Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

Resumo

O coração isolado de rato é um modelo duradouro para lesão de isquemia e reperfusão. Aqui, descrevemos o processo de coleta do coração batendo de um rato por meio de canulação aórtica in situ, perfusão de Langendorff do coração, lesão simulada de isquemia-reperfusão e coloração de infarto para confirmar a extensão do insulto isquêmico.

Resumo

Os eventos bioquímicos que envolvem a lesão de isquemia e reperfusão no cenário agudo são de grande importância para promover novas opções de tratamento para infarto do miocárdio e complicações cardíacas da cirurgia torácica. A capacidade de certos medicamentos de pré-condicionar o miocárdio contra a lesão de isquemia e reperfusão levou a vários ensaios clínicos, com pouco sucesso. O modelo de coração isolado permite a observação aguda dos efeitos funcionais da lesão de isquemia-reperfusão em tempo real, incluindo os efeitos de várias intervenções farmacológicas administradas em qualquer momento antes ou dentro da janela de lesão de isquemia-reperfusão. Como breves períodos de isquemia podem pré-condicionar o coração contra lesão isquêmica, a canulação aórtica in situ é realizada para permitir a avaliação funcional do miocárdio não pré-condicionado. Um balão cheio de solução salina é colocado no ventrículo esquerdo para permitir a medição em tempo real da geração de pressão. A lesão isquêmica é simulada pela cessação do fluxo do tampão de perfusão, seguida de reperfusão. A duração da isquemia e da reperfusão pode ser modulada para examinar eventos bioquímicos em um determinado momento. Embora o modelo cardíaco isolado de Langendorff não permita a consideração de eventos sistêmicos que afetam a isquemia e a reperfusão, é um excelente modelo para o exame de eventos funcionais e bioquímicos agudos dentro da janela de lesão de isquemia e reperfusão, bem como o efeito da intervenção farmacológica no pré e pós-condicionamento cardíaco. O objetivo deste protocolo é demonstrar como realizar a canulação aórtica in situ e a excisão cardíaca seguida de lesão de isquemia/reperfusão no modelo de Langendorff.

Introdução

A elucidação dos eventos subjacentes à resposta cardíaca tanto para isquemia e reperfusão são essencial para melhorar o tratamento de enfarte ¹ e procedimentos cirúrgicos cardíacos do miocárdio que necessitam pinçamento aórtico ^2. Embora os modelos in vivo de lesão de reperfusão de isquemia permitir análise de ponto final muito úteis, eles não são tão eficazes para estudar os efeitos funcionais da isquemia lesão de reperfusão aguda em tempo real. Além disso, em modelos de isquemia reperfusão in vivo geralmente produzem uma variabilidade significativa da dimensão do enfarte e a entrega directa de drogas para o coração no momento da reperfusão é um desafio. A utilização de um sistema de coração de Langendorff isolado para estudar a lesão por isquemia reperfusão permite a avaliação funcional em tempo real dos tratamentos farmacológicos, área uniforme do tecido enfartado e entrega instantânea de fármaco directamente ao miocárdio.

Descrita pela primeira vez by Oscar Langendorff em 1895 ^3, o coração de Langendorff isolado é um modelo robusto para o estudo da lesão de reperfusão de isquemia, tendo sido utilizado na pesquisa de isquemia reperfusão durante os últimos 40 anos ^4,5. Aqui, algumas modificações são feitas para aperfeiçoar o coração isolado para análise funcional. Em situ canulação da aorta, enquanto o coração está a bater garante que o coração não experimentar o pré-condicionamento isquémico, que iria alterar os resultados dos ensaios isquemia reperfusão ^6. Para facilitar isto, uma traqueotomia é efectuada, permitindo a ventilação e garantir a estabilidade fisiológica do rato durante a cirurgia. O coração é depois ligado a uma coluna em espiral com camisa de água de vidro através da qual tampão de Krebs Henseleit é entregue através de perfusão retrógrada directamente para a aorta. Um balão cheio de soro fisiológico é inserido no ventrículo esquerdo e ligado a um transdutor de pressão, que permite a medição das pressões em tempo real a partir do um ventrículod cálculo de vários parâmetros funcionais. Na conclusão do experimento, o coração é lavada com solução salina fria para prender contração e flash congelado em nitrogênio líquido para permitir a análise a jusante dos níveis de DNA, RNA e proteínas. Assim modificado, o coração de Langendorff perfundido serve como um sistema eficaz para a monitorização directa do efeito fisiológico de intervenções farmacológicas, em qualquer momento de forma aguda durante a lesão por isquemia-reperfusão.

