Heterotopic Cervical Transplante Cardíaco em Ratos

Resumo

A técnica do manguito encurta e facilita o modelo de transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos, evitando anastomoses de sutura tecnicamente desafiadoras de pequenos vasos. Os detalhes técnicos mostrados neste vídeo devem permitir que as pesquisas estabeleçam esse modelo em seus laboratórios.

Resumo

O transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos é uma ferramenta valiosa em transplantes e pesquisas cardiovasculares. A técnica do balonete simplifica muito esse modelo, evitando anastomoses de sutura desafiadoras de pequenos vasos, reduzindo assim o tempo de isquemia quente. Em comparação com o implante de enxerto abdominal, o modelo cervical é menos invasivo e o enxerto implantado é facilmente acessível para exames de acompanhamento posteriores. As anastomoses são realizadas puxando a aorta ascendente do enxerto sobre o balonete com a artéria carótida comum do receptor e puxando a artéria pulmonar principal sobre o balonete com a veia jugular externa. A seleção do tamanho adequado do manguito e a mobilização completa dos vasos são importantes para o sucesso da revascularização. A lesão de isquemia-reperfusão (I/R) pode ser minimizada pela perfusão do enxerto com solução cardioplégica e pela hipotermia. Neste artigo, fornecemos detalhes técnicos para uma técnica simplificada e aprimorada do manguito, que deve permitir que cirurgiões com habilidades microcirúrgicas básicas realizem o procedimento com alta taxa de sucesso.

Introdução

O modelo de transplante cardíaco é freqüentemente usada para investigar I / R-lesão, rejeição do enxerto, doença vascular pós-transplante ea eficiência dos agentes imunomoduladores. Mouse modelos combinam muitas vantagens como o imunológica conhecida e origens genéticas, a disponibilidade de muitas estirpes puras e transgénicas experimentais e custos relativamente baixos.

Em 1973, uma técnica de transplante cardíaco abdominal em ratinhos foi descrita pela primeira vez por Corry et al ^1. Neste modelo enxertos são revascularizada pelo ponta-a-lado anastomose da aorta ascendente a aorta abdominal do receptor e da principal artéria pulmonar à veia cava inferior. Em 1991, a técnica de sutura para o transplante cardíaco cervical em ratos foi descrita por Chen et ^al 2. Neste modelo a perfusão coronária retrógrada é estabelecido por anastomose da artéria carótida do destinatário à aorta ascendente do grpopa. Os drenos de sangue venoso, através do seio coronário no átrio direito, ventrículo direito e é ejetado através da artéria pulmonar para o destinatário veia jugular externa (Figura 1). Em comparação com a implantação do enxerto abdominal modelo cervical é menos invasiva ea localização superficial do enxerto permite um acesso muito fácil para exames de acompanhamento adicionais (por exemplo palpação, ecocardiografia, microscopia de fluorescência intravital) ^3,4.

Apesar das melhorias técnicas ^5,6, uma utilização mais generalizada deste modelo tem sido limitada devido a dificuldades técnicas para realizar anastomoses suturadas de pequenos vasos com alta incidência de vazamento de anastomose e trombose. Em 1991, Matsuura et ai. introduziu o manguito técnica em que a parede do vaso é revirado sobre um cilindro de síntese, o que facilita grandemente o modelo de transplante de coração ⁷ do colo do útero. A técnica foi further adotado para vários modelos experimentais de transplante renal, incluindo ^{8, 9} pancreático, membro ^10, hepáticos ^{11,12, 13,14} e transplante de pulmão vascular ^15. Em comparação com a técnica de sutura o tempo necessário para a anastomose e, assim, o tempo de isquemia quente é mais curto e existem complicações vasculares significativamente menor, utilizando a técnica do manguito ^16. Além disso, ele permite que os cirurgiões com pouco treinamento em microcirurgia para executar a operação com uma elevada taxa de sucesso. Uma desvantagem da técnica de braçadeira é pré-requisito para a ligação da artéria carótida comum, o que pode alterar a perfusão cerebral.

