Visual Gravação Potencial Evocado em um modelo de rato de Experimental Nervo Óptico desmielinização

Resumo

A desmielinização focal é induzida no nervo óptico usando microinjeção de lisolecitina. Os potenciais evocados visuais são registrados por meio de eletrodos cranianos implantados sobre o córtex visual para examinar a condução do sinal ao longo da via visual in vivo. Este protocolo detalha os procedimentos cirúrgicos subjacentes ao implante do eletrodo e à microinjeção do nervo óptico.

Resumo

O registro do potencial evocado visual (PEV) é amplamente utilizado na prática clínica para avaliar a gravidade da neurite óptica em sua fase aguda e para monitorar o curso da doença no período de acompanhamento. Alterações nos parâmetros do VEP estão intimamente correlacionadas com danos patológicos no nervo óptico. Este protocolo fornece uma descrição detalhada sobre o modelo de microinjeção de nervo óptico em roedores, no qual uma lesão parcial de desmielinização é produzida no nervo óptico. Técnicas de gravação VEP também são discutidas. Usando eletrodos implantados no crânio, somos capazes de adquirir traços reprodutíveis de VEP intra-sessão e entre sessões. Os VEPs podem ser registrados em animais individuais durante um período de tempo para avaliar as alterações funcionais no nervo óptico longitudinalmente. O modelo de desmielinização do nervo óptico, em conjunto com o protocolo de registro do VEP, fornece uma ferramenta para investigar os processos patológicos associados à desmielinização e remielinização, e pode potencialmente ser empregado para avaliar os efeitos de novos medicamentos remielinizantes ou terapias neuroprotetoras.

Introdução

A neurite óptica é uma das formas mais comuns de neuropatia óptica, causando perda total ou parcial da visão¹. Histologicamente, caracteriza-se por desmielinização inflamatória, perda axonal das células ganglionares da retina e graus variados de remielinização no nervo óptico². A neurite óptica geralmente é o início manifesto da esclerose múltipla. O potencial evocado visual (PEV) é uma ferramenta não invasiva para investigar a função do sistema visual. Reflete a função pós-retiniana da retina para o córtex visual primário e é afetada em muitas condições de doença do nervo óptico³. O VEP tem sido predominantemente utilizado em pacientes com neurite óptica para avaliar a integridade da via visual⁴.

A latência do VEP, que reflete a velocidade de condução do sinal ao longo da via visual, é considerada uma medida precisa do nível de alterações associadas à mielina no nervo^óptico5; enquanto a amplitude do VEP é Essa hipótese foi bastante bem estabelecida usando o modelo de rato de desmielinização do nervo óptico induzida por lisolecitina⁵.

Aqui, explicamos um protocolo abrangente de técnica de microinjeção de nervo óptico em roedores, que pode minimizar os danos relacionados à manipulação cirúrgica ao nervo per se, bem como aos tecidos adjacentes, como músculos extraoculares e vasos sanguíneos. Além disso, a cirurgia de implante de eletrodo de crânio foi descrita para registro de VEP em animais⁷. As gravações de VEP podem ser realizadas repetidamente em animais durante um período de tempo para avaliar as alterações relacionadas à desmielinização/remielinização, bem como o impacto na integridade axonal do nervo óptico.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com o Código de Prática australiano para o Cuidado e Utilização de animais para fins científicos e as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research, e foram aprovadas pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Macquarie.

