A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

Resumo

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

Resumo

Durante o desenvolvimento, as células hematopoiéticas surgem a partir de um subconjunto especializado de células endoteliais, endotélio hegemônicos (HE). Desenvolvimento de modelagem HE in vitro é essencial para estudos sobre os mecanismos da transição endotelial-hematopoiético e especificação hematopoiético. Aqui, nós descrevemos um método eficiente para a indução de HE partir de células humanas estaminais pluripotentes (hPSCs) por meio de sobre-expressão de diferentes conjuntos de factores de transcrição. A combinação de ETV2 e GATA1 ou GATA2 TF é utilizado para induzir HE com potencial pan-mielóide, enquanto uma combinação de factores de transcrição e GATA2 TAL1 permite a produção de HE com eritróide e potencial megacariocítica. A adição de LMO2 para GATA2 combinação e TAL1 acelera e aumenta substancialmente a diferenciação eritróide e células megacariocíticas produção. Este método proporciona um meio eficiente e rápida de indução HE de hPSCs e permite a observação do endotélio-hematopoietitransição C numa placa de cultura. O protocolo inclui procedimentos de transdução hPSCs e análise pós-transdução de HE e progenitores do sangue.

Introdução

A capacidade única de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovar e diferenciar em células das três camadas germinativas, incluindo sangue, torná-los uma ferramenta valiosa para os estudos sobre os mecanismos de desenvolvimento hematopoiético, modelagem de doenças do sangue, despistagem de drogas, Os estudos de toxicidade, e ao desenvolvimento de terapias celulares. Porque a formação do sangue no embrião receitas provenientes endotélio hegemônicos (HE) por meio de uma transição endotelial hematopoiéticas ^1,2, a geração de HE em culturas seria essencial para estudar os mecanismos moleculares que regulam a endotelial a transição hematopoiético e especificação hematopoiético. Os métodos actuais para estudos de HE baseiam-se na indução de diferenciação hematoendothelial em agregados (EBS) com a adição de citocinas hematopoiéticas ^3-5, e de co-cultura com células estromais hPSCs hematopoiese ^6,7-suporte ou em culturas bidimensionais com extracelular matrizes e cytokines ^8,9. Estes métodos clássicos de diferenciação são baseadas na introdução de sinais externos que actuam na superfície da célula e iniciar a cascata de vias moleculares que conduzem eventualmente à activação transcricional de programa que controla o desenvolvimento hematoendothelial. Assim, a eficiência do hPSCs diferenciações nestes sistemas depende de uma indução eficaz desses sinais, a transdução de sinal para o núcleo, e a resultante activação da transcrição específicas de reguladores. Além disso, o estudo de HE em culturas de diferenciação convencionais requer o passo adicional de isolar as células HE utilizando separação de células. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a indução direta de HE e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição hematopoiéticas. Este método permite a indução eficiente de HE em um prato e a observação directa da endotelial de transição hematopoiética sem a necessidade de isolamento de HE utilizando um procedimento de separação de células pesado.

Formação de HE e sangue a partir de células-tronco pluripotentes humanas podem ser eficientemente induzida pela superexpressão apenas alguns fatores de transcrição (TFS). A combinação ideal de TFs capazes de induzir robusto hematopoiese pan-mielóide de hPSCs inclui ETV2 e GATA1 ou GATA2. Em contraste, a combinação de GATA2 e TAL1 induz erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programação hPSCs através da superexpressão desses fatores diferencia hPSCs diretamente para o VE-cad ⁺ CD43 ^- CD73 ^- HE células que gradualmente adquirir o fenótipo hematopoiéticas definido pela expressão do marcador CD43 cedo hematopoiéticas ^7. Este método baseia-lentiviral para a programação directa das células estaminais pluripotentes humanas método é aplicável para a geração de HE e células do sangue para os estudos mecanicistas, estudos de transição para endotelial e hematopoiética, a regulação da transcrição de desenvolvimento hematopoiético e especificação. Embora o Current protocolo descreve a produção de sangue usando a expressão constitutiva dos transgenes, resultados semelhantes podem ser obtidos utilizando modificado mRNA ^10.

