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Artigo de método

Um

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⸱

DOI:

10.3791/52969

⸱

6 de outubro de 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Calgary, 2Toronto General Research Institute, University Health Network

Neste artigo

Resumo

A coinfecção humana é difícil de replicar in vitro. No entanto, os parasitas da malária humana podem ser facilmente cultivados in vitro, assim como as células mononucleares do sangue periférico humano recém-isoladas naturalmente infectadas com o HIV. Isso fornece um excelente modelo para estudar as respostas imunes precoces aos parasitas da malária no contexto da coinfecção pelo HIV.

Resumo

A coinfecção por malária e HIV é uma prioridade crescente de saúde. No entanto, a maioria das pesquisas sobre malária ou HIV atualmente se concentra em cada infecção individualmente. Embora seja vital entender a dinâmica da doença para cada um desses patógenos de forma independente, também é importante que as interações entre esses patógenos sejam investigadas e compreendidas.

Desenvolvemos um modelo in vitro versátil de coinfecção HIV-malária para estudar as respostas imunes do hospedeiro à malária no contexto da infecção pelo HIV. Nosso modelo permite o estudo de fatores secretados em sobrenadantes celulares, marcadores de superfície celular e proteínas intracelulares, bem como níveis de expressão de RNA. O desenho experimental e os métodos utilizados limitam a variabilidade e promovem a confiabilidade e reprodutibilidade dos dados.

Todos os patógenos usados neste modelo são patógenos humanos naturais (Plasmodium falciparum e HIV-1), e todas as células infectadas são naturalmente infectadas e usadas frescas. Utilizamos eritrócitos humanos parasitados com P. falciparum e mantidos em cultura in vitro contínua. Obtemos células mononucleares do sangue periférico recém-isoladas de voluntários cronicamente infectados pelo HIV. Cada condição usada tem um controle apropriado (P. falciparum parasitado vs. eritrócitos normais), e cada doador infectado pelo HIV tem um controle não infectado pelo HIV, do qual as células são colhidas no mesmo dia. Este modelo fornece um ambiente realista para estudar as interações entre parasitas da malária e células imunes humanas no contexto da infecção pelo HIV.

Introdução

Co-infecção, a infecção com múltiplas infecções simultâneas, é a norma em ambientes naturais. A co-infecção pode ter um impacto importante na patologia da doença e na gestão clínica de cada infecção. No contexto da co-infecção, vacina e a eficácia do fármaco, bem como os testes de diagnóstico, podem ser influenciadas negativamente (revisto em 1). No entanto, apesar da sua importância, a maioria das pesquisas patógeno considera infecções única individuais.

Malária e HIV-1 (HIV) são as principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Áreas de malária e HIV endemicidade compartilhar uma ampla sobreposição geográfica, colocando milhões de pessoas em risco de co-infecção e, conseqüentemente, em risco de doença clínica mais grave 2-10. As duas doenças interagir negativamente. Em indivíduos infectados pelo HIV, a carga viral mais elevados e diminuições temporárias em + contagem de células T CD4 pode ser visto durante uma infecção por malária, enquantoencargos parasita da malária e risco de malária clínica e grave são mais elevados em indivíduos co-infectados 2,3,5,7,8,10. Os mecanismos pelos quais o HIV aumenta a gravidade da malária não são totalmente compreendidas e garante uma investigação mais aprofundada.

Aqui, descrevemos um método pelo qual a malária e a co-infecção com HIV pode ser estudado in vitro. Mais especificamente, este método permite a análise das respostas imunes específicas para a malária no contexto da infecção pelo HIV. Nosso protocolo descreve um sistema versátil de co-cultura utilizando células mononucleares do sangue periférico isoladas recentemente (PBMC) isoladas a partir de dadores cronicamente infectadas pelo VIH e cultivados in vitro P. falciparum parasitados eritrócitos (PfRBC). O impacto da terapia anti-retroviral HIV sobre estas respostas também podem ser examinados usando PBMCs prospectivamente coletados de VIH (+) doadores pré e pós-tratamento.

