Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

Summary

Os macrófagos hepáticos, denominados células de Kupffer, são responsáveis pela captura de nanopartículas circulantes. Descrevemos aqui um método, de alta pureza e rendimento celular, para isolamento de células de Kupffer. O ensaio LDH modificado é usado aqui para medir a toxicidade induzida por nanotubos de carbono em células de Kupffer.

Abstract

A grande maioria dos estudos in vitro nanotoxicological usaram linhas celulares imortalizadas para a sua viabilidade. No entanto, os resultados de testes de toxicidade de nanopartículas em linhas de células imortalizadas ou células primárias têm mostrado discrepâncias, destacando a necessidade de estender o uso de pilhas para ensaios in vitro. Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos de fígado de rato, células de Kupffer nomeados, e a sua utilização para estudar a toxicidade das nanopartículas. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e fazem parte do sistema retículo endotelial (RES), responsável pela captura de nanopartículas de circulação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método, baseado na digestão com colagenase e centrifugação de densidade, é uma adaptação do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et ai. projetado para rato isolatio células do fígadon e proporciona um rendimento elevado (até 14 x 10 ⁶ culas por ratinho) e de alta pureza (> 95%) das células de Kupffer. Este método de isolamento não requer equipamento sofisticado e caro e, por conseguinte, representa um compromisso ideal entre a complexidade e de rendimento celular. A utilização de ratos mais pesados ​​(35-45 g) melhora o rendimento do método de isolamento, mas também facilita notavelmente o procedimento de canulação da veia porta. A toxicidade de nanotubos de carbono funcionalizadas f -CNTs foi medido neste modelo pelo ensaio de LDH modificado. Este método avalia a viabilidade das células medindo a falta de integridade estrutural da membrana da célula de Kupffer, após incubação com -CNTs f. Toxicidade induzida pelo -CNTs f pode ser medido de forma consistente com este ensaio, destacando que as células de Kupffer isoladas são úteis para testes de toxicidade das nanopartículas. A compreensão global do nanotoxicology poderiam se beneficiar de tais modelos, tornando a seleção de nanopartículas para tradução clínica mais eficient.

Introduction

O campo da pesquisa nanotoxicology tem como objetivo caracterizar o efeito biológico das nanopartículas. Estudos toxicológicos in vivo com base em investigações continuam a ser os métodos mais precisos. No entanto, seu uso é limitado pelo seu custo, trabalho e requisitos de tempo ^um. Como alternativas, em ensaios in vitro têm sido utilizados por causa da sua simplicidade e da possibilidade de desenvolvimento de alto rendimento em plataformas de ensaios in vitro, ² - estendendo-se assim o número de condições testadas. A maioria dos estudos nanotoxicological são realizados utilizando ensaios in vitr....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes e regulamentos relevantes e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do regulamento escritório UK Home

1. Perfusão e Cobrança celular (Figura 1)

Figura 1:. Perfusão do fígado Após anestesia do rato, o tracto digestivo está deslocado lateralmente para a esquerda do abdómen de modo a tornar a veia porta (VP) acessível. O PV é canulada usando uma....

Results

O número de células não-parenquimatosas purificadas foi consistente e variou entre 8 e 14 x 10 ⁶ culas por rato (17 isolamentos foram realizadas). Cada isolamento do mouse foi suficiente para a chapa 16-28 poços. A viabilidade das células por coloração com azul de tripano demonstrou a viabilidade das células ~ 95%. Células de Kupffer mostrou uma forma redonda dentro de 30 min de incubação a 37 ° C, relacionada com a sua morfologia aderente incompleta (Figura 4A). Às 4 horas de incubação e, po.......

Discussion

Os passos seguintes são fundamentais para alcançar alta produtividade e alta viabilidade das células de Kupffer. Condições assépticas devem ser usadas para limitar o risco de contaminação bacteriana e fúngica. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes da utilização. Os reagentes devem ser preparadas antes de realizar o procedimento de isolamento.