Protocolo

1. Preparações de vírus e fator de transcrição Combinações

1. Prepare soluções com pSIN-EF1α lentiviral plasmídeo de expressão contendo ADN que codifica a proteína para ETV2, GATA1, GATA2, e TAL1 LMO2 (Tabela 1).
2. Medir a concentração e a pureza das preparações de plasmídeos usados ​​para a produção de lentivírus gravação por absorção de UV com um espectrofotómetro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: preparações de DNA demonstrando A260 / 280 e A260 / 230 valores superiores a 1,8 são geralmente considerados de boa qualidade. Baixa A260 / 280 valores podem indicar contaminação de proteína, enquanto os menores valores A260 / 230 indicam impurezas com sais ou algum solvente tal como fenol. Plasmídeo concentração recomendada é 1-3 mg / mL.
3. Produção de lentivírus para transduções como descrito em protocolos previamente publicados ^11. Indução de HE com potencial pan-mielóide requer co-expressão de ETV2 e GATA1, ou ETV2 e GATA2.Indução de HE com potencial eri e megakaryocytic requer GATA2 e TAL1. A adição de LMO2 melhora significativamente o rendimento de células a partir de eritro-megacariocítica hPSCs na presença de GATA2 e TAL1 ^10.

2. hPSCs Cultura Protocol

1. Cultivar células-tronco pluripotentes em colônias apertados com bordas afiadas para 70-80% de confluência antes de subcultura. Mark e remover diferenciado espontaneamente colônias antes passaging células.
2. Dilui-se em gel de matriz extracelular comercial (ver Tabela 2) de acordo com as instruções do fabricante e as placas de revestimento de 6 poços durante a noite a 4 ° C, ou durante pelo menos uma hora a 37 ° C antes de usar. Antes passaging células, aspirar a matriz, adicionar 2 ml de culturemedium completa comercial fresco (ver Tabela 2) e manter a 37 placas ° C, _5% de CO2 até as células estão prontas para semeadura.
3. HPSCs Passage
   1. Aspirate meio de um poço de uma placa confluente de 6 poços com hPSCs e adicionar 1,5 ml de uma solução pré-aquecida Dispase II (2 mg / ml em DMEM / F12, esterilizado por filtração através de filtros de 0,22 um). Incubar durante 5-7 min a 37 ° C, _5% de CO2 até as bordas das colónias começam a levantar a partir da superfície.
   2. Aspirar solução Dispase II e lava-se cuidadosamente as colónias duas vezes e, em seguida pela adição de aspiração 2 ml de meio DMEM / F12 fresco. Em seguida, usando uma pipeta de vidro de 5 ml serológico, dissociar hPSCs com 3 ml de meio de cultura completo comercial fresco (ver Tabela 2) suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
   3. Adicionar 0,5 ml de suspensão de células a cada poço de uma placa de 6 poços contendo 1,5 ml de meio de cultura completo comercial (ver Tabela 2). Agitar placa frente e para trás e para a direita para a esquerda várias vezes para assegurar uma distribuição uniforme de células quando situar a placa na incubadora. Manter as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 18-24 horas.
   4. A próxima mudança de meio dia ao meio de cultura completo comercial fresco (ver Tabela 2) e examinar hPSCs morfologia. Passaging resultados bem sucedidos em pequenas colônias, bem-inscritos retenção HPSC morfologia. hPSCs deve ser alimentado com 2,5-3 ml freshmedium por poço, numa base diária e passadas a cada 4-5 dias a não mais do que 70-80% de confluência.
      NOTA: Se hiPSCs foram mantidas em fibroblastos embrionários de ratinho (MEFs), que necessitam de ser transferidos para condições isentas de alimentação e passadas 2-3 vezes antes de transdução para assegurar a diferenciação eficiente.