Temos utilizado este sistema para investigar o impacto da infecção pelo HIVna resposta imune inata específicas para a malária 11,12, e foram capazes de determinar que IFN-y e TNF respostas específicas para a malária são prejudicados nas células NK, células NKT, γδ células T de HIV (+) doadores pré e pós-terapia anti-retroviral HIV . Além disso, fomos capazes de utilizar este sistema para determinar que funções monoc�icas também são prejudicados em HIV (+) doadores, mas recuperar pós-HIV terapia anti-retroviral.

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Protocolo

Este protocolo requer o recrutamento de dadores de soro e eritrócitos a ser utilizados para a cultura de parasita, e doadores de HIV (+) e não infectadas para o isolamento de PBMC. Conselhos de Revisão Institucional deve aprovar todos os estudos e todos os doadores devem dar seu consentimento informado antes da coleta de sangue.

CUIDADO: Trabalhando com amostras de sangue humano e parasitas da malária humana requer medidas cautelares. Use sempre uma bata de laboratório, luvas, e trabalhar em um nível 2 gabinete de Biossegurança. Em caso de exposição percutânea acidental a malária humana, denunciar a Saúde e Segurança para o tratamento profilático. Consideração adicionais de segurança também deve ser colocado em prática para trabalhar com HIV no sangue (+). Usar um jaleco fechamento de volta. Luva Duplo (top luva deve ser de látex). Execute todos tratando de nível 2 gabinete de Biossegurança. Não use nenhum vidro ou objetos pontiagudos. Não use aspirador. Coloque todos os itens contaminados em solução Virox ou água sanitária para um mínimo de 1 hora antes de deitar fora.Lave todas as superfícies com Virox e UV durante 1 hora após o uso. Note-se que cada instituição terão suas próprias normas de biossegurança específicas que precisam ser seguidas. Denunciar todas as exposições acidentais a sangue infectado pelo HIV para saúde e segurança para avaliação e análise de possíveis profilaxia pós-exposição.

Nota: Diferentes cepas de P. existem parasitas de malária falciparum. ITG foi utilizada para estas experiências, mas diferentes estirpes pode ser utilizada. Instruções excelentes no congelamento e descongelamento parasitas Plasmodium falciparum estão disponíveis no site do MR4 13.

1. Fazer RPMI-A para Parasita da malária Cultura

  1. Adicione RPMI-0 através da mistura de 950 ml de ddH2O, um pacote de pó de meio RPMI-1640, 6 g de HEPES, 2 g de bicarbonato de sódio, e 1,35 mg de hipoxantina.
  2. Descongelar calor inactivado soro humano de dois doadores diferentes. Dadores AB são melhor mas pode ser utilizado qualquer se parasitas são cultivadas em tipo óOs glóbulos vermelhos (RBC). Inverta os tubos para misturar. Se o soro contém partículas ou é giro grossa a 2.000 rpm e, em seguida, filtrar porção líquida usando uma unidade de filtro de 0,45 mm.
  3. Usando um filtro de 0,2 um aparelho de filtro 180 ml de meio RPMI-0, 20 ml de soro humano (10 ml de cada dador), e 0,5 ml de 10 mg / ml de gentamicina.
    Nota: soro humano podem entupir o filtro, de modo mais do que uma unidade de filtro pode não ser necessária.
  4. Rotular o frasco com o meio RPMI-A, a data, e a fonte de soro. Leve à geladeira até ser necessário. RPMI-A pode ficar turva quando refrigerado. Isso é normal, mas aumentando a nebulosidade é um sinal de contaminação.
    Nota: o crescimento do parasita podem variar em diferentes soro dador. É uma boa idéia para testar todos os lotes de soro humano para o bom crescimento do parasita antes de usar.

2. Preparar as células vermelhas do sangue humano para Parasite Cultura

Nota: Os doadores de sangue devem ser do tipo O.

  1. Recolha 7-10 ml de sangue em ácido-cit(ACD) tubos de taxa de dextrose. Faça ID e data de colheita no rótulo do doador.
  2. Sangue armazenar a 4 ° C até serem necessárias. Use sangue para as culturas de parasitas dentro de 1 mês.
  3. Limpar o topo do tubo com etanol a 70%. Remova cuidadosamente rolha e descarte. Transferir sangue para um tubo de 15 ml. Rotação durante 3 min a 1000 x g. Remover o plasma por aspiração.
  4. Suspender RBC com igual volume de quente RPMI-0. Rotação durante 5 minutos a 1.000 x g. Remover o revestimento de Buffy por aspiração, ressuspender em 5 ml de meio RPMI-0 e repetir a lavagem mais 2 vezes.
  5. Remover o sobrenadante e adicionar suficiente RPMI-A para produzir uma mistura que é 50% em volume de RBC.
  6. Armazenar a 4 ° C até serem necessárias.

