Projetado retalho do músculo vascularizada

Summary

Até o momento, os defeitos de tecido espesso são normalmente reconstruídos com a aplicação de retalhos de tecido autólogo ou tecidos projetados. Neste protocolo, apresentamos um novo método de engenharia de retalho de tecido vascularizado com pedículo autólogo, para servir como substituto dos retalhos autólogos.

Abstract

Um dos principais fatores que limitam a espessura de uma construção tecidual e sua consequente viabilidade e aplicabilidade in vivo, é o controle do suprimento de oxigênio para o microambiente celular, pois a difusão passiva é limitada a uma camada muito fina. Embora vários materiais tenham sido descritos para restaurar a integridade de defeitos de espessura total da parede abdominal, nenhum material ainda se mostrou ideal, devido à baixa vascularização do enxerto, rejeição tecidual, infecção ou propriedades mecânicas inadequadas. Este protocolo descreve um meio de engenharia de um retalho totalmente vascularizado, com espessura relevante para a reconstrução do tecido muscular. As construções de ácido poli L-láctico / ácido poli lático-co-glicólico incorporadas em células são implantadas ao redor da artéria e veia femoral do camundongo e mantidas in vivo por um período de uma ou duas semanas. O enxerto vascularizado é então transferido como um retalho em direção a um defeito de espessura total feito no abdome. Essa técnica substitui a necessidade de sacrifícios de tecido autólogo e pode permitir o uso de retalhos vascularizados projetados in vitro em muitas aplicações cirúrgicas.

Introduction

Defeitos da parede abdominal, muitas vezes surgem após trauma grave, o tratamento do câncer, queimaduras e remoção de malha infectado. Esses defeitos envolvem frequentemente perda de tecido significativa, exigindo procedimentos cirúrgicos complicados e apresentando um grande desafio para os cirurgiões plásticos de reconstrução ^1-4. Pesquisadores de engenharia de tecidos que procuram novas fontes de tecidos artificiais têm explorado diferentes materiais, fontes de células e fatores de crescimento. Restaurações de sucesso de vários tecidos, tais como ^5,6 traqueia, bexiga ^{7, 8,} córnea, ossos e pele ^{9 10,} por implantação de tecidos artificiais foram relatados previamente. No entanto, a fabricação de um tecido vascularizado espessura de engenharia, em particular para a reconstrução de defeitos grandes, continua a ser um desafio significativo na engenharia de tecidos.

Um dos principais fatores que limitam a espessura de uma construção de tecido viável é o controle do suprimento de oxigênio para seus contrastituent células. Quando depender de difusão, construir espessura é limitado ao de uma camada muito fina. A distância máxima entre o oxigénio e os capilares de fornecimento de nutrientes in vivo é de aproximadamente 200 pM, que se correlaciona com o limite de difusão de oxigénio ^11,12. Vascularização insuficiente pode resultar em isquemia tecidual e escalar a reabsorção de tecido ou necrose ^13.

Além disso, o material ideal para a reconstrução de tecidos utilizados devem ser biocompatíveis e não-imunogénico. Ele também deve ser capaz de promover uma maior integração de células hospedeiras com o biomaterial, e manter a integridade estrutural. Vários biológicos ^14-16 e sintéticas ^1,17,18 matrizes tenham sido previamente exploradas para a reconstrução de tecidos, no entanto a sua utilização permanecem limitados devido à falta de fornecimento de sangue eficaz, infecções ou tecido força insuficiente.

Neste estudo, um biocompatível, célula-EMBandaime edded composta por Food and Drug Administration (FDA) de ácido poli -aprovado L-láctico (PLLA) / poli ácido láctico-co-glicólico (PLGA), foi implantado em torno da artéria e veia femoral (AV) navios de um ratinho nu e separadas a partir do tecido circundante, assegurando vascularização a partir de apenas os vasos AV. Uma semana após a implantação, o enxerto era viável, grosso e bem vascularizado. Este tecido vascularizado espesso com os vasos AV, foi então transferido como um retalho pediculado a um defeito de espessura total abdominal no mesmo mouse. Uma semana após a transferência, o retalho foi viável, vascularizado e bem integrado com o tecido circundante, tendo força suficiente para suportar vísceras abdominais. Assim, a aba de engenharia de espessura, o tecido vascularizado, tendo um pedículo autólogo, apresenta um novo método para a reparação de defeitos da parede abdominal de espessura total.

