Este protocolo descreve a detecção de integrons de classe 1 e seus de genes associados em alimentos.
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Artigo de método
Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A resistência aos antibióticos é uma das maiores ameaças à saúde noséculo 21. A aquisição de genes de resistência por meio da transferência lateral de genes é um fator importante na disseminação de diversos mecanismos de resistência. Entre os elementos de DNA que facilitam a transferência lateral, os integrons de classe 1 têm sido amplamente responsáveis por espalhar determinantes de resistência a antibióticos entre patógenos Gram negativos. No total, esses integrons adquiriram e disseminaram mais de 130 genes diferentes de resistência a antibióticos. Com o uso contínuo de antibióticos, os integrons de classe 1 tornaram-se onipresentes em comensais e patógenos de humanos e seus animais domesticados. Como consequência, eles agora podem ser encontrados em todos os fluxos de dejetos humanos, onde continuam a adquirir novos genes e têm o potencial de voltar para os humanos por meio da cadeia alimentar. Este protocolo detalha uma abordagem simplificada para detectar integrons de classe 1 e seus de genes de resistência associados em alimentos, usando cultura e PCR. Usando este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de: coletar e preparar amostras para fazer culturas enriquecidas e rastrear integrons de classe 1; isolar colônias bacterianas únicas para identificar isolados positivos para integrons; Identificar espécies bacterianas que contenham integrões de classe 1; e caracterizar esses integrons e seus de genes associados.
Introdução
A descoberta dos antibióticos foi uma das maiores conquistas científicas do século 20. No entanto, o uso e abuso de antibióticos levou à rápida evolução de bactérias resistentes aos antibióticos, e estes agora representam uma séria ameaça para a saúde pública no século 21. O surgimento de cepas bacterianas resistentes à maioria das opções de tratamento levanta a possibilidade de que estamos entrando em uma era onde as drogas antimicrobianas não são mais eficazes 1,2.
A maquinaria genética que confere resistência aos antibióticos é um sistema antigo, anterior a seres humanos e pressões de seleção de antibió....
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Protocolo
Os géneros alimentícios que são comidos crus ou levemente cozidos são de maior preocupação para a saúde humana. Exemplos incluem hortaliças, frutas, mariscos e crustáceos.
Coleção 1. Amostra
- Recolha de amostras sob condições que minimizam a contaminação, e armazenadas em sacos separados, limpas durante o transporte. Uma vez recolhidas, as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C e processados dentro de 24 horas.
2. Enriquecido Cultura Preparação
- Frutas e vegetais:
- Colocar aproximadamente 10 g de material em um saco de plástico durável. Se a transformação de matérias maior, ....
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Resultados
Triagem de culturas mistas e isolados bacterianos para intI1
O conjunto iniciador HS463a / HS464 PCR pode ser usado para detectar a presença do gene da integrase íntegron-classe 1, intI1 (Figura 1). Este conjunto de iniciadores para a detecção trabalha bem intI1 em culturas mistas, e também é utilizado para rastrear colónias bacterianas colhidas a partir de placas de propagação (Figura 2). Isolados positivos devem gerar uma única banda forte e.......
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Discussão
A identificação de integrons e suas cassetes de genes associados é potencialmente um passo fundamental para prever o surgimento de novos patógenos oportunistas, acompanhamento de percursos para patógenos na cadeia alimentar humana e identificando nova resistência e virulência determinantes 8,21,26. O objetivo deste trabalho foi descrever uma abordagem simplificada para a triagem de amostras para a classe 1 integrons, caracterizando suas matrizes cassete e identificar as espécies de bactérias em que residem. E.......
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Divulgações
Os autores não têm nada de relevante a divulgar.
Agradecimentos
Graças a Michaela Hall, Larissa Bispo e Gustavo Tavares de Assistência Técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Usado em todos os PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A do pâncreas bovino) | Sigma | R6513-10MG | Usado em todos os PCRs |
| Enzima de restrição HinFI | Promega | R6201 | Usado para digerir produtos de PCR 16S rDNA. A enzima vem com tampão ideal e |
| escada BSA 100 bp | GE Healthcare | 27400701 | Usado como padrão de tamanho em todos os géis de agarose |
| Mancha de DNA GelRed | Biotium | 41003 | CUIDADO: Proteção pessoal deve ser usada ao manusear este material |
| Tiocianato de guanidínio | Life Technologies | AM9422 | CUIDADO: Proteção pessoal deve ser usada ao manusear este material |
| CLS-TC Solução | MP Biomedicals | 6540409 | Solução de ressuspensão usada no início da extração do DNA genômico |
| Lysing Matrix E Tubos FastPrep | MP Biomedicals | 116914500 | Tubo necessário para a ruptura mecânica das paredes celulares bacterianas. Este código é usado para embalagens de 500 tubos, quantidades menores estão disponíveis. |
| Matriz de ligação | MP Biomedicals | 116540408 | diluído 1:5 com tiocianato de guanidínio 6 M e usado no método de extração de DNA genômico. |
| Máquina de preparação rápida | MP Biomedicals | Número de opções disponíveis | MP Biomedicals tem várias máquinas FastPrep disponíveis para compra. Visite http://www.mpbio.com para obter mais informações |
Referências
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al.
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Reimpressões e permissões