3. Manter a cultura dos parasitas

  1. Pré-quente RPMI-A a 37 o C.
  2. Coloque parasitas descongeladas (ver protocolo para o procedimento de descongelamento MR4) para um frasco T25 com 5 ml de meio RPMI-A e 75 ul de RBC lavados humano para um hematócrito de 3% ~.Nota: Hematócrito mede o volume de RBC em comparação com o volume total. Para calcular o hematócrito medir o volume de glóbulos vermelhos embalados e o volume total de meio de mais eritrócitos. Suponha que os parasitas descongelados contribuirá 75 ul de RBC. Pela adição de 150 ul de estoque de RBC (que é equivalente à adição de 75 ul de embalado RBC) para o balão tem um total de 150 pi de glóbulos vermelhos em 5 ml de meio, o que equivale a um hematócrito de 3% (150 ul / 5000 l x 100% = 3%).
  3. Gás do frasco durante 30 segundos com a mistura de gás parasita (1% O 2, 3% de CO 2, o balanço de N 2). Selar e colocar a garrafa de lado grande para baixo em 37 ° C uma incubadora para permitir a maior área de superfície para a troca de gás.
  4. Para alterar a forma e verificar se há parasitemia (precisa ser feito diariamente), mova cuidadosamente o frasco para não perturbar a camada de RBC. Usando uma pipeta Pasteur estéril unplugged desenhar fora do meio de cultura sem perturbar a camada de sangue.
  5. Para verificar parasitemia, retire uma amostra de 10 ul a partir da camada de sangue, coloque-o sobre uma lâmina de vidro e usando uma segunda lâmina de vidro criar um filme fino de sangue. Permitir slides para secar.
  6. Coloque 4 ml de RPMI fresco-A para o balão, misturar suavemente, gás durante 30 seg, e o lugar em incubadora a 37 ° C.
  7. Manchar o slide usando o kit de coloração Hema3 de acordo com o protocolo do fabricante.
    1. Para a coloração óptima, mergulho desliza na solução de fixação durante 10 seg, eu solução durante 10 seg, e solução II durante 30 seg. Enxágüe em água e deixar as lâminas secar.
  8. Calcule parasitemia através da contagem do número de PfRBC (manchado roxo escuro) versus o número total de RBC (rosa com detalhes). Contagem de um total de 300 células para assegurar a precisão.
  9. Quando os parasitas tenham atingido uma parasitémia de 5%, a expansão da cultura para um frasco T75, usando 40 ml de meio RPMI-A, e 500 uL de RBC.

4. Parasite Sincronização

Nota: No dia antes de tele experimentar, sincronizar a cultura parasita por tratamento com alanina. Somente parasitas estágio anel e não infectado RBC vai sobreviver a este tratamento. Sincronização Alanina lhe dará uma cultura pura trofozóito no dia seguinte que pode ser usado nas experiências de co-cultura. Certifique-se de começar com uma cultura parasita que contém a maioria dos parasitas estágio anel.

  1. Preparar a solução de alanina misturando 8,01 g de alanina (300 mM) e 0,365 g de Tris (10 mM) em 300 ml de ddH 2 O. Traga o pH a 7,4. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de filtro de 0,2 um.
  2. Alanina-solução quente para pré 37 o C.
  3. Girar a cultura parasita (5 min x 1.000 xg), e remova o meio.
  4. Ressuspender sedimento em 19 volumes de solução de alanina (1 ml RBC embalado para 19 ml de solução de alanina). Incubar durante 15 min à TA.
  5. Rotação 5 min x 1.000 x g. Aspirar o sobrenadante. Lavar em RPMI-0 uma vez. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em meio RPMI-A e ajustar o hematócrito para ~ 3%. Gcomo balão e regresso a 37 o C.
    Nota: Para as experiências de co-cultura é necessária uma parasitemia mínimo de 5% trophozoites, com 10% de parasitemia considerado ideal.

