atenção às cassetes de genes novos, uma vez que estes podem codificar novos fenótipos, incluindo genes que conferem aumento transmissibilidade, patogenicidade ou virulência 8,21.
    NOTA: pré-clínica formas da classe 1 integron ainda circulam em ambientes naturais. Em particular, aqueles que estão ligados a ativos Tn 402 transposons são de maior interesse 26. As matrizes de cassetes dessas integrons não vai amplificar com conjunto de primers HS458 / HS459, mas pode ser amplificado com o MRG284 / MRG285 primário conjunto (Tabela 1), gerando amplicons de tamanho variável dependente conteúdo cassete. Os produtos de PCR deve ser purificado e o ADN sequenciado conforme descrito em 7.2.

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Resultados

Triagem de culturas mistas e isolados bacterianos para intI1

O conjunto iniciador HS463a / HS464 PCR pode ser usado para detectar a presença do gene da integrase íntegron-classe 1, intI1 (Figura 1). Este conjunto de iniciadores para a detecção trabalha bem intI1 em culturas mistas, e também é utilizado para rastrear colónias bacterianas colhidas a partir de placas de propagação (Figura 2). Isolados positivos devem gerar uma única banda forte e...

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Discussão

A identificação de integrons e suas cassetes de genes associados é potencialmente um passo fundamental para prever o surgimento de novos patógenos oportunistas, acompanhamento de percursos para patógenos na cadeia alimentar humana e identificando nova resistência e virulência determinantes 8,21,26. O objetivo deste trabalho foi descrever uma abordagem simplificada para a triagem de amostras para a classe 1 integrons, caracterizando suas matrizes cassete e identificar as espécies de bactérias em que residem. E...

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Divulgações

Os autores não têm nada de relevante a divulgar.

Agradecimentos

Graças a Michaela Hall, Larissa Bispo e Gustavo Tavares de Assistência Técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GoTaq Colourless MastermixPromegaM7132Usado em todos os PCRs
RNAse (Ribonuclease A do pâncreas bovino)SigmaR6513-10MGUsado em todos os PCRs
Enzima de restrição HinFIPromegaR6201Usado para digerir produtos de PCR 16S rDNA. A enzima vem com tampão ideal e
escada BSA 100 bpGE Healthcare27400701Usado como padrão de tamanho em todos os géis de agarose
Mancha de DNA GelRedBiotium41003CUIDADO: Proteção pessoal deve ser usada ao manusear este material
Tiocianato de guanidínioLife TechnologiesAM9422CUIDADO: Proteção pessoal deve ser usada ao manusear este material
CLS-TC SoluçãoMP Biomedicals6540409Solução de ressuspensão usada no início da extração do DNA genômico
Lysing Matrix E Tubos FastPrepMP Biomedicals116914500Tubo necessário para a ruptura mecânica das paredes celulares bacterianas. Este código é usado para embalagens de 500 tubos, quantidades menores estão disponíveis.
Matriz de ligaçãoMP Biomedicals116540408diluído 1:5 com tiocianato de guanidínio 6 M e usado no método de extração de DNA genômico.
Máquina de preparação rápidaMP BiomedicalsNúmero de opções disponíveisMP Biomedicals tem várias máquinas FastPrep disponíveis para compra. Visite http://www.mpbio.com para obter mais informações
A

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