Protocolo

Todos os procedimentos listados aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Medicina da Carolina do Sul. As experiências aqui descritas são, experiências agudas não-sobrevivência. Como tal, não há uso de pomada e uma suíte de cirurgia estéril não é necessária. A eutanásia por exsanguinação é conseguida durante a colheita do coração.

1. Experimental Preparação

1. Configure ou uma pressão constante ou fluxo constante de perfusão Langendorff Aparelho ^4.
2. Prepare a 4 L de Krebs Henseleit modificado (em mM: NaCl 112, KCl 5, _MgSO4 1,2, 1 K ₂ HPO _4, 1,25 de _CaCl2, 25 de _NaHCO3, 11 de D-glicose, 0,2 de ácido octanóico, pH = 7,4).
   1. Faça 10x buffers de ações.
      1. Dissolve-se NaCl, KCl, _MgSO4, e K ₂ HPO ₄ em 3 L de água ultrapura.
      2. Dissolver _CaCl2 em 500 ml de água ultrapura with 40 ml de 1 N de HCl.
      3. Adiciona-se lentamente solução de _CaCl2 ao tampão feito em 1.2.1.1. Adiciona-se água ultra-pura o suficiente para o total de 4 L. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de um filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C.
      4. Dissolver NaHCO ₃ em 4 L de água ultrapura. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de pelo filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C
   2. Combinar 400 mL de 10x tampão de Krebs Henseleit com 400 ml de 10x tampão de _NaHCO3. Adicionar água ultrapura suficiente para totalizar 4 L. Dissolver glicose e ácido octanóico, sob agitação. Filtrar através de filtro de 0,8 um.
3. Sistema de preparar-se para o coração.
   1. Adicionar 2 L de tampão de filtrado para um frasco de 4 L 38 colocado em cima da torneira de passagem ligado à cânula aórtica. Isto irá proporcionar uma pressão de perfusão de 70-80 mmHg para o coração, que é a pressão de perfusão recomendado ^4.
   2. Insira gás dispersão bubbler para o buffer na garrafa.
   3. Execute o tampão através do sistema, tendo a certeza de eliminar quaisquer bolhas de dentro da tubulação.
   4. Ligue gás (95% _{de O2} / 5% de CO _2), pelo menos, 30 min antes do coração está a ser colocado no sistema. Use uma sonda de fluxo de gás e analisador de gases de sangue para verificar a saturação de oxigênio.
4. Preparar material cirúrgico e balão.
   1. Para a colheita de coração, prepare um par de tesouras cirúrgicas 6,75 ", um par de 4.5" tesouras, dois pares de hemostats, dois conjuntos de fórceps caramalt, duas seringas com agulhas de 27 G, 2 peças de 0-medidor fio de seda (cerca de 15 cm de comprimento), uma cânula farpado 1/16 polegadas, e uma cânula traqueal.
   2. Para montar cânula traqueal, colar um pequeno pedaço de 1/16 de polegada de diâmetro tubo de plástico a um conector Y.
   3. Para montar aparelhos balão: anexar uma agulha gavagem a uma peça de 1/16 de polegada tubulação, em seguida, anexar a tubulação para habitação transdutor de pressão. Uma pequena seringa ligada ao outro lado da pressão transducer habitação vai permitir que a inflação ea deflação do balão.
      1. Corte um quadrado de envoltório e local ponta de plástico de uma agulha gavage no centro. Envolva o envoltório de plástico em torno da agulha por sonda.
      2. Encha o balão com soro fisiológico e amarrar com duas suturas. Inflar balão para garantir que não haja vazamentos. O volume de solução salina dentro do balão inflado deve ser de aproximadamente 200 ul, mas pode variar dependendo do tamanho do rato.
      3. Como alternativa, use um berço dedo de látex no lugar do plástico. Coloque agulha gavage dentro dedo berço, encha com solução salina e amarrar.