Neste artigo, apresentamos um vídeo técnica manguito melhorado e simplificado para o transplante cardíaco cervical em camundongos.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo alemão Heart Center Munique eo Governo da Baviera, Alemanha (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Os animais foram alojados em uma instalação livre de patógenos específicos e recebeu cuidados humanos em conformidade com os "Princípios de Laboratório Animal Care" formuladas pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e do "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" fornecido pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH publicação 86-23 no., revista, 1985).
NOTA: Um conjunto completo de instrumentos de microcirurgia estéreis, incluindo duas pinças curvas e dilatadores dos vasos, é necessário para o procedimento (Figura 2a). Profilaxia com antibióticos perioperatórios não é rotineiramente necessária, mas pode ser indicada em animais imunocomprometidos. Os animais foram sacrificados usando inalação de isoflurano terminal.

Doador de Preparação e Graft Colheita

1. Anestesiar o animal por via intraperitoneal (ip) de injecção de midazolam (5,0 mg / kg), medetomidina (0,5 mg / kg) e fentanil (0,05 mg / kg de peso corporal). Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre o campo operatório e confirmar tolerância cirúrgico pelo reflexo interdigital.
2. Desinfectar a pele três vezes com clorexidina e realizar uma incisão na linha média abdominal. Recolha os intestinos com gaze húmida para a esquerda para expor a veia cava inferior.
3. Injectar 50 UI de heparina diluído em 0,4 ml de solução salina através da veia cava inferior para a anticoagulação. Faça uma incisão na embarcação 1 min após heparinização.
4. Abra o diafragma e executar uma toracotomia bilateral para expor o coração. A parede anterior do tórax é refletido superiormente e mantido no lugar com um grampo.
5. Remova o timo e sem rodeios dissecar o tecido conjuntivo entre aorta e tronco pulmonar. Faça uma incisão na veia cava superior direita.
6. Perfurar a aorta ascendente mobilizado no nível doTBE com uma agulha G 30, montado sobre uma seringa de 5 ml e perfundir lentamente o coração retrogradually sem pressão excessiva, com 3 ml de 4 ° C, solução cardioplégica a frio. Evitar a entrada de ar para dentro da circulação coronária. Largar solução salina gelada para o enxerto para aumentar ainda mais a parada cardíaca.
7. Transecto a aorta proximal à origem do tronco braquiocefálico.
8. Ligadura da veia inferior e ambos cavas superior perto do coração com 8-0 seda e transecto-los para distal para as ligaduras.
9. Dissecar livre do tronco pulmonar como distalmente quanto possível. Ligadura das artérias pulmonares perto da bifurcação com 8-0 seda e transecto-los para distal.
10. Ligadura das veias pulmonares todos juntos com um único ligadura 8-0 seda e transecto-los.
11. Tiraram o coração do doador e armazená-lo em solução cardioplégica gelada até a implantação.

2. Destinatário Preparação

1. Prepararos punhos para anastomoses por corte do tubo de poliimida com um bisturi n ° 11 ou uma tesoura ao microscópio. A braçadeira é constituída por um corpo cilíndrico e uma extensão _^(1/3 da circunferência) para a colocação da pinça vascular, cada uma com um comprimento de 1 mm (Figura 2b).
2. Anestesiar o animal e confirmar tolerância cirúrgico, tal como descrito acima. Injectar 0,25 ml de soro fisiológico morno solução por via subcutânea (sc) para a reposição de líquidos.
3. Remover os pêlos da região cervical direita usando um barbeador elétrico e colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma almofada quente. Prenda os pés com fios de fita, evitando overstretching os membros dianteiros, pois isso pode comprometer a respiração. Cubra os olhos usando pomada oftálmica para prevenir o ressecamento. Desinfetar o local da cirurgia três vezes com clorexidina.
4. Faça uma incisão transversa da pele a partir do ângulo da mandíbula direito ao entalhe jugular.
5. Sem rodeios mobilizar a extErnal veia jugular. Cauterizar ramos laterais com um fórceps bipolares e transecto-los.
6. Dividir a veia jugular externa entre ligaduras no nível de confluência com a veia a partir da glândula submandibular.
7. Puxe a veia jugular externa através do manguito e oclusão do vaso proximal, colocando um grampo vascular sobre a extensão do punho. Remova a ligadura e irrigar o lúmen do vaso com 01:10 salina heparinizada.
8. Evert parede do vaso através da braçadeira e fixe-o com uma predefinição circunferencial 8-0 seda ligadura.
9. Remova a parte superficial do músculo esternocleidomastóideo.
10. Mobilizar a artéria carótida comum direita e transecto embarcação entre ligaduras abaixo da bifurcação carotídea.
11. Puxe a artéria carótida através do manguito e oclusão do vaso proximal, colocando um grampo Yasargil sobre a extensão do punho. Remova a ligadura e irrigar o lúmen do vaso com 01:10 salina heparinizada.
12. Gentilmente dilate do lúmen arterial, com um dilatador navio, everter parede do vaso através da braçadeira e fixe-o com uma predefinição circunferencial 8-0 seda ligadura.
13. Para ganhar espaço suficiente para a implantação do enxerto, remover o lobo direito da glândula submandibular.
14. Mantenha o campo operatório úmido até a implantação.