5. Parasite e RBC Preparação para Experimentos de co-cultura

  1. Usar uma proporção de 3 PfRBC por PBMC em experiências de co-cultura para induzir uma resposta inflamatória. Para calcular PfRBC total quantificar a parasitemia, fazendo um esfregaço de sangue fina, como descrito em 3.5, e o hematócrito através da contagem do número de glóbulos vermelhos por ml de cultura parasita usando um hemocitómetro.
    Número de PfRBC =% de parasitemia de RBC x total / ml x ml de cultura. Por exemplo: 10 ml de cultura a 10 x 10 6 de RBC / ml e 10% de parasitemia é igual a 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC.
  2. Girar a cultura parasita durante 5 min a 1000 xg (RT). Aspirar o meio, e ressuspender a 6 x 10 6 por ml em PfRBC RPMI-s + (500 ml de RPMI-1640 suplementado com L-glutamina e HEPES, 10% de calorFBS inactivado, 1,5 ml de gentamicina, 5 ml de 100 mM de piruvato de sódio, 5 mL de MEM 10 mM de aminoácidos não essenciais, 5 ml de 5 mM β-mercaptoetanol).
  3. Aqui sangue de controlo (RBC não infectado do mesmo doador utilizado para a manutenção da cultura parasita), calcular o hematócrito e ressuspender em meio RPMI-S + no mesmo número de glóbulos vermelhos por ml de cultura como o parasita.

6. Isolamento de sangue periférico humano as células mononucleares (PBMC)

  1. Recolha de sangue venoso em tubos de heparina de sódio (top verde) tanto do HIV (+) de doadores crônica e uma HIV (-) controle. Não utilizar EDTA como um anti-coagulante, como acção quelante do EDTA de cálcio afecta a função da célula. Em média, esperam que entre 5-10 x 10 6 PBMC por 10 ml de sangue. Para uma experiência típica recolher 30 ml de sangue de cada dador. O volume de sangue terão de ser ajustados de acordo com as exigências experimentais.
  2. O mais rapidamente possível e, definitivamente, dentro de uma hora de sangue a ser recolhidos,remover o sangue dos tubos e coloque em um tubo de plástico de 50 ml. Monócitos em particular será ativado e ficar com vidro, por isso é importante que as células se tubos de coleta de sangue de vidro são usados ​​são removidos o mais rapidamente possível.
  3. Girar o sangue a 1000 xg durante 15 minutos e recolher o plasma (isto pode ser usado para outros estudos, se necessário - se não for este passo pode ser ignorado). Dilui-se o sangue em igual volume de DPBS frio.
  4. Coloque 15 ml de Ficoll RT em um tubo de 50 ml. Lentamente, usando uma pipeta de transferência de plástico estéril, a camada de solução / DPBS sangue sobre o Ficoll sem qualquer mistura. Um máximo de 25 ml de solução / DPBS sangue pode ser mergulhado sobre cada 15 ml de Ficoll.
  5. Girar os gradientes de 30 min à temperatura ambiente a 600 x g. Verifique se a configuração "não freio 'está ligado.
  6. Uma vez que as células tenham fiado, olhar para a interface entre as duas fases. Este é o lugar onde o PBMC são. Usando uma pipeta de plástico estéril de transferência de recolher o PBMC a partir da interface (vejaA Figura 1). Minimizar a contaminação por RBC.
  7. Coloque células coletadas em tubos de 50 ml, com não mais de 20 ml por tubo. Top tubo de até 50 ml com DPBS frio estéreis.
  8. Rodar as células durante 10 min a 4 ° C a 300 x g.
  9. Elimine o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 5 ml de DPBS frio estéreis e reunir todas as células a partir do mesmo doador em um tubo. Encher a 50 ml com DPBS estéril, e repetir a passos de lavagem mais 2 vezes.
  10. Ressuspender as células em 10 ml de RPMI + S-forma.
  11. Remove-se uma alíquota de 20 ul e misturar-se com 20 ul de azul de tripano. Pipeta 10 ul em um hemocitómetro e contar as células vivas (células que não têm tido até o corante azul - todas as células azuis são mortos). Usar um hemocitómetro para calcular o número de células numa solução como se segue.
    Nota: um hemocitómetro tem uma grelha de dimensões especificadas de modo a que a área coberta pelas linhas é conhecido.
    1. Verifique se o hemocitómetro está limpo. Coloque a lamela sobre a countiárea ng. Carga de 10 ul de solução de células colocando a ponta da pipeta num dos poços em forma de V. A área sob a lamela irá preencher, por acção capilar.
    2. Coloque a hemocitómetro carregado sob um microscópio. A grade completa do hemocitómetro contém 9 quadrados de 1 mm 2 cada. Contagem de todas as células dentro de cada quadrado grande. Se muitas células estão presentes, diluir a solução mais e recontagem.
    3. Calcular a concentração de células como se segue: Total de células / ml = (número total de células contadas / # de quadrados) x factor de diluição x 10.000 células / ml, por exemplo, (500 células / 5 quadrados) factor de diluição x de 20 x 10.000 células / ml = 20 X 10 6 células totais.
  12. Ajuste meio a uma concentração final de 10 x 10 6 por ml (meio RPMI-S + forma).