1. VEP Eletrodo Implantação

1. Anestesiar o animal com uma injecção intraperitoneal de cetamina (75 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg).
   Nota: Após a indução da anestesia, observar os reflexos de retirada (teste beliscão, reflexos da córnea e da pálpebra, etc.) e sua ausência como uma indicação para começar a cirurgia. Continuamente monitorar animais durante toda a cirurgia e administrar anestésico adicional (10% da dose inicial por cetamina top-up), se os reflexos estão presentes. Ratos adultos (> 12 semanas) são utilizados nas experiências.
2. Raspar a pele da área cirúrgica.Colocar o animal numa almofada de aquecimento (37 ° C) para manter a temperatura do corpo durante a cirurgia. Prepare a pele através da aplicação tópica de povidona-iodo. Aplicar drapeados cirúrgico. Aplicar pomada oftálmica tópica para prevenir o ressecamento da córnea sob anestesia geral. Manter assepsia utilizando instrumentos esterilizados.
3. Faça uma incisão cutânea longitudinal na linha média da pele cabeça. Limpar o tecido conjuntivo para conseguir uma boa exposição do crânio.
4. Cuidadosamente, perfurar pequenos buracos burr manualmente usando uma broca de micro mão em 7 mm para trás do bregma e 3 mm lateral à linha média.
5. Eléctrodos de parafuso do implante através do crânio para o córtex (zona 17), que penetram no córtex a uma profundidade de aproximadamente 0,5 mm. Implantar um eletrodo parafuso de referência na linha média 3 mm rostral do bregma. Aplique o cimento dental para envolver e fixar os parafusos (nem sempre necessário).
6. Suturar a pele da cabeça, administrar pomada antibiótica na pele e permitir que o animal recover da anestesia em uma almofada de aquecimento.
   Nota: Em alternativa, os eléctrodos podem ser deixada exposta, de forma que a pele não precisa ser reaberto em cada gravação. Imediatamente após a cessação da cirurgia, mas antes da recuperação da anestesia, administrar uma droga não-esteróide anti-inflamatório (NSAID) (se não for administrado no período pré-operatório), ou um analgésico opióide. Monitorar os animais constantemente até a recuperação completa de anestésico e totalmente ambulatorial.
7. Permitir que pelo menos uma semana para os animais para se recuperar da cirurgia antes da gravação VEP.

2. Optic Nerve Injeção

1. Anestesiar o animal, preparar a pele e aplicar drapejar como acima (1.1 e 1.2).
2. Adicione um, de 1 a 1,5 cm de incisão na pele acima da órbita de um olho seleccionada aleatoriamente. Abra o tecido subcutâneo para alcançar a cavidade orbital usando íris tesoura fina. Abra a conjuntiva e anterior da cápsula de Tenon sob o microscópio de operação.
3. Retrair o extraocularmúsculos e as glândulas lacrimais intraobital para expor aproximadamente 3 mm de comprimento do nervo óptico. Abra as camadas da dura e matéria aracnóide ao redor do nervo óptico longitudinalmente usando uma lâmina oftalmológica.
4. Inserir a pipeta de vidro para o nervo óptico a uma distância de 2 mm posterior ao globo. A micropipeta de vidro é ligada a uma seringa Hamilton.
5. Injectar 1% lisolecitina (0,4-1,0 mL, com 0,02% de azul de Evan, que não tem efeitos sobre a mielinização) lentamente no nervo aproximadamente ao longo de um período de 30 seg.
6. Suturar a incisão na pele. Aplicar pomada antibiótica para prevenir a infecção. Olhos do companheiro pode ser servido como controles internos para gravações de eletrofisiologia.
7. Colocar os animais numa almofada de aquecimento para recuperar da anestesia.

