Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.
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Artigo de método
A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante o desenvolvimento, as células hematopoiéticas surgem a partir de um subconjunto especializado de células endoteliais, endotélio hegemônicos (HE). Desenvolvimento de modelagem HE in vitro é essencial para estudos sobre os mecanismos da transição endotelial-hematopoiético e especificação hematopoiético. Aqui, nós descrevemos um método eficiente para a indução de HE partir de células humanas estaminais pluripotentes (hPSCs) por meio de sobre-expressão de diferentes conjuntos de factores de transcrição. A combinação de ETV2 e GATA1 ou GATA2 TF é utilizado para induzir HE com potencial pan-mielóide, enquanto uma combinação de factores de transcrição e GATA2 TAL1 permite a produção de HE com eritróide e potencial megacariocítica. A adição de LMO2 para GATA2 combinação e TAL1 acelera e aumenta substancialmente a diferenciação eritróide e células megacariocíticas produção. Este método proporciona um meio eficiente e rápida de indução HE de hPSCs e permite a observação do endotélio-hematopoietitransição C numa placa de cultura. O protocolo inclui procedimentos de transdução hPSCs e análise pós-transdução de HE e progenitores do sangue.
Introdução
A capacidade única de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovar e diferenciar em células das três camadas germinativas, incluindo sangue, torná-los uma ferramenta valiosa para os estudos sobre os mecanismos de desenvolvimento hematopoiético, modelagem de doenças do sangue, despistagem de drogas, Os estudos de toxicidade, e ao desenvolvimento de terapias celulares. Porque a formação do sangue no embrião receitas provenientes endotélio hegemônicos (HE) por meio de uma transição endotelial hematopoiéticas 1,2, a geração de HE em culturas seria essencial para estudar os mecanismos moleculares que regulam a endotelial a transição hematopoié....
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Protocolo
1. Preparações de vírus e fator de transcrição Combinações
- Prepare soluções com pSIN-EF1α lentiviral plasmídeo de expressão contendo ADN que codifica a proteína para ETV2, GATA1, GATA2, e TAL1 LMO2 (Tabela 1).
- Medir a concentração e a pureza das preparações de plasmídeos usados para a produção de lentivírus gravação por absorção de UV com um espectrofotómetro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: preparações de DNA demonstrando A260 / 280 e A260 / 230 valores superiores a 1,8 são geralmente considerados de boa qualidade. Baixa A260 / 280 valores podem indicar contaminação de proteína, enquanto os menores valores A260 / 230 in....
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Resultados
O diagrama esquemático de HE e indução de sangue hPSCs por sobre-expressão de factores de transcrição é apresentada na Figura 1. ETV2 combinação com GATA1 ou GATA2 induz a hematopoiese pan-mielóide, enquanto um GATA2, TAL1 +/- combinação LMO2 induz a hematopoiese predominantemente eritro-megacariocítica. Ambas as combinações TF diretamente induzida células o que, posteriormente, transformadas em células progenitoras de sangue com um espectro distinto de diferenciação hematopoiética. Dif.......
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Discussão
O método acima descrito para a diferenciação hematopoiética da hPSCs por sobre-expressão de TF, representa uma abordagem rápida e eficiente para a geração de HE e mielóides e erytho-magakaryocytic progenitores de hESCs e iPSCs, permitindo assim a produção de até 30 milhões de células de sangue de um milhão de células-tronco pluripotentes 10. Este método exibiu diferenciação consistente em várias linhas de células estaminais embrionárias humanas e IPSCs 10. Durante a diferenciação por ETV2 e GATA2, .......
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Divulgações
IS é acionista fundador e consultor de Cynata.
Agradecimentos
Agradecemos a Matt Raymond pela assistência editorial. Este trabalho foi apoiado por fundos do Instituto Nacional de Saúde (U01HL099773, R01HL116221 e P51 RR000167) e da Fundação Charlotte Geyer.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
Tabela 1. Indução de diferenciação de hPSCs com fatores de transcrição e análise de endotélio hemogênico e células sanguíneas. | |||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Vetor Lentiviral |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Vetor Lentiviral |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Vetor Lentiviral |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Vetor Lentiviral |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Vetor Lentiviral |
| Brometo de hexadimetrina (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Polímero catiônico usado para aumentar a eficiência da infecção |
| Y-27632 (Dicloridrato) Inibidor de ROCK | Tecnologias STEMCELL | 72302 | Inibidor da via RHO/ROCK Inibe o |
| Reagente de Dissociação de Células ACCUTASE ROCK StemPro | Life Technologies | A11105-01 | Reagente |
| Incompleto (livre de fator de crescimento) meio de cultura mTeSR1 Formulação personalizada | Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI) | MCF | Meio mTeSR1 sem soro sem bFGF e TGFb |
| humano SCF | Peprotech | 300-07 | |
| TPO humano | Peprotech | 300-18 | Grau de pesquisa |
| humano FGF-básico | Peprotech | 100-18B | Grau premium |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Marcador endotelial (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoiético ( FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoiética (FACS) |
| CD73 APC | R& D Systems | FAB5795A | Marcador Endotelial (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoiética (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Ensaio Vivo/Morto (FACS) |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Fixação de células |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilização |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Soro fetal bovino |
| Camundongo anti-humano CD43 | BD Biosciences | 551457 | Anticorpo primário puro para coloração de imunofluorescência (IF) |
| Coelho anti-humano VE-caderina | BenderMedSystem | BMS158 | Primário (IF) |
| Anti-coelho Alexa Fluor 488-conjugado | JacksonResearch | 715-486-152 | Secundário (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugado | JacksonResearch | 715-516-150 | Secundário (IF) |
| Coloração de ácido nucleico DAPI | Life Technologies | D1306 | Ensaio vivo/morto (IF) |
| Meio clonogênico MethoCult H4435 Enriquecido | STEMCELL Technologies | 4435 | Ensaio CFC |
| Wright Solução de coloração | Sigma -Aldrich | 32857 | Coloração cytospins |
Tabela 2. hPSCs culture. | |||
| Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) | Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) células-tronco embrionárias humanas; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) células-tronco pluripotentes induzidas por transgenes | As hPSCs são capazes de se auto-renovar e se diferenciar em células de três camadas germinativas |
| Meio completo sem soro para cultura de hPSCs Mídia mTeSR1 | Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI) | M500 | Meio sem soro com fatores de crescimento para cultura livre de alimentadores de ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matriz para manutenção de ESC/iPSCs humanos |
| DMEM/F-12, pó | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Protease neutra, Dissociação celular |
Tabela 3. Primers para detecção de integração genômica do vírus. | |||
| Nome do Primer | Avançado (Fwd) 5' -->3' < / forte > | < forte > reverso (Rev) 5 '--> 3 ' | Descrição |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA- | - | EF1a sequência promotora |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Região de codificação |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Região de codificação |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Região de codificação |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGT AGA GGC | Região de codificação |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Região de codificação |
Referências
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mo....
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Reimpressões e permissões
