Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Resumo

De novo a lipogênese e oxidação do ácido β-gordo constituem vias metabólicas importantes em hepatócitos, caminhos que são perturbados em vários distúrbios metabólicos, incluindo a doença de fígado gordo. Aqui demonstramos isolamento de hepatócitos primários de rato e descrever quantificação da oxidação de ácidos graxos e β-lipogênese.

Resumo

O metabolismo lipídico no fígado é complexo. Além de importar e exportar lipídios por meio de lipoproteínas, os hepatócitos podem oxidar lipídios por meio da oxidação de ácidos graxos ou, alternativamente, sintetizar novos lipídios por meio da lipogênese de novo. A soma líquida dessas vias é ditada por uma série de fatores, que em certos estados de doença levam à doença hepática gordurosa. O acúmulo excessivo de lipídios hepáticos está associado à resistência à insulina de todo o corpo e à doença cardíaca coronária. Ferramentas para estudar o metabolismo lipídico em hepatócitos são úteis para entender o papel do metabolismo lipídico hepático em certos distúrbios metabólicos.

No fígado, os hepatócitos regulam a quebra e a síntese de ácidos graxos por meio da oxidação β-gordurosa e da lipogênese de novo, respectivamente. A quantificação do metabolismo nessas vias fornece informações sobre o manuseio de lipídios hepáticos. Ao contrário da quantificação in vitro, usando hepatócitos primários, fazer medições in vivo é tecnicamente desafiador e consome muitos recursos. Portanto, quantificar a oxidação de ácidos graxos β e a lipogênese de novo em hepatócitos de camundongos cultivados fornece um método direto para avaliar o manuseio de lipídios de hepatócitos.

Aqui descrevemos um método para o isolamento de hepatócitos primários de camundongos e demonstramos a quantificação da oxidação de ácidos graxos β e lipogênese de novo, usando substratos radiomarcados.

Introdução

A doença hepática gordurosa não alcoólica é uma das principais causas de doença hepática em culturas ocidentalizadas^1,2. O acúmulo de lipídios no fígado está associado à morte celular, fibrose e insuficiência hepática por meio de mecanismos ainda desconhecidos^3-6. Na doença hepática gordurosa, a oxidação de ácidos graxos β mediada por hepatócitos e a lipogênese de novo são determinantes importantes do acúmulo líquido de lipídios^7,8. Este artigo irá, portanto, enfocar o isolamento de hepatócitos, seguido pela quantificação da oxidação de ácidos graxos β e lipogênese de novo.

Numerosas metodologias foram desenvolvidas para interrogar o metabolismo lipídico dos hepatócitos. Embora seja possível medir o metabolismo da gordura in vivo usando isótopos estáveis^9,10, esses métodos são caros e requerem um grande número de animais. Além disso, a capacidade de investigar o efeito de produtos químicos exógenos é limitada devido à natureza da experimentação in vivo. Em contraste, o isolamento de hepatócitos primários do fígado de camundongo fornece um caminho acessível para buscar¹¹. Além disso, o estudo de hepatócitos em cultura permite que os investigadores estudem os efeitos de produtos químicos variados no processamento de lipídios, contornando as dificuldades da experimentação in vivo. Finalmente, os hepatócitos isolados evitam qualquer confusão devido à genética variável, uma vez que são derivados do fígado de um único animal.

Aqui isolamos uma cultura de hepatócitos e medimos a oxidação de ácidos graxos β e a lipogênese de novo, usando palmitato radiomarcado. O protocolo detalhado abaixo é direto, eficaz e reproduzível.

Protocolo

Todos experimentação animal deve ser realizado em conformidade com os regulamentos locais e federais e com a aprovação de uma IACUC e segurança de radiação administração institucional.