3. VEP Recording

1. Anestesiar o animal e preparar a pele como 1.1 e 1.2.
   Nota: Baixa dose de anestésico pode ser utilizado para reco electrofisiológicording (cetamina 40 mg / kg de medetomidina e 0,25 mg / kg).
2. Coloque o rato em um quarto escuro e deixe-a adaptar-se à escuridão por 5-30 min. Em alguns casos os ratos podem respectivamente ser escuro O adaptados / N para scotopic ou luz adequada para gravações photopic VEP ^8.
3. Manter a temperatura do corpo a 37 ± 0,5 ° C, segundo o sistema de cobertor Homeotérmica com uma sonda do termómetro rectal.
4. Dilatar as pupilas com 1,0% tropicamide colírio. Abra a pele sobre o crânio para aceder ao pré-colocada em eléctrodos de parafuso situ.
5. Ligar o parafuso ao longo do córtex visual do olho contralateral estimulada e o parafuso de referência para o amplificador. Insira um eletrodo de agulha na cauda como o chão. Medir e manter a impedância do eléctrodo inferior a 5 kW.
6. Coloque um estimulador mini-Ganzfeld diretamente sobre a pele ao redor das pálpebras para fornecer isolamento superior de olho ^7. A iluminação do estimulador necessita de ser calibrado de antemãopor um fotómetro.
7. Entregar fotostimulação através de flashes de luz 100 vezes a uma frequência de 1 Hz, com configurações de filtro passa-banda de baixa e alta de 1 e 100 Hz, respectivamente. A taxa de amostragem de sinal é a 5 kHz.
   Nota: devem ser sujeitos a amostragem Sinais de, pelo menos, a cerca de 250-300 Hz para assegurar que mais que duas amostras são recolhidas durante cada ciclo.
8. Suturar a pele para trás e manter os animais em uma almofada de aquecimento para se recuperar da anestesia. A gravação pode ser repetidamente gravado em animais individuais para monitorar as alterações funcionais ao longo de um período de tempo.
9. No ponto final, administrar uma injecção sobredosagem de pentobarbitona de sódio (100 mg / kg, ip) de sacrificar o animal. Confirme a eutanásia por parada cardíaca, parada respiratória e diminuição da temperatura corporal.

4. Preparação de tecidos e Histologia

1. Remova os nervos ópticos de animais sacrificados sob o microscópio e fixar o tecido em paraformaldeído 1% O / N.
2. Lavar cuidadosamente o tecido com solução salina. Tratar o tecido em um processador de tecido automático e incorporar em parafina. Seções de corte (5-10 um) usando um micrótomo rotativo.
   Nota: Para o estudo imuno-histoquímica, fixar o tecido em paraformaldeído a 1%, lavou-se com solução salina e incubar com 30% de sacarose S / N. Tecido incorporar em outubro incorporação médio e fazer criosecções usando um criostato.
3. Incubar seções em 0,1% rápida solução de azul, como Luxol (em 95% de etanol) O / N a 56 ° C. Diferenciar as secções em 0,05% de carbonato de lítio durante 30 seg e em seguida etanol a 70% durante mais 30 seg. Finalmente, contracoloração em solução violeta de cresilo a 0,1% durante 30 s antes de montar as secções. Utilizar a coloração com azul rápido para identificar mielina no nervo óptico ^5.

Resultados

Vestígios VEP intra-sessões reprodutíveis são mostrados na Figura 1 e um atraso significativo na latência N1 pode ser visto depois da injecção do nervo óptico. Lesões do nervo óptico parciais de desmielinização pode ser observado em secções histológicas utilizando coloração com azul rápido Luxol ^5. A Figura 2 mostra uma secção representativa com uma pequena lesão demyelinated focal no centro do nervo óptico. Note-se que a secção transversal não representa volume total da lesã...

Discussão

O nervo óptico é muito suscetível a danos mecânicos. A lesão por esmagamento do nervo óptico durante 1 s pode levar a cerca de 75% de perda de RGC em um período de 2 semanas¹⁰. Portanto, é necessário extremo cuidado durante a realização dos procedimentos cirúrgicos. De acordo com a experiência dos autores, é muito melhor adaptar uma abordagem de dissecção romba para expor e abrir caminho através dos tecidos ao redor do nervo óptico ao longo da orientação do nervo, em vez de penetrar em uma orientação perpendic...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cetamina 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidina 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamida 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Sistema de manta homeotérmica	Aparelho Harvard NC9203819
Medidor de impedância	Eletrodos	de parafuso Grass F-EZM5
	Micro Fixadores	M1.0× Eletrodos de agulha subdérmica de 3mm Csk Slot M/T 304 S/S
	Reparo	F-E3M-72
	DeguDent GmbH
Diodo emissor de luz	Nichia	NSPG300A
Bioamplificador	CWE, Inc.	BMA-400
Sistema CED	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Seringa Power1401
Hamilton	Hamilton	87930
Lisolecitina	Sigma	L4129
Evan' s azul	Sigma	E2129