3. Enxerto Implantação

1. Coloque o enxerto na região cervical do receptor de cabeça para baixo com a aorta orientada medialmente e a artéria pulmonar lateralmente.
2. Puxe a aorta do enxerto sobre o manguito com a artéria carótida e garantir a anastomose com uma ligadura circunferencial 8-0 seda.
3. Inciso do tronco pulmonar no seu aspecto anterior e puxe-o sobre o manguito com a veia jugular externa. Novamente garantir a anastomose com uma ligadura circunferencial 8-0 seda.
4. Remover o grampo na veia jugular externa, seguindo por desclampeamento da artéria carótida. Os corações enche imediatamente com sangue. Para aumentar reperfusion cair 37 ° C soro fisiológico morno para o enxerto. Normalmente, o coração se desenvolve em ritmo sinusal dentro de um minuto. Remover o manguito extensão no local venoso.
5. Assegurar a posição correta do enxerto, anastomoses deve ser livre de tensão e vasos sem torção. Não vasos cauterizados da pele uma vez que este pode prejudicar a cicatrização de feridas. Sangramento geralmente pára espontaneamente. Fechar a pele com uma sutura contínua única 8-0.

4. Cuidados Pós-Operatórios

1. Injectar 0,25 ml quente sc solução salina para a reposição de líquidos.
2. Para antagonizar narcóticos injectar a naloxona (1,2 mg / kg), o flumazenil (0,5 mg / kg) e atipamezol (2,5 mg / kg de peso corporal) SC esquerdo do animal na almofada quente até ter recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Observar o animal durante pelo menos uma hora adicional para registar qualquer comportamento anormal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente Recovevermelho.
3. Fornecer analgesia preemptiva com buprenorfina (0,05 mg / kg sc três vezes por dia) ou uma analgesia alternativa de acordo com um protocolo institucional local por um período mínimo de 72 horas após o procedimento.
4. O cirurgião e um veterinário deve ver os animais regularmente. Em caso de perda de peso> 15%, a apatia, inchaço ou infecção lado cirúrgicos animais são sacrificados usando inalação de isoflurano terminal.

Resultados

Nossa equipe pode executar com êxito a técnica descrita após cerca de 20 cirurgias de formação. A parte mais desafiadora é a everter parede do vaso da artéria carótida sobre o punho, porque facilmente vira para trás e múltiplas tentativas podem levar a rasgar do muro. Após o período de treinamento, o tempo cirúrgico médio total foi de 60 ± 8 min. Cerca de 20 min são necessários para a colheita doador, 25 min para a preparação dos vasos cervicais e 15 minutos para anastomoses e fechamento da pele.

Discussão

Nós completamos mais de 200 transplantes cardíacos com uma taxa de sucesso superior a 90% em várias configurações experimentais. Com a técnica descrita aqui, o procedimento completo pode ser feito no prazo de 60 min por um cirurgião experiente. Ao preparar os vasos cervicais antes de colheita de órgãos, o tempo total de isquemia do enxerto pode ser limitada a 20 min. Tempo para o implante (tempo de isquemia quente) é significativamente mais curta utilizando a técnica de braçadeira em comparação com a técnica de sutura <...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça JFC-7.2	S& T	P-00036	Ponta curva 0,20 mm
Dilatador de vaso D-5a	S& T	S-00124
Adventita tesoura	S& T	S-00102
Braçadeira vascular B-1V	S& T	S-00396
Yasargil Clip	Peter Lazic	65.097	3,5 mm de comprimento
Pinça bipolar	Micromed	148-100-011	ponta 0,25 mm
Tubos de poliimida	River Tech Medical		19-24 calibre
8,0 ligaduras de seda	Catgut
Custodiol HTK solução	Essential Pharmaceuticals