Protocol

Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal do Technion. Para este procedimento, utilizaram-se ratinhos nus atímicos, para evitar a rejeição imunológica. Se utilizar outro tipo de mouse, os ratos devem ser raspada antes do procedimento cirúrgico e administração de ciclosporina (ou outro substituto anti-rejeição) é recomendado.

1. Preparação e andaime celular Embedding

1. Prepare andaimes compostas de mistura 1: 1 de poli-L-láctico-ácido (PLLA) e poli láctico-co-glicólico-ácido (PLGA), da seguinte forma:
   1. Dissolve-se 500 mg de PLLA e 500 mg de PLGA em 10 mL de clorofórmio.
   2. Adicionar 0,24 ml de solução de polímero a 0,4 g de partículas de cloreto de sódio reunidos em moldes de Teflon. Use um diâmetro sal de 212-600 m. Permitir que o clorofórmio se evaporar O / N.
   3. Lixiviar o sal usando água destilada levando a scaffolds 3D porosas interligados.
   4. Corte pedaços de polímerousando uma tesoura, em seguida, mergulhar em etanol a 70% (v / v) durante 30 min e lava-se 3 vezes em PBS durante 2 min antes da utilização.
2. Prepara-se uma tri-cultura de células que se segue em 1: meio de células 1 endotelial (EGM-2 suplementado com os componentes do seu kit de marcador e meio de células do músculo (meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS ), 2,5% de tampão HEPES, 100 U / ml de penicilina, e 0,1 mg / ml de estreptomicina (Pen-Strep solução).
   1. Utilizar 0,5 x 10 ⁶ mioblastos C2C12, 0,9 x 10 ⁶ células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e 0,2 x 10 ⁶ fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF).
3. Misturar as células em conjunto num tubo de microcentrífuga e centrifugar a 200 xg durante 4 min, Aspirar o meio e re-suspender o sedimento em uma mistura de solução de matriz extracelular fria 4 ul de gelo e 4 ul de meio celular.
4. Cortar um pedaço de 10 mm x 7 mm x 1 mm (comprimento x largura x espessura) de PLLA / PLGUm andaime e propagar a suspensão de células numa placa de 6 poços, permitir que a solução de matriz extracelular para solidificar (30 min, 37 ° C, _5% de CO2) antes da adição de 4 ml de meio de células.
5. Incubar os andaimes para dez dias antes da implantação e substituir o meio todos os outros dias.

2. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico

1. Prepare e esterilizar (autoclave) os seguintes instrumentos cirúrgicos: um pequeno, muito bem, tesoura reta, uma tesoura primavera, uma linha reta, pinça de ponta fina, uma pinça serrilhada e um suporte de agulha.
2. Prepara-se uma mistura de cetamina: xilazina solução num tubo de microcentrífuga por mistura de 425 ul de cetamina e xilazina 75 ul de uma seringa de 1 ml.
3. Dilui-se 0,3 mg / ml de buprenorfina em solução salina estéril (01:20).

3. Flap Construção (Graft Implantação)

1. Usando uma seringa de insulina, anestesiar o rato por uma injecção intraperitoneal de cetamina: xilazina (35 ul por20 g de peso corporal).
2. Injectar subcutaneamente buprenorfina (concentração final de 0,05-0,1 mg / kg) antes do opperation.
3. Posicione o mouse em uma fase aquecida a 37 ° C, para garantir a temperatura normal do corpo, e em seguida, prenda o rato usando uma bandagem adesiva.
4. Usando pontas de algodão, administrar pomada lubrificante para os olhos do mouse (para evitar a desidratação).
5. Utilizando pontas de algodão, limpo local da incisão com iodo e, em seguida, com 70% de etanol, para estabelecer um campo de trabalho asséptico.
6. Usando pequenas tesouras e pinças, fazer uma incisão através da pele, a partir do nível do joelho ao ligamento inguinal, paralela aos vasos femorais, até que a artéria e veia femoral (AV) navios estão expostos.
7. Segure a pele para baixo, usando um afastador, para obter um melhor acesso ao tecido.
8. Utilizando tesouras e pinças de mola, isolar cuidadosamente os vasos artéria e veia femorais a partir do tecido circundante. Iniciar a partir do nível do lig inguinalament à bifurcação dos vasos epigástricas superiores. Deixar a profunda intacto, de modo a preservar o fluxo de sangue para a perna e prevenir isquemia subsequente.
9. Dobre o enxerto (da Seção 1) em torno do AV femoral exposta, abaixo da profunda e acima da bifurcação para o tibial e AV proneal, ea participar nas suas extremidades, utilizando suturas de seda 8-0.
10. Para garantir a vascularização do implante pelos capilares brotando apenas os vasos femorais AV, enrole um pedaço de látex esterilizadas ao redor do enxerto, e sutura com 6-0.
11. Feche a pele sobrejacente usando 4-0 seda.
12. Monitorar de perto o mouse até a recuperação da anestesia e todos os dias depois, até que o enxerto é transferido como retalho. Injectar subcutaneamente buprenorfina (concentração final de 0,05-0,1 mg / kg) duas vezes por dia durante 2-3 dias.
    NOTA: Use salina em qualquer fase, para evitar a desidratação do tecido exposto.