3. Indução da Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (dia 0, transdução de hPSCs)

1. Para preparar o meio de reacção combinar 1,3 ml de meio isento de soro comercial completa (ver Tabela 2), vírus, polibreno, e Y27632 inibidor ROCHA (Tabela 1): adicionar 1,3 mL de 10 mM de inibidor de rocha para 1,3 ml de meio a um Concentra definitivação de 10 uM, e polibreno a uma concentração final de 6 ug / ml.
   1. Adicionar uma quantidade apropriada de concentrado virai (s) a uma concentração final de 0,5-1,0 MOI (multiplicidade de infecção) de cada vírus por célula. Manter meio reaccional em gelo ou a 4 ° C até que a suspensão de célula única é pronto.
      NOTA: A mesma quantidade de MOI para cada vírus no GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, e misturas GATA2 / TAL1 / LMO2 reacção é óptima para a indução de diferenciação. Culturas No entanto, em ETV2 / GATA2 transduzidas dobrando para GATA2 MOI, em relação ao ETV2, aumenta a diferenciação. Por isso, para estas culturas, proporção de 1: 2 para MOI de ETV2 e uma MOI de GATA2 é recomendada (por exemplo, se concentrado virai é estimado de aproximadamente 6.8 x 10 ⁷ partículas / ml, adicionar 10 ul de ETV2 e 20 ul de GATA2 concentrados virais para 0,68 x 10 ⁶ culas por uma reacção ETV2 / GATA2 em um poço de 35 mm de uma placa de 6 poços).
2. Prepare hPSCs em uma única célula suspension.
   1. HPSCs crescer em condições de livre-de alimentação, conforme descrito na seção 2. No dia 4 após a última passagem, observe densidade celular e morfologia sob um microscópio invertido. hPSCs deve crescer em colónias apertadas com arestas afiadas sem diferenciação espontânea e atingir ~ 60-70% de confluência no dia da transdução.
   2. Aspirar o meio, adicionar 1,5-2 ml de reagente de dissociação de células comercial (Tabela 1) por poço e incubar a 37 ° C com 5% _de CO 2 durante 5-7 min.
   3. Recolher as células em volumes iguais de meio completo comercial (ver Tabela 2) com 10 uM de inibidor de ROCK, contar as células e determinar a viabilidade. As células por centrifugação a 200 xg durante 5 min e em seguida ressuspender as células em meio completo comercial com 10 uM de inibidor de rocha para uma concentração de 3.4-5 x 10 ⁶ culas por ml.
      NOTA: A viabilidade das células é crítico para a transdução viral bem sucedida e subsequente diferenciação.Tipicamente, a viabilidade das células antes de transdução deve ser superior a 90%.
3. Adicionar 200 ul da suspensão de células, contendo 0.68-1 x10 ⁶ células, em 1,3 ml do meio de reacção preparado em 3.1.
4. Aspirar a solução de matriz revestido do placa de 6 poços durante a noite preparado em 2.2., Transferir a mistura de reacção para um poço de uma placa de 6 poços e distribuir as células uniformemente. Incubar a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 24 horas. Após 24 h, pelo menos, 80% das células devem ser ligados à matriz.

4. Indução de Hematoendothelial Precursores de hPSCs (dia 1-7)

1. 24 horas após a transdução, remover o meio contendo vírus e lavar as células anexadas com meio de cultura celular incompleta comercial (ver Tabela 1) e, em seguida, adicionar 3 ml por poço de meio de cultura celular incompleta comercial contendo citocinas hematopoiéticas: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (doravante referidas como 3F-médio).
2. Substitua médio total, com frescos 3F-médio nos dias 2, 3 e 4 dias para remover as células mortas e detritos. Após o dia 4, quando as células hematopoiéticas flutuantes estão surgindo, substitua metade do 3F de médio a cada dois dias, mantendo o volume total em 4 ml.
   NOTA: pSIN-EF1α expressão lentiviral plasmídeos incorporar gene de resistência à puromicina permitindo assim a selecção positiva de células transduzidas. A 1 ug / ml de puromicina pode ser adicionado ao meio durante os primeiros 1-2 dias de diferenciação para eliminar os eventuais hPSCs indiferenciadas residuais.
3. Observar a morfologia das células no dia 4 sob um microscópio invertido: aglomerados apertados de células com morfologia típica endoteliais começam a aparecer (Figuras 2A, 3A). Glóbulos redondo é exibido a partir do dia 5 ao dia 7 de diferenciação, enquanto algumas áreas podem reter hPSCs morfologia. Analise HE e diferenciação hematopoiética, tal como descrito abaixo.
   NOTA: diferente hematoendothelial bem sucedidaiation resulta na produção de células sanguíneas que aparecem como células refrácteis redondos frouxamente ligado às células endoteliais planas subjacentes. Estas células proliferam activamente formar pequenos agregados, e, eventualmente, destacar e flutuador (Figuras 2A e 3A). Células do sangue ao vivo pode ser visualmente distinguida das células mortos e moribundos com base na sua capacidade para reflectir a luz e a expandir-se em condições de cultura.