1. Preparação

1. Vários dias antes do ensaio, descongelar a garrafa de 500 ml de fígado Digest Médio (LDM) e recongelar ~ 35 ml de partes alíquotas em tubos cónicos de 50 ml. Armazenar a -20 ° C até serem necessárias.
2. Um dia antes do ensaio, pré-limpas esterilizar instrumentos de dissecação por autoclave.
3. No dia do ensaio, tratar a quantidade necessária de placas de cultura de 24 poços com colagénio.
   1. Misturar 1 parte de 3 mg / mL de colagénio de cauda de rato com 50 partes de PBS. Adicionar cerca de 500 uL a cada poço de uma placa de 24 poços e incuba-se durante 3-5 minutos à temperatura ambiente (TA). Remova a placa de colágeno e permitir ao ar seco na capa. Repetir pelo menos uma vez adicional.
      Nota: revestimento de colágeno pode ser realizada até uma semana em anúncioVance e as placas armazenadas a 4 ° C em filme plástico selado.
4. Prepare LDM para ensaio: LDM Descongelar e aquecer a 37 ° C e ajustar o pH a 7,4 utilizando KOH 1N. Filtrar usando filtro de seringa de 0,2 um e coloque em um 42 ° C banho de água de recirculação.
5. Aqueça 25 ml de fígado Perfusão Médio a 42 ° C em banho de recirculação de água.
6. Prepare a 90% de sílica coloidal revestido com uma solução de polivinilpirrolidona: Adicione 1 ml de DPBS 10x a 9 ml de sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona. Ajustar o pH para 7,4 utilizando HCl 0,1 N. Filtrar com um filtro de seringa estéril de 0,2 um. Armazenar à temperatura ambiente.
7. Quente meio de plaqueamento de 37 ° C.

2. Isolamento de principal do mouse hepatócitos

1. Configure bomba peristáltica, tubulação, e mesa de dissecção: Esterilizar tubulação por lavagem com etanol a 5 ml de 70% em água destilada, seguido por 10 ml de água estéril. Coloque tubulação no fígado Perfusão Médio e executar bomba para enchertodo o comprimento do tubo.
2. Sacrifique rato pelo método aprovado institucionalmente.
3. Dissecar aberto a cavidade abdominal: Pulverizar o abdômen do rato generosamente com etanol 70%. Com uma tesoura de extremidade romba, fazer uma incisão na linha média através da derme do comprimento do abdómen e reflectir lateralmente. Adicione uma incisão semelhante no peritoneu para expor as vísceras.
   1. Utilizando um instrumento rombo, deslocar os intestinos suavemente para expor a vasculatura abdominal Localizar a veia cava inferior abdominal (IVC) e colocar uma sutura por baixo do vaso sanguíneo, distai em relação à veia renal
4. Distalmente à sutura, colocar uma agulha e cateter na veia cava inferior, avançando para além do nível da sutura. Com a agulha ainda no lugar, amarrar a sutura ao redor do cateter para segurá-la no lugar. Remova cuidadosamente a agulha. Se isso for feito correctamente, o sangue com fluxo através do cateter.
5. Usando uma pipeta, encher o restante da área no meio de perfusão com cateter, assegurandoque nem o ar está presente. Com muito cuidado, coloque a tubulação para o cateter.