4. Flap Transferência

1. Em um ouduas semanas após a implantação, anestesiar o rato por uma injecção intraperitoneal de cetamina: xilazina (35 mL / 20 g), usando uma seringa de insulina.
2. Injectar subcutaneamente buprenorfina (concentração final de 0,05-0,1 mg / kg) antes do opperation.
3. Posicione o mouse em uma fase aquecida a 37 ° C, para garantir a temperatura normal do corpo, e em seguida, prenda o rato usando uma bandagem adesiva.
4. Usando pontas de algodão, aplique pomada lubrificante para os olhos do mouse (para evitar a desidratação).
5. Usando pontas de algodão, limpe o local da incisão (da área de joelho para o abdome) com iodo e, em seguida, com etanol 70%, para estabelecer um campo de trabalho asséptico.
6. Usando uma tesoura e uma pinça, abra cuidadosamente as suturas na pele e, usando uma tesoura, fazer uma incisão através da pele paralelamente ao ligamento inguinal, continuando através da pele ventral.
7. Retire cuidadosamente o pedaço de látex com uma pinça e expor a retalho vascularizado.
8. Usando um SCISSRUP e uma pinça, dissecar a retalho de tecido a partir do tecido circundante.
9. Utilizando um fórceps e um suporte de agulha, ligar a extremidade distal do AV femoral com 8-0 suturas de seda para evitar o sangramento a partir do AV. Em seguida, cauterizar o AV ao nível do joelho, distalmente para o tecido implantado dobrado e as suturas 8-0.
10. Suavemente transferir o AV femoral envolvido pelo enxerto, em direcção à parede abdominal ventral, evitando danos na artéria, para determinar a que distância deve ser feito o defeito de espessura total.
    CUIDADO: Puxar a artéria muito longe irá danificar a artéria.
11. Usando uma multa tesoura, fazer uma incisão na parede abdominal ventral.
12. Usando uma tesoura primavera, fazer uma incisão no músculo reto abdominal. Remover uma cerca de 1 cm x 0,8 centímetros segmento do músculo reto abdominal com a pele sobrejacente.
13. Transferir a AV femoral, envolvido pelo enxerto vascularizado, tal como uma aba axial, para o defeito de espessura total na Abdom ventralparede inal.
14. Suturar a aba para o tecido muscular circundante, utilizando 8-0 suturas de seda, para evitar hérnia.
15. Para evitar suturando os órgãos internos, aumentar o músculo com uma pinça de sutura quando a aba ao músculo abdominal. Deixar a pele ventral exposta para mimetizar o efeito de uma lesão na parede abdominal completa.
16. Cobrir a ferida na pele com uma gaze iodado e uma gaze esterilizada para evitar a contaminação da superfície exposta.
17. Suturar a pele da perna utilizando 4-0 suturas de seda.
18. Monitorar de perto o mouse até a recuperação da anestesia e todos os dias depois, até a recuperação do retalho. Injectar subcutaneamente buprenorfina (concentração final de 0,05-0,1 mg / kg) duas vezes por dia durante 2-3 dias.
19. NOTA: Utilize soro fisiológico em qualquer fase para evitar a desidratação do tecido exposto.

5. Determinação do ultra-som de perfusão vascular do enxerto

NOTA: Antes da transferência, o perfusão vascularf o enxerto é medida em uma e duas semanas após o implante, por ultra-sonografia.