7. Malária / Co-infecção HIV Cultura

  1. Placa 100 ul de PBMC isoladas e 400 ul de meio RPMI-S + médio para uma placa de 24 poços (1 x 10 6 PBMC por cavidade). Garantirque os poços são criados em triplicado: 3 poços para não infectado RBC, 3 poços com PfRBC, 3 poços com meio, e 3 poços com PMA / ionomicina. Isto é tanto para o HIV (+) e HIV (-) da amostra.
  2. Para o PfRBC poços, coloque 3 x 10 6 PfRBC em cada um dos poços (500 ul da cultura parasita preparadas de 5,2).
  3. Para não infectado RBC poços, 500 ul de colocar a cultura não infectada RBC preparado em 5,3 em cada um dos poços.
  4. Para poços médias, colocar 500 ul de meio RPMI-S + no meio de cada um dos poços.
  5. Para PMA / ionomicina poços, preparar a solução com PMA / ionomicina (2,5 pg / ml, 250 pg / ml, respectivamente). Coloque 500 ul desta solução em cada poço.
    Nota: como estimuladores potentes da secreção de citoquinas de células T, PMA e ionomicina são utilizados como um controlo positivo para assegurar células são funcionais.
  6. Colocar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2.
  7. Opcional: usar excesso de células para análise fenotípica por citometria de fluxo ou armazene em um RNUma solução de estabilização para a futura análise da expressão de mRNA.

8. Detecção das Respostas Imunes Malária

Nota: Realizar experimentos de co-cultura por até quatro dias. Nenhuma mudança de meio é necessário durante este tempo. O ponto de tempo óptimo dependerá do tipo de célula de interesse e a pergunta. Uma incubação de 12-48 horas é o ideal para as respostas monoc�icas para PfRBCs, enquanto que as respostas dos linfócitos foram melhor observados em 72-96 horas. Os pontos de tempo terá de ser optimizada com base na pergunta experimental. Períodos mais curtos (2-4 h) poderá ser usado se interação entre intacta PfRBC e PBMC é de interesse.

  1. Placa de rotação a 300 xg durante 3 minutos para as células de pelotas. Recolha de 700 ul de sobrenadante de cultura de cada poço.
  2. Gire sobrenadante a 1.000 xg por 5 min para desembaraçadas de quaisquer detritos.
  3. Aliquota foi afastada sobrenadante conforme necessário, etiqueta, e congelamento abaixo dos -20 ° C até à análise dos factores secretados é para ser Performou.
  4. Analisar as respostas de citocinas / quimiocinas por ELISA ou por matriz do grânulo (seguir os protocolos sugeridos pelo fabricante).
  5. Recolher as células que permanecem na placa numa solução que estabiliza o ARN e utilizar para a análise de expressão de ARNm de a-PCR quantitativo em tempo real 14-16.

9. intracelular citometria de fluxo para Respostas Ccytokine específico de células utilizando PBMC co-cultivadas com P. falciparum Infected RBC

Observação: Como mencionado acima, o comprimento de co-cultura irá depender do tipo de células de interesse. Se estiver interessado em respostas monoc�icas para PfRBC um período de incubação mais curto é necessário. Vezes será mais longo para as respostas dos linfócitos inatas γδ células T, células NK, células NKT), e ainda mais para células T CD4 e CD8. Optimization será necessária.