2. Colheita do coração

1. Contenha um rato Sprague Dawley utilizando um decapicone ou outro dispositivo de segurança manual. Pesar rato.
2. Administrar cetamina / mistura de xilazina (0,85 mg / kg de cetamina e 0,15 mg / kg de xilazina) através de injecção intraperitoneal para anestesiar ratos. Esta dose de anestésico irá fornecer suficientes para anestesia20-40 min, mas o procedimento deve ser concluído o mais rapidamente possível após a anestesia é confirmada.
3. Confirme grau adequado de anestesia pelo teste toe pitada reflexo.
4. Traqueotomia
   1. Retirar pele de meados de forepaw à base de mandíbula, utilizando hemostats para elevar pele e tesoura para fazer incisão. Manter a pele elevada para separá-lo do músculo subjacente, permitindo que um corte ao longo da pele e removê-lo.
   2. Usando hemostats, levante o tecido glandular e fazer uma incisão horizontal na fáscia inferior ao tecido glandular. Use hemostats para espalhar incisão aberta, tomando cuidado para não nick as veias jugulares.
   3. Usando pinças hemostáticas, músculo sobrejacente pitada traqueia, e usando uma tesoura fazer uma incisão transversal no músculo logo abaixo da ponta das pinças hemostáticas. Usando pinças hemostáticas, espalhar tecido para além de revelar traqueia.
   4. Insira com cuidado hemostats sob traquéia, limpando fáscia enquanto progredindo suavemente avançar e recuar hemostats.
   5. Uma vez hemostats são colocados com sucesso por trás da traquéia, beliscar 0-0 sutura de seda com hemostats e hemisect a traqueia com um pequeno par, de tesoura afiada.
   6. Insira cânula traqueal na traquéia hemisected, puxe sutura por trás da traquéia, e amarrar a sutura ao redor da traqueia canulada, ancorando a sutura com o Y-virilha da cânula com um nó cirurgiões.
   7. Usando uma agulha de 27 G, injectar 1.000 U / kg de heparina na veia jugular e permitir a circular durante 30 seg.
5. Toracotomia
   1. Retirar pele de meados de abdômen para região mid-pata dianteira por compressão com hemostats e corte com tesoura.
   2. Adicione uma incisão transversal ¾ de polegada na parede muscular abdominal, imediatamente abaixo do diafragma.
   3. Faça uma incisão vertical até a parede a parede abdominal e torácica, cortando ao longo do esterno.
   4. Corte o diafragma volta bilateralmente, em seguida, espalhar caixa torácica para revelar coração, ribcage braçadeira com hemostats para garantir que ele permanece spread.
   5. Usando hemostats, remova gentilmente timo, expondo a aorta ascendente.
   6. Tease hemostats através de loop aórtica, avançar e recuar hemostats e gentilmente espalhando fascia para permitir ponta de hemostats completamente.
   7. Use hemostats para puxar 0-0 sutura de seda por trás da aorta ascendente, amarre sutura em um meio-quadrado nó frouxo.
   8. Virar a torneira para iniciar o fluxo de tampão de perfusão, hemisect aorta e imediatamente inserir uma cânula para lúmen da aorta. Rapidamente apertar um nó meia-quadrado e completar o nó, apertando bem.
   9. Use a tesoura para dissecar coração longe dos grandes vasos, remova coração do peito e fixe a coluna de perfusão.
   10. Corte o excesso de tecido pulmonar e permitir que o coração se equilibrar em coluna por cerca de 15 min antes da inserção de balão. Usar uma taxa de fluxo normal do tampão por meio de coração de 10-20 ml / min.