1. Anestesiar o rato usando 2% de isoflurano.
2. Posicione o mouse em um palco móvel aquecida a 38 ° C, para garantir a temperatura normal do corpo, e em seguida, prenda o rato usando uma bandagem adesiva.
3. Encontre os vasos artéria e veia femoral com transdutor não-linear definido no modo-B.
4. Examine a permeabilidade dos vasos femorais do enxerto utilizando o transdutor de definir o modo Doppler colorido.
5. Prepare agente não específico contraste de acordo com as instruções do fabricante.
6. Conectar um cateter na veia da cauda (12 cm tubo com uma agulha 27 G) para uma seringa de 1 ml cheio com solução salina. Fixe a seringa ao lado do mouse sobre a fase de aquecimento (para evitar o movimento da seringa).
7. Conecte o cateter à veia da cauda do rato e segura a agulha.
8. Injectar alguma da solução salina para assegurar que ambas as injecções são feitas na veia e para preenchera tubagem com solução salina (para evitar bolhas de ar).
9. Encha uma seringa de 1 ml com 70 ul de agente de contraste e substituir a solução salina com uma seringa da seringa agente de contraste.
10. Defina-se a ultra-sons para injecção imagem do agente de contraste. Em propriedades de modo não-linear configurar o número de quadros a 1.500 e o pulso de ruptura de 30% das armações.
    NOTA: Após o pulso de ruptura, as microbolhas voltar a encher os recipientes a uma taxa que depende da taxa de fluxo das microbolhas nos capilares e é independente da taxa de injecção de microbolhas. O número de quadros pode ser alterado de acordo com o tempo de enchimento ^19,20.
11. Lentamente injectar o agente de contraste na veia da cauda.
12. Captar imagens no modo de contraste não-linear do sistema de ultra-som de alta-resolução.
13. Analisar os resultados usando o software, conforme descrito previamente ^19,20.
    1. Desenhe uma região de interesse (ROI) na imagem obtida immediatamente após o pulso de ruptura no modo de contraste. O ROI deve delinear a área preenchida apenas pelo agente de contraste.
    2. Calcula-se a intensificação de pico (PE), que é a razão entre a intensidade média do sinal não-linear após a injecção das microbolhas contra após o pulso ruptura, e é uma medida do volume de perfusão.
    3. Calcula-se a taxa de fluxo, a qual é determinada a partir do tempo (T), que decorre até que o sinal de pico (P).

6. Determinação do grau de vascularização do enxerto

NOTA: A extensão da vascularização do enxerto de tecido é determinada de uma ou duas semanas após o implante.

1. Usando uma seringa de insulina, anestesiar o rato por uma injecção intraperitoneal de cetamina: xilazina (35 mL / 20 g).
2. Usando uma seringa de 1 ml, por via intravenosa injectar 200 ul de 10 mg / ml de dextrano conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC-Dextrano, MW = 500,000) na veia da cauda.
3. Dez segundos após o término da injecção, o rato eutanásia por deslocação cervical.
4. Abra a perna do rato e expor o enxerto.
5. Lavar a área do enxerto com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e aplicam-se 10% de formalina tamponada neutra.
6. Imagem do enxerto na perna do rato, utilizando um microscópio confocal.
7. Quantificar a densidade de vasos funcional (FVD).
   1. Isolar o canal verde (excitação = 488 nm) das imagens microscópicas confocal.
   2. Passar as imagens resultantes através de um filtro passa-alto, a fim de acentuar as estruturas de alto contraste.
   3. Usar um filtro despeckling para remover o ruído que pode ter sido amplificado pelo filtro passa-alto.
   4. Configure o valor do limiar na imagem resultante; o valor de limiar é ajustado de modo que as características e as estruturas na imagem original são visíveis na imagem binária.
   5. Aplicar um limite de tamanho para que apenas grupos de pixels conectados maior do que o definido size limiar permanecer na imagem binária.
   6. Esboço do esqueleto dos navios no enxerto utilizando o algoritmo de Zhang-Suen ^21.
   7. Calcular o FVD pela soma dos comprimentos da linha média de cada recipiente e dividindo o resultado pela área da ROI.