6. Dissecar aberto da cavidade pulmonar: refletir suavemente os lóbulos superiores do fígado para expor o diafragma. Perfurar cuidadosamente o diafragma com uma tesoura ponta afiada, em seguida, fazer uma incisão lateral para expor a cavidade pleural, tendo o cuidado de evitar a vesícula biliar e vasculatura pleural. Coloque um grampo de bulldog em torno da veia cava inferior torácica apenas proximal à veia hepática.
7. Corte a veia porta e ligar a bomba a 3 - 4 ml / min. Perfundir com o fígado Fígado Perfusão médio durante 5 min, utilizando aproximadamente 20 ml de meio de perfusão.
   Nota: O fígado deve mudar imediatamente de vermelho para cinza / tan. Se porções do fígado permanecer vermelho, isso provavelmente indica má perfusão, ea probabilidade de isolamento bem sucedido é muito reduzido. Durante a perfusão, tenha cuidado para garantir o meio não correr para fora e que não há bolhas de entrar na tubulação.
8. Após a 5 min de incubação, parara bomba e tubo para transferir o fígado Digest Médio. Reiniciar a bomba e perfundir o fígado por mais 10 - 15 minutos (até que o meio é esgotada).
9. No final da perfusão, parar a bomba. O fígado deve ter um tom rosado e aparecer um pouco alargada. Extirpar o fígado por dissecção cuidadosa. Remover a vesícula biliar e transferir o fígado a 10 cm prato de cultura de tecidos.
10. Em uma cabine de segurança biológica, adicionar 10 ml de chapeamento Médio (Tabela 1) para o fígado. Raspe o fígado utilizando quer uma pinça ou um escalpelo para remover os hepatócitos. Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 100 mm e transferência para um tubo de 50 ml. Lave a placa com um adicional de 10 ml de Galvanização Médio e piscina no tubo de 50 ml.
11. Agregar as células por centrifugação durante 5 min a 350 xg, 4 ° C.
12. Aspirar médio e pellet ressuspender em 10 ml de Galvanização Médio e adicionar 10 ml de 90% de sílica coloidal revestido com polyvinylpyrrolidone. Misture delicadamente e centrifugar como na etapa 2.11. Após centrifugação, uma camada de células mortas vai ser flutuante na parte superior da mistura, enquanto que as células vivas irá sedimentar para o fundo.
13. Aspirar as células mortas e meio. Lavar 2 vezes com 20 ml de chapeamento Médio, centrifugar como em 2.11.
14. Ressuspender as células em 10 ml de chapeamento meio. Contar as células com um hemocitómetro e colocar 9 x 10 ⁴ células / poço em pratos de 24 poços de cultura tratados com colagénio. Incubar em 37 ° C de cultura de tecidos incubadora durante 2 horas. Cada placa pode ser usado tanto para o ensaio de oxidação de ácido gordo ou o ensaio Lipogênese.
15. Opcionalmente, para alterar poços Meio de Manutenção (Tabela 1) e a cultura a 37 ° C. As células podem ser cultivadas durante 2 - 3 dias, sem afectar os resultados do ensaio.