3. Langendorff de perfusão e isquemia-reperfusão Lesão

1. Colocação de pré LVssure balão
   1. Desinflar o balão ao rolar em forma de cone e vire torneira para garantir balão continua a ser esvaziado.
   2. Excise átrio esquerdo com um pequeno par de tesouras para expor o acesso à válvula mitral.
   3. Insira balão através do átrio esquerdo e da válvula mitral em ventrículo esquerdo.
   4. Inicie o software de monitoramento de pressão (LabChart Pro).
   5. Encher o balão através da abertura de válvula e suavemente o aumento da quantidade de solução salina em balão até que a pressão diastólica leitura de micromanómetro excede zero.
   6. Para verificar a resposta comprimento-tensão, inflar o balão lentamente a uma pressão diastólica de 75 mmHg, desinflar lentamente, repetir uma vez.
   7. Regule a pressão diastólica de 10 mm Hg através da modulação da quantidade de solução salina no balão. Vire torneira para selar balão a este nível de inflação, e manter sistema de pressão fechado entre balão LV e transdutor de pressão.
   8. Lower coração em câmara câmara ea tampa aquecida com plástico.
2. De Anúnciosministração de isquemia-reperfusão Lesão
   1. Ligue o fundo da câmara de aquecimento e câmara de permitir a encher-se com tampão de Effused.
   2. Quando o buffer tenha submergido coração, virar a torneira para parar o fluxo de tampão para o coração, induzindo isquemia global. Tempo de isquemia pode variar de acordo com os objetivos do experimento.
   3. Após 30 min de isquemia, virar a torneira para restaurar o fluxo de tampão para o coração, o início da reperfusão.
   4. Permitir reperfusão do coração durante 1 hora antes de terminar o experimento. Use tempos de reperfusão variáveis, dependendo dos objetivos do experimento.
3. Rescisão de Experiência e de colheita de Tissue
   1. Usando a porta lateral de torneira, administrar 10 ml de solução salina tamponada com fosfato a 4 ° C para o coração a uma taxa de 10 ml / min para parar o coração.
   2. Remover coração da coluna perfusão, aparar restante tecido atrial.
   3. Coloque coração em uma matriz de tecido corte de aço inoxidável, cubra com Parafilm, e colocar a -80 ° C durante 8 minutos, ou até que o coração tem uma consistência como marshmallows.
   4. Remova o bloco do freezer e coloque razorblades em cortar matriz de cortar o coração em fatias de 2 mm. Blocos de tecido também pode ser comprado com outros que 2 mm tamanhos fatia.
   5. Remover fatias um de cada vez e soltar em nitrogênio líquido a piscar congelar por estudos bioquímicos. Reter a fatia ventricular terceira a partir do ápice para a coloração do enfarte.
   6. Remover o tecido a partir de azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à utilização em experiências bioquímicas.
4. Enfarte Coloração
   1. Incubar a terceira fatia ventricular em 10 mL de 1% w / v de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 37 ° C durante 15 min.
      Nota: A incubação no TTC pode ser realizada durante 15 ou 30 min, sem qualquer alteração na eficácia ^15.
   2. Transferir fatia de tecido de TTC a 10% de formalina tamponada e deixa-se incubar à temperatura ambiente durante a noite. Para melhores resultados, ouvirts deve ser retirado de formalina e fotografada dentro de 24 horas ^4.
   3. Fotografia manchado fatia e uso de software como o ImageJ para estimar o tamanho do infarto de acordo com o protocolo do fabricante. Tirar fotografias, logo que possível após a sua fixação, como o corante vai desaparecer com o tempo.

Resultados

O aparelho de balão do ventrículo esquerdo permite a monitorização em tempo real da pressão desenvolvida pela entidade ventrículo esquerdo (Figura 1). Como descrito anteriormente ^7, este traçado da pressão pode ser usado para calcular muitos dos parâmetros da função ventricular. Estes cálculos podem ser realizados na fase de linha de base, bem como a fase de reperfusão, em média, em traços múltiplos dentro de cada grupo, e comparadas a fim de determinar se a intervenção farmacológica resultou...

Discussão

O coração perfundido isolado de rato pode ser utilizado com êxito para estudar o efeito da intervenção farmacológica no pré-condicionamento cardíaco em lesão de reperfusão de isquemia ^9. No entanto, existem alguns passos essenciais para o procedimento que deve ser normalizados, a fim de assegurar a reprodutibilidade dos resultados. A manutenção de uma temperatura de 37,4 ° C no interior do sistema é crítica, já que mesmo a hipotermia e hipertermia pode causar pré-condicionamento cardíaco ^10,11. O t...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S3014
Cloreto de potássio	Sigma Aldrich	P9541
Sulfato de magnésio	Sigma Aldrich	203726
Fosfato de potássio dibásico	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma Aldrich	C8106
Sódio Bicarbonato	Sigma Aldrich	S5761
D-glicose	Sigma	Aldrich G8270
Ácido octanóico	Sigma Aldrich	C2875
Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio	Sigma Aldrich	T8877
Transdutor de pressão médica	MEMSCAP	SP844
Masterflex Bomba peristáltica	Cole Parmer	EW-07521-40
Cabeça de bomba de carga fácil Masterflex	Cole Parmer	EW-07518-10
Banho-maria circulante aquecido	Lauda	M3
	transônico	TS410
de fluxo em linha
Instrumento	do dispositivo da aquisição	PL3508
LabChart instrumentos	MLU60/8

Módulo de fluxo de tubulação Console de pesquisa modular Sensor transônico T402 Transonic ME2PXN PowerLab PL3508 da aquisição de dados de dados do dispositivo do anúncio