7. A coloração histológica e imuno do enxerto

1. A coloração imuno
   1. Depois de imagem confocal, recuperar o enxerto usando uma pequena tesoura e uma pinça. Dissecar as embarcações AV nas duas extremidades do enxerto e recuperar o enxerto.
   2. Corrigir os enxertos em 10% formalina tamponada neutra por 30 minutos - 2 horas.
   3. Coloque os enxertos em cassetes de Histologia e loja em etanol a 70% até parafina.
   4. Incorporar em parafina usando um padrão de fixação e incorporação de protocolo ^{22 e} fatiar os tecidos embebidos em parafina em 5 mm fatias utilizando um micrótomo. Fatie todo o tecido perpendicularmente à AVembarcações.
   5. Desparafinar as secções embebidas em parafina, por imersão em 100% de xileno, duas vezes, durante 10 min cada.
   6. Dispor as lâminas em um frasco de 250 ml de Coplin plástica.
   7. Rehidratar por imersões em série em concentrações decrescentes de etanol (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% e água duplamente destilada (ADD)) durante 3 minutos cada.
   8. Preparar a solução de antigénio de desmascaramento diluindo 2,35 ml de solução de antigénio de desmascaramento com 250 mL de ADD. Aquece-se a solução de antigénio desmascaramento durante 2 minutos num forno de microondas configurado para 95 ° C.
   9. Inserir as lâminas para a solução de antigénio desmascaramento pré-aquecida e o calor novamente durante 3 minutos num forno de microondas configurado para 95 ° C. Arrefecer as lâminas a 50 ° C.
   10. Aqueça novamente por 2 min e depois arrefecer a RT.
   11. Incubar as lâminas em _3,3% de H 2 _O 2 em solução de metanol, durante 10 min, à RT para extinguir a actividade da peroxidase endógena e depois lavar duas vezes em PBS.
   12. Preparar uma câmara de incubação: lugar molhado absofolhas rbent dentro de uma caixa de histologia e secar as lâminas através de limpadores de pára-tarefa delicada.
   13. Círculo área da fatia na lâmina utilizando uma caneta hidrofóbica e incubar durante 30 min à temperatura ambiente, com cerca de 50 ul de solução de soro de cabra (2%, preparado em PBS) por cada fatia de bloqueio.
   14. Dilui-se o anticorpo de coelho anti-CD31 anticorpo 1:50 em solução de bloqueio, aplicar cerca de 50 ul de anticorpo por fatia e incubar S / N, a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBS, 5 minutos cada.
   15. Dilui-se a biotinilado de cabra anti-coelho secundário de anticorpo de 1: 400 em PBS, as lâminas lugar ao longo de aproximadamente 50 ul de anticorpo por fatia e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
   16. Lavar 3 vezes com PBS, 5 minutos cada.
   17. Dilui-se estreptavidina-peroxidase 1: 400 em PBS, aplicam-se aproximadamente 50 ul por fatia e incubar com as lâminas durante 30 min, à RT. Lavar 3 vezes com PBS, 5 minutos cada.
   18. Aplicar aproximadamente 50 ul de aminoetilcarbazole (AEC) substrato por fatia, de acordo com o fabricante & #8217; s instruções. Mergulhar as lâminas em DDW para parar a reacção.
   19. Manchar os núcleos em azul por imersão das secções em cerca de 50 ul de solução de hematoxilina de Mayer durante 2 min. Delicadamente lave em água e, em seguida, cobrir as seções com meio de montagem.
   20. Quantificar coloração CD31-positivo usando uma abordagem de duplo-cego. Coloração CD31 aparece como uma mancha marrom. Escolha 4-5 campos diferentes em um campo de visão de ampliação 40X sob um microscópio binocular. Contar o número de lúmenes CD31-positivas.
       1. Calcula-se a média do número de lúmenes CD31-positivo por andaime, dividindo o número total de lúmens contados com o número de campos e o fieldarea (de acordo com os dados binocular).
          NOTA: O volume de reagente aplicado deve ser suficiente para cobrir toda a fatia descrito.
2. Coloração histológica
   1. Corrigir enxertos em 10% formalina tamponada neutra.
   2. Enxertos Incorporar em parafina usando o padrãofixação e procedimentos de incorporação.
   3. Remover a parafina das secções embebidas em parafina, por imersão em xileno, duas vezes 100% durante 10 min.
   4. Lavagem rápida duas vezes para reidratação em 100% isopropanol.
   5. Lavagem rápida duas vezes 95% de etanol.
   6. Lavar três vezes na água da torneira.
   7. Mergulhe em Hematoxilina para 10 min.
   8. Lavar três vezes na água da torneira.
   9. Immere em Eosina por 2 min.
   10. Lavagem rápido desidratar em 95% de etanol duas vezes.
   11. Rápido lavagem 100% isopropanol duas vezes.
   12. Rápido lavagem 100% de xileno duas vezes.
   13. Cubra com DPX cola com tampa de vidro 1,5 mm de espessura.
   14. Imagem usa o microscópio no 40X.