3. Ácidos Graxos Oxidação Assay

Aviso: O uso de radioactividade pode ser perigoso. Todas as compras, armazenamento, manipulação, e disposal de material radioativo deve ser realizado em conformidade com, estado, e regulamentos e diretrizes federais institucionais.

1. 16 - 20 h antes do ensaio, células de lavar 2 vezes com PBS quente. Mudar as células ao soro inanição meio isento de soro (Tabela 1) com 20 nM de glucagon e incubar durante a noite a 37 ° C.
   Nota: Por causa de soro fetal bovino contém uma concentração desconhecida de hormônios metabólicos (por exemplo, insulina, glucagon), soro de morrer de fome as células para remover quaisquer efeitos de confusão que isso pode ter sobre o ensaio. As células são viáveis ​​em soro fome Médio para> 24 hr. Tratamento glucagon é utilizado para estimular a oxidação do ácido gordo no interior dos hepatócitos.
2. Na manhã do dia do ensaio, preparar a pré-incubação Médio: Ressuspender uma quantidade apropriada de palmitato de sódio em água ultrapura para fazer uma solução 100 mM e aquecimento a 70 ° C durante 10 min. Entretanto, a quantidade necessária preparar (0,5 ml por poço de uma placa de 24 poços)de DMEM com 25 mM de HEPES, 1% de BSA Fracção V, e 20 nM de glucagon. Aquece-se a 37 ° C.
   1. Uma vez solubilizado, Palmitato de adicionar a uma concentração final de 250 uM para a forma. Mudar hepatócitos para a pré-incubação médio e incubar a 37 ° C durante 2 horas. Reservar alguns A pré-incubação do meio no 37 ° C, para utilização posterior.
3. Durante a incubação, seco, uma quantidade adequada de ¹⁴ C-palmitato (0,5 uCi / poço) por evaporação sob atmosfera de azoto.
   1. Por exemplo, para medir 24 amostras numa placa de 24 poços, 120 ul de transferir 0,1 uCi / ml de ^C-14 Palmitato de um tubo de 1,5 ml. Lentamente, evapora-se o solvente etanol por sopragem de azoto gasoso através da solução a partir de uma distância de 3-5 cm numa hotte. O solvente deverá evaporar-se em cerca de 30 - 40 min, deixando a seco ^C-14 Palmitato no fundo do tubo.
4. Aproximadamente 15 minutos antes do final da incubação, ressuspender o ¹⁴C-Palmitato em NaOH 0,1 N (12,5 mL / uCi). Incubar a 70 ° C durante 10 min. Adicione três volumes de quente Pré-Incubação Médio e misture pipetando cima e para baixo.
5. Pico de cada poço com 25 uL de ¹⁴ C diluída-palmitato. Misturar agitando suavemente a placa e incubar a 37 ° C durante 90 min. Esta é a placa de ensaio.
6. Durante a incubação, preparar a Placa de filtro de papel (Figura 1).
   1. Remova a tampa de uma estéril placa de 24 poços. Coloque um 2 cm x 2 cm pedaço de papel de filtro na parte inferior de cada um dos poços. Sobrepor a placa com um pedaço de 4 "x 7" parafilme.
   2. Usando um grande objecto rectangular, tal como uma caixa de ponta de micropipeta, esfregue o parafilme nos poços para perfurar o parafilme as aberturas de poços e criar uma vedação ao longo do resto da placa. Remova os círculos perfuradas de parafilm agora cobre as cavidades. A placa deve agora ser firmemente coberto com filme plástico em todas as áreas, exceto o bem openings.
7. 10 minutos antes do final da incubação, adicionar 200 uL de NaOH 3 N a cada poço da placa de papel de filtro, certificando-se o papel de filtro absorve o líquido todo.
   1. Opcionalmente antes da congelação, a transferência do médio para uma nova placa de 24 poços. Após lavagem uma vez com PBS, lisar as células remanescentes em HCl 0,1 N e calcular o teor de proteína por ensaio BCA.
8. No final da incubação, snap-congelar a placa de ensaio em azoto líquido. Tenha cuidado para garantir que cada poço está completamente congelado antes de prosseguir.
9. Adicionar 100 ul de ácido perclórico a 70% a cada poço da placa de ensaio. Cubra imediatamente com a Placa de filtro de papel. Coloque as placas num agitador orbital e rock na velocidade orbital de 80 rpm à temperatura ambiente durante 2 horas.
10. Após a incubação, processar as amostras:
    1. Para medir a fracção de CO _2, transferir os quadrados de papel de filtro para 4 ml de fluido de cintilação líquida num cintilaçãofrasco e medida ¹⁴ do sinal C.
    2. Para medir o material solúvel em ácido, transferir 400 ul de meio para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a velocidade máxima para 10 min. Adiciona-se 100 ul do sobrenadante resultante a 500 mL de 2: 1 de clorofórmio-metanol (v / v), e agitar com vortex brevemente.
       1. Adicionar 250 mL de água à mistura, e novamente vórtice. Centrifugar as amostras durante 10 min a 3.000 x g. Transferir 200 ul da fase superior a 4 ml de fluido de cintilação líquida num frasco de cintilação de ¹⁴ e medir o sinal C.