5. Análise da hegemônicos endotélio (HE) estágio de diferenciação.

1. Detectar a formação de HE entre os dias 3 e 4 de diferenciação por observação microscópica de células com morfologia endotelial. Não há glóbulos flutuantes em cultura nesta fase da diferenciação. A presença de HE pode ser confirmado pela coloração de imunofluorescência e citometria de fluxo análise utilizando anticorpos VE-caderina, CD73, CD226 e CD43.
   1. Avaliar a formação de células HE por usar a análise de citometria de fluxo no dia 3e dia 4 a partir de uma experiência. Recolher as células por incubação das culturas com reagente de dissociação de células comercial (ver Tabela 1) durante 5-10 min a 37 ° C, 5% de CO ₂ e, em seguida, utilizar-se para 1 x 10 ⁵ células por reacção de coloração (citometria de fluxo descrito no procedimento de coloração ^12).
      NOTA: VE-caderina ⁺ HE células adquirem expressão de início hematopoiéticas marcador CD226, mas falta a expressão de CD73 e CD43 ^6. Em contraste, células não-HE expressam CD73 (Figuras 2B, 3B).
2. Imunofluorescência para HPSC derivado HE.
   1. Lavar a monocamada de células de ligado de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida fixar as células em 4% de paraformaldeído de 30 a 60 min à temperatura ambiente.
   2. Lavar as células novamente com PBS e depois permeabilizam utilizando 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 20 min à temperatura ambiente.
   3. Lavar as células com PBS, duas a três vezes e, em seguida, incuba-setampão consistindo em PBS com 10% de soro fetal de bovino (FBS) de bloqueio, durante 30 a 120 min.
   4. Preparar a solução de coloração, contendo ambos os anticorpos primários (1: 1000 de diluição) rato CD43 anti-humano de coelho e anti-humanos VE-caderina em PBS com 5% de FBS, (Tabela 1).
   5. Aspirar o tampão de bloqueio a partir das células e adicionar 1 ml por poço de tampão de coloração com os anticorpos primários adicionados; incubar 3 horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C.
   6. Lavam-se as células três vezes por adição de 2 ml de PBS com 5% de FBS.
   7. Preparar um segundo tampão de coloração, contendo anticorpos secundários na diluição 1: 500 em PBS com FBS a 5%: burro anti-coelho conjugado com corante fluorescente verde, e anti-ratinho conjugado com corante fluorescente vermelho (Tabela 1). Adicionar 1 ml por poço de tampão de coloração secundário e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
   8. Lavar três vezes com PBS sem soro. Células mancha com 300 nM DAPI solução de trabalho em dH2 O por 10-15 min.
   9. Lavar as células duas vezes com PBS e adicionar 2-3 mL de PBS na cavidade com células coradas. Observe fluorescência com filtros microscópio verdes, vermelhas e azuis.

6. Análise de Induzidos hematopoéticas Precursores

1. Manter culturas de diferenciação até células flutuantes expanda significativamente, até 10-14 dias, mudando metade do 3F-forma, tal como descrito em 3.1, a cada dois dias.
2. Dissociar e recolher diferenciação monocamadas de células por tratamento das células com um reagente de dissociação de células comercial (ver Tabela 1) durante 5-10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
3. Realizar citometria de fluxo utilizando anti-VE-caderina, anticorpos CD43 e CD45 para avaliar a hematopoiese nas culturas ^12. Note-se que uma grande fracção de células, até 40% das células transduzidas ETV2 e GATA2, co-expressa VE-CAD e CD43. Os seguintes anticorpos podem ser utilizados para detectar a linhagens celulares específicas e seguintesXpansion ou diferenciação de células progenitoras de sangue induzidos: CD235a (células eritróides), CD41a (megacariocítica), CD32 (todos os tipos de células mielóides), CD66b (neutrófilos) e CD163 (macrófagos).
4. Realizar CFC-ensaio utilizando um meio comercial clonogénicas (Tabela 1) de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Transferir 1-2 x 10 ⁴ células em 3 ml de meio clonogénico comercial (ver Tabela 3) para avaliar o número de células formadoras de colónias e tipos de colónias hematopoiéticas. Densidade de sementeira óptima permite a identificação e isolamento de colónias únicas que crescem separadamente uns dos outros e não se sobrepõem. Densidade de sementeira podem variar entre experiências, dependendo da eficiência de diferenciação, mas não deve ser superior a 1 x 10 ⁴ culas por 1 ml de meio clonogénico comercial.
   2. Misture as células em meio clonogénico comercial em vórtice suave e transferir 3 ml de suspensão de dois pratos de 35 mm ultra-baixas de fixaçãoCFC para o ensaio, 1,5 ml de suspensão em cada prato. Distribuir uniformemente meio e incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 14 dias. Evite perturbar os pratos; observar a formação de colónias no dia 7 e dia 10 de ensaio.
   3. Identificar e contar colônias hematopoiéticas de acordo com suas morfologias no dia 14.