8. Mechanical Assessment Propriedades

1. Recuperar o enxerto usando uma pequena tesoura e uma pinça.
2. Lavar o enxerto em PBS.
3. Medir a largura e a espessura do enxerto e calcular a área da secção transversal como a largura multiplicado pela espessura.
4. NosPT O instrumento de teste para gerar uma curva de tensão-deformação de enxertos hidratados.
   1. Monte o enxerto entre os apertos de tração do sistema e medir o comprimento final entre as duas alças (ou seja, comprimento inicial).
   2. Aplicar uma taxa de deformação de 0,01 mm / seg, até a falha.
   3. Registar a força desenvolvida e deslocamento utilizando o protocolo do fabricante.
   4. Gerar uma curva de tensão-deformação em Matlab.
      1. Calcular estirpe de acordo com o deslocamento dividido pelo comprimento inicial. O stress é calculada como a força medida dividida pela área de corte transversal.
      2. Determinar a rigidez como a inclinação da região linear-o na curva de tensão-deformação e o ponto máximo da curva é a força de tracção máxima.

Results

Vascularização do enxerto e perfusão in vivo

Os enxertos foram implantadas uma ou duas semanas, antes da sua transferência como abas axiais. Em um e duas semanas pós-implantação, a observação bruta da área do enxerto revelou enxertos de tecidos vascularizados e viáveis. Estes enxertos provou ser altamente vascularizado, tal como determinado por imunocoloração positiva de CD31 (Figura 1A), e altamente perfundidos, como evidenciado por injecção na veia da cauda de ult...

Discussion

Os avanços na engenharia de tecidos foram atingidos com uma crescente demanda por tecidos substitutos para a reconstrução de vários tipos de tecido. Uma variedade de sintéticos e biológicos ^{1,17,18 14-16} materiais, bem como métodos de fabricação foram avaliados quanto à sua capacidade para responder a estas exigências. No entanto, apesar dos progressos no tratamento clínico e em engenharia de tecidos, a restauração de defeitos da parede abdominal de espessura total continua a ser um desafio. Um tec...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pequena tesoura reta fina	Ferramentas de Fine Science (FST)	14090-09
tesoura de mola	Ferramentas de Ciência Fina (FST)	15003-08
pinça reta com ponta fina	Ferramentas de Ciência Fina (FST)	11251-20
pinça serrilhada	Porta-agulhas Fine Science Tools (FST)	11050-10
	Ferramentas Fine Science (FST)	12500-12
Cauterizador de pequenos vasos	Ferramentas de Ciência Fina (FST)	18000-00
Duratears	Alcon	5686
Sedaxylan	Euravet	DJ03
Clorketam 1000	Vetoquinol	4A0726B
Buprenorfina	vetmarket	B15100
4-0 suturas de seda	Suturas Assut	647
6-0 suturas de polipropileno	Suturas Assut	9351F
8-0 suturas de seda	Suturas Assut	684568
Seringa de insulina (agulha de 6 mm)	BD	324911
Vevo 2100 sistema de ultrassom de alta resolução	VisualSonics inc.
Transdutor não linear MS250	VisualSonics inc.
Agente de contraste não direcionado a micromarcadores	VisualSonics inc.	VS-11694
cateter de veia caudal	VisualSonics inc.	VS-11912
Vevo 2100 software	VisualSonics inc.
dextrano conjugado com isotiocianato de fluoresceína	Sigma	FD500S
Matlab	Mathworks, MA, USA
Kimwipes	Kimtech	34120
solução de desmascaramento de antígeno	Vector laboratories	H-3300
anti-CD31 anticorpo	Abcam	ab28364
biotinilado anti-coelho (secundário) anticorpo de cabra Vector	laboratories	BA-1000
estreptavidina-peroxidase	Jackson	016-030-084
Solução de hamatoxilina de Mayer	Kit de substrato Sigma-Aldrich	MHS-16
aminoetilcarbazol (AEC)	Life technologies, Invitrogen	00-2007
Vectamount	Vector laboratórios	H-5501