  1. 6-8 h antes de adicionar 1 ul de análise de 1.000x brefeldina A a todos os poços. Retorne a placa a 37 ° C incubadora. Após 6-8 h incubção, colocar a placa em gelo durante 15 min.
  2. Remover as células dos poços utilizando pipetagem vigorosa e colocá-los em tubos microcentifuge rotulados. Raspar pode ser necessária para remover os monócitos.
  3. Células de centrifugação durante 5 min a 1000 x g. Remover sobrenadantes. Ressuspender as células em 500 ul de tampão de citometria de fluxo (1x DPBS, 2% de FBS inactivado pelo calor, azida de sódio a 0,02%).
  4. As células se dividem de forma que cada amostra tem: um tubo para a coloração de anticorpo completo (240 uL), e um tubo para a coloração de um menos fluorescente (FMO) anticorpo de controlo (240 ul). Piscina um pequena quantidade de cada amostra (20 ul) para o fluxo de citometria de controlo não corado (isto irá ser utilizado na criação do citómetro de fluxo).
  5. As células de centrifugação durante 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
  6. Incubar as células com CD16 não conjugado anti-humano / CD32 (5 ug / ml) em 50 ul de tampão de citometria de fluxo durante 15 min a 4 ° C para bloquear os receptores Fc.
  7. Adicionar 1 ml de tampão de citometria de fluxo para cada tubo. Spin cells para 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
  8. Ressuspender as células em 50 ul de tampão de citometria de fluxo com uma concentração pré-titulada de anticorpos fluoróforos para marcadores de superfície de células desejada. Pré-mistura de solução de anticorpo suficiente para todas as amostras a serem corados. Incubar as células a 4 ° C por 20 min. Proteger da light.Note: Montante de cada anticorpo terá de ser otimizado. Rotineiramente manchar para CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Volumes ajustadas para estes anticorpos estão apresentados na Tabela 1.
  9. Adicionar 1 ml de tampão de citometria de fluxo para cada tubo. As células de centrifugação durante 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
  10. Adicionar 100 ul de solução Cytofix / Cytoperm a cada tubo. Incubar as células durante 20 minutos a 4 o C. Proteger da luz.
  11. Adicionar 1 ml de tampão de Perm / lavagem (10x concentrado fornecido como - diluir a 1x usando ddH2O) a cada tubo. As células de centrifugação durante 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
  12. Adiciona-se 100 μl de perm / tampão de lavagem de controle FMO tubos de coloração de anticorpos e misture para voltar a suspender as células.
  13. Adicionar 100 ul de tampão de Perm / lavagem com uma concentração pré-titulada de anticorpos fluoróforos aos marcadores intracelulares desejados (isto é, citocinas / quimiocinas) para tubos de coloração de anticorpo completas.
    Nota: A quantidade de cada anticorpo terá de ser optimizada. Rotineiramente manchar com anti-TNF e anti-IFNy anticorpos. Volumes ajustadas para estes anticorpos estão apresentados na Tabela 1.
  14. Incubar todos os tubos durante 30 minutos a 4 o C. Proteger da luz.
  15. Adicionar 1 ml de tampão de Perm / Wash a cada tubo. As células de centrifugação durante 5 min a 500 x g. Remover sobrenadantes.
  16. Ressuspender as células em 300 ul citometria de fluxo tampão com 1% de paraformaldeído. Vamos sentar-se para um mínimo de 15 minutos para neutralizar o HIV.
  17. Prepare anticorpos única amostras coradas usando esferas de compensação, a ser utilizado para compensação instituído no citômetro de fluxo. O tipo de compensaçãogrânulos dependerá dos anticorpos utilizados (isto é., Ig anti-murganho, anti-rato / Ig de hamster). Grânulos vórtice. Adicionar uma gota de grânulos por anticorpo. Adicionar a mesma quantidade de anticorpo que o utilizado para a coloração. Adicionar 200 ul de tampão de citometria de fluxo. Estes são agora pronto para o uso. Não há necessidade de lavar as contas.
  18. Adquirir amostras num citómetro de fluxo o mais rápido possível e dentro de 24 h para obter os melhores resultados. Corantes Tandem são suscetíveis a dissociação com o armazenamento, por isso recomendamos aquisição imediata, se possível.