Resultados

O diagrama esquemático de HE e indução de sangue hPSCs por sobre-expressão de factores de transcrição é apresentada na Figura 1. ETV2 combinação com GATA1 ou GATA2 induz a hematopoiese pan-mielóide, enquanto um GATA2, TAL1 +/- combinação LMO2 induz a hematopoiese predominantemente eritro-megacariocítica. Ambas as combinações TF diretamente induzida células o que, posteriormente, transformadas em células progenitoras de sangue com um espectro distinto de diferenciação hematopoiética. Dif...

Discussão

O método acima descrito para a diferenciação hematopoiética da hPSCs por sobre-expressão de TF, representa uma abordagem rápida e eficiente para a geração de HE e mielóides e erytho-magakaryocytic progenitores de hESCs e iPSCs, permitindo assim a produção de até 30 milhões de células de sangue de um milhão de células-tronco pluripotentes ^10. Este método exibiu diferenciação consistente em várias linhas de células estaminais embrionárias humanas e IPSCs ^10. Durante a diferenciação por ETV2 e GATA2, ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tabela 1. Indução de diferenciação de hPSCs com fatores de transcrição e análise de endotélio hemogênico e células sanguíneas.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Vetor Lentiviral
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Vetor Lentiviral
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Vetor Lentiviral
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Vetor Lentiviral
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Vetor Lentiviral
Brometo de hexadimetrina (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Polímero catiônico usado para aumentar a eficiência da infecção
Y-27632 (Dicloridrato) Inibidor de ROCK	Tecnologias STEMCELL	72302	Inibidor da via RHO/ROCK Inibe o
Reagente de Dissociação de Células ACCUTASE ROCK StemPro	Life Technologies	A11105-01	Reagente
Incompleto (livre de fator de crescimento) meio de cultura                                                                                          mTeSR1 Formulação personalizada	Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI)	MCF	Meio mTeSR1 sem soro sem bFGF e TGFb
humano SCF	Peprotech	300-07
TPO humano	Peprotech	300-18	Grau de pesquisa
humano FGF-básico	Peprotech	100-18B	Grau premium
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Marcador endotelial (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoiético ( FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoiética (FACS)
CD73 APC	R& D Systems	FAB5795A	Marcador Endotelial (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoiética (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Ensaio Vivo/Morto (FACS)
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Fixação de células
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilização
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Soro fetal bovino
Camundongo anti-humano CD43	BD Biosciences	551457	Anticorpo primário puro para coloração de imunofluorescência (IF)
Coelho anti-humano VE-caderina	BenderMedSystem	BMS158	Primário (IF)
Anti-coelho Alexa Fluor 488-conjugado	JacksonResearch	715-486-152	Secundário (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugado	JacksonResearch	715-516-150	Secundário (IF)
Coloração de ácido nucleico DAPI	Life Technologies	D1306	Ensaio vivo/morto (IF)
Meio clonogênico MethoCult H4435 Enriquecido	STEMCELL Technologies	4435	Ensaio CFC
Wright Solução de coloração	Sigma -Aldrich	32857	Coloração cytospins
Tabela 2. hPSCs culture.
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs)	Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) células-tronco embrionárias humanas; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) células-tronco pluripotentes induzidas por transgenes	As hPSCs são capazes de se auto-renovar e se diferenciar em células de três camadas germinativas
Meio completo sem soro para cultura de hPSCs                                                                                                      Mídia mTeSR1	Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI)	M500	Meio sem soro com fatores de crescimento para cultura livre de alimentadores de ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matriz para manutenção de ESC/iPSCs humanos
DMEM/F-12, pó	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Protease neutra, Dissociação celular
Tabela 3. Primers para detecção de integração genômica do vírus.
Nome do Primer	Avançado (Fwd)  5' -->3' < / forte >	< forte > reverso (Rev) 5 '--> 3 '	Descrição
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA-	-	EF1a sequência promotora
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Região de codificação
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Região de codificação
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Região de codificação
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGT AGA GGC	Região de codificação
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Região de codificação

de Dissociação Celular de grau premium