4. Lipogênese Assay

1. A noite antes de iniciar o ensaio, lavar as células 2 vezes com PBS quente. Alterar os hepatócitos ao soro fome Médio com 100 nM de insulina. Incubar durante a noite a 37 ° C.
   Nota: Por causa de soro fetal bovino contém uma concentração desconhecida de hormônios metabólicos (por exemplo, insulina, glucagon), Soro de morrer de fome as células para remover quaisquer efeitos de confusão que isso pode ter sobre o ensaio. As células são viáveis ​​em soro fome Médio para> 24 hr. A insulina é usada neste ensaio para estimular a lipogénese.
2. Faça Lipogênese Médio: Soro Fome médio com 100 nM de insulina, 10 � de etilo frio e 0,5 uCi ^{de 3} H-Acetato por poço. Mudar para células Lipogênese Médio e incubar a 37 ° C durante 2 horas. Inclui quaisquer compostos de interesse a ser testado.
3. Após o período de incubação, lavar as células 2 vezes com PBS. Lisar as células por raspagem em 120 ul de 0,1 N de HCl. Reserva de 10 uL para o ensaio de proteína (por avaliar ensaio BCA), e transferência de 100 uL para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Extrair lípidos pela adição de 500 ul de 2: 1 de clorofórmio-metanol (v / v). Vortex brevemente e incubar à TA durante 5 min. Adicionar 250 uL de água, vortex e incubar à temperatura ambiente durante um adicional de 5 min. Centrifugar as amostras 10 min a 3000 xg, RT. Cuidadosamentetransferência de fase inferior a 4 ml de fluido de cintilação líquida num frasco de cintilação e medir a actividade de ³ h.

Resultados

Isolamentos de hepatócitos normalmente resultam em 1 - 3 x ¹⁰ 7 células totais. Após incubação durante a noite, as células aparece hexagonal, muitos dos quais serão binucleadas (Figura 2). As células saudáveis ​​deve ser desprovido de granulações ou bolhas, que são indicativas de morte celular.

Em geral, o ensaio de oxidação de ácido gordo é executado em três a quatro réplicas por composto de teste. Conta para o CO _{2 amostras} são aproximadamente um quin...

Discussão

O tempo de sacrifício para perfusão deve ser inferior a 3 minutos para perfusão ideal e digestão com colagenase do fígado. Uma vez que a perfusão com Perfusão Médio é iniciada, o fígado deve imediatamente alterar a aparência do vermelho ao pálido. Após aproximadamente 10 minutos de incubação com LDM, o fígado aparece inchado e rosa. No caso em que a perfusão é insuficiente, o fígado podem não exibir estas mudanças, e este será normalmente resultam num rendimento mais baixa de hepatócitos.

Ap...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tecnologias de Vida Média de Perfusão Hepática		17701038
Fígado Digest Tecnologias de Vida Média		17703034	Alíquota e armazene a -20 &graus; C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Collagen	Life Technologies	A1048301
Sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona	GE Life Sciences	17-0891-01
Piruvato de Sódio	Cellgro	25-000-CI
Penicilina / Estreptomicina	Cellgro	30-001-CI
Insulina	Sigma	I0516-5ML
Dexametasona	Sigma	D2915-100MG
Albumina (BSA), Prato	de	Poços Fraction V MP Biomedicals
	Corning Falcon	353047
Tubulação Tygon S3	Cole Parmer	06460-34
Conectores de Trava de Leur Macho para 200 Barbs	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" Cateter	SurFlo	SROX2419CA
Perma-Hand Silk Suture	Ethicon	683G
Cell Strainer	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Recirculação Banho-maria	Fisher	13-874-3
Bomba Peristáltica MasterFlex C/L MasterFlex		HV-77122-24
Microclamp	Roboz	RS-7438	Pré-esterilizar em autoclave
5" Tesoura de operação reta e romba	Roboz	RS-6810	Pré-esterilizar em autoclave
Lâmina de 24 mm Tesoura de microdissecação reta e de ponta afiada	Roboz	RS-5912	Pré-esterilizar em autoclave
4" Pinça de microdissecação de ponta de 0,8 mm	Roboz	RS-5130	Pré-esterilizar em autoclave
4" Pinça de microdissecação de curva completa de ponta de 0,8 mm	Roboz	RS-5137	Pré-esterilizar em autoclave
Seringa de 60 ml	Becton Dickinson	309653
tubos cônicos de 50 ml Ensaio	BCA Corning Falcon	352070
	Thermo Scientific	23225
			biossegurança
CO2 Incubadora
Sorológica pipetas
1.000, 200, 20 μ l pipeta e dicas