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Resultados

Os gráficos apresentam os níveis de produção de IFN-y a partir de células NKT (Figura 2), usando CD56 + CD3 + γδ- portas para obtenção de uma população de células NKT (dados não mostrados). As células foram cultivadas durante 72 horas antes da coloração. Depois de coradas, 100.000 células CD3 + foram adquiridos no citómetro de fluxo para obter grandes populações suficientes de NK, células NKT e γδ (células de interesse). Um mínimo de 5.600 células NKT são exibidas em cada gráfico. A produção de TNF é ob...

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Discussão

Nosso protocolo foi optimizado, a fim de estudar mais realisticamente co-infecção com HIV-malária in vitro. Em primeiro lugar, os glóbulos vermelhos humanos frescos e soro são necessários para a cultura parasita da malária. Isso é vital para obter uma população saudável de parasitas da malária. Os lisados ​​de parasitas não pode ser substituído por parasitas vivos como a produção de citoquinas é muito mais rápida e intensa quando se utiliza vivo P. RBC infectados falciparum (PfRBC) 17,18....

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

C.A.M.F. e L.S. participaram da concepção do protocolo, aquisição e análise dos dados e redação do artigo.

Os autores desejam agradecer ao Dr. Kain, Dr. Loutfy, Dr. Wasmuth e Dr. Ayi por suas contribuições.

C.F. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. é apoiado por um Prêmio de Desenvolvimento de Investigador Júnior da OHTN. O presente trabalho foi apoiado por uma bolsa operacional do Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 e 115160) e uma bolsa CIHR New Investigator Catalyst.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
alaninaSigmaA7377
anticorpos (ver outra tabela)
BD Cytofix/Cytoperm com BD GolgiPlugBD555028inclui brefeldina A, tampão citofix/cytoperm e tampão perm/wash
BD Vacutainer ACD Solution ABD364506
BD Vacutainer Heparina sódicaBD17-1440-02
DPBS (sem cálcio, sem magnésio)Corning21-031-CV
Soro Fetal BovinoSigmaF1051inativar o calor antes do uso
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
gentamicina (10 mg/ml)Gibco15710-064
Conjunto de Coloração Hema3Fisher122-911
HEPESFisherBP310-500
hipoxantinaSigmaH9636
IonomicinaSigmaI3909
MEM aminoácidos não essenciais (10 mM)Gibco11140
PMASigmaP8139
RPMI-1640 póLife-Technologies31800-022
RPMI-1640 com L-glutamina e HEPESThermo ScientificSH30255.01
bicarbonato de sódio (pó, cultura de células)SigmaS5761
Sodium Pyruvate (100 mM)Gibco11360
Tris (base Trizma)SigmaT6066
TrizolAmbion15596018
Trypan Blue (0,4%)Gibco15250-061
BD CompBeadBD552843, 552845depende dos anticorpos usados
Mistura de Gás ParasitaPor ordem3% CO2, 1% O2, equilíbrio N2
Equipamento
0,2 μ m unidade
Lâminas de vidro Balões
T25
T75 Tubos
50 ml
cultura de 24 poços
desconectadas Pipetas Pasteur
entupidas
de transferência estéreis
hemocitômetro citômetro
de fluxo (3 laser)
Anticorpos usados para citometria de fluxo
Anti-TNFeBiosciences551487FITC (fluoróforo) 2 μ l
Anti-IFNγBiolegend506507PE (fluoróforo) 20 μ l
Anti-CD8Biolegend300914PE-Cy7 (fluoróforo) 1 μ l
Anti-CD14Biolegend; BD Biosciences325624; 551487Biotina (fluoróforo) 0,5 μ l Estreptavina PE-TR (fluoróforo) 0,1 μ l
Anti-CD56Biolegend318322PerCP/Cy5.5 (fluoróforo) 5 μ l
Anti-γ δBiolegend331212APC (fluoróforo) 5 μ l
Anti-CD3Biolegend300426APC-Cy7 (fluoróforo) 5 μ l
Anti-CD4Biolegend317424Pacific Blue (fluoróforo) 1 μ l
especial de filtroBalões de Placas depipetas

Referências

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