A escolha de colagenase IV, com baixa atividade tríptico, é crucial. Lotes diferentes do mesmo fornecedor tem actividade enzimática difer.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camundongos CD1 euthatal (pentobarbital sódico)	Merial
	Charles River	-	O peso do mouse deve variar de 35 a 45 g. Aconselhamos o uso de camundongos CD1 machos, pois seu peso aumenta rapidamente (por exemplo um camundongo CD1 macho de 7 semanas de idade excede 35 g de peso). Também é aconselhável entrar em contato com o fornecedor de animais com antecedência para providenciar a entrega de animais mais velhos. Alternativamente, os animais podem ser internos para atingir o peso desejado.
HBSS (Ca2+ e Mg2+ free, com bicarbonato)	Tecnologias de Vida	14175-053	HBSS deve ser  Ca2+ grátis.
Sal tetrassódico de ácido etilenoglicol tetracético (EGTA)	Sigma-Aldrich	E8145	O EDTA também pode ser usado, mas o EGTA tem a vantagem de quelar Ca2+ seletivamente.
HEPES (1 M)	Tecnologias de Vida	15630-056	100 ml
Colagenase tipo IV	Worthington	CSL-4	É aconselhável testar diferentes lotes de colagenase ou pelo menos mencionar ao fornecedor que o produto deve ser adequado para isolamento de células hepáticas
DMEM de baixa glicose	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (com piruvato de sódio e Glutamax)	Tecnologias de Vida	12633-012	500 ml
Penicilina/Steptomicina	Tecnologias de Vida	15140-122	Soro Fetal Bovino de 100 ml
	Primeiro link	60-00-850	500 ml
Solução de azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Solução de partículas de sílica revestida (Percoll)	GE Healtcare	17-0891-02	O Percoll® é muito estável e pode ser mantido por vários anos
1x Solução salina tamponada com fosfato	Tecnologias de Vida	10010-023	500 ml
10x Fosfato Tampolado Salino	Tecnologias de Vida	70011-036	500 ml
de dimetilsulfóxido	Fisher	D/4120/PB08	500 ml
Kit LDH (CytoTox 96)	Promega	G1781	Mantenha-se protegido da luz
DMEM vermelho de fenol livre	Life Technologies	31053-028	500 ml
Anticorpo F4/80 (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	Não diluir, usado puro para citometria de fluxo
Grânulos fluorescentes	Sigma	L2778	Grânulos de látex, poliestireno modificado com amina, vermelho fluorescente. 1 ml
Nome do Material	Empresa	Número de catálogo	Comentários/Descrição
Conjunto de coleta de sangue de borboleta (tubo de 23 G/305 mm de comprimento)	BD
Filtros de Seringa (0,22 μ m Blue Rim)	Minisart	16534-K
Tubos de Centrífuga (50 ml Tampa Azul)	BD Biosciences, Falcon	35 2070
Placa de Petri (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100 μ Filtro de célula M	BD	352360
Bomba peristáltica	Watson Marlow	SciQ 300	Enxágue o tubo antes e depois de cada uso com PBS estéril e etanol a 70%.
Placas de 24 poços	Corning	3526
placas de 96 poços	Corning	Centrífuga 3595
	Eppendorf	5810R
Leitor de placas	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine fórceps	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	A pinça serrefine permite pinçar o vaso canulado com a agulha 23 G sem a necessidade de segurar a pinça durante o procedimento de perfusão. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Tubos de citometria de fluxo	BD Biosciences, Falcon
Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)	Elkay	000-MICR-150
Raspador de células	BD Biosciences, Falcon	353086	Corte as extremidades da lâmina com uma tesoura para raspar as células em placas de 24 poços.
Nome da empresa de reagentes		Número de catálogo	Comentários/Descrição
Solução EGTA (Ácido Etilenoglicol Tetracético)/HBSS (Solução Salina Balanceada de Hank)			HBSS contendo 0,5 mM EGTA e 25 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,4. Prepare 50 ml para cada fígado perfundir.
Solução de colagenase			DMEM baixa glicose contendo colagenase tipo IV a 100 UI/ml, HEPES 15 mM e Penicllin/Estreptamicina a 1% (v/v). Ajuste o pH para 7,4. Prepare 100 ml para cada fígado perfundir. Após a adição da colagenase, é aconselhável aquecer a solução por 30 min antes do uso. Isso permite que a atividade da colagenase seja ótima.
Meio de Isolamento de Células Kupffer			RPMI contendo, 1% de Aminoácidos Não Essenciais (v/v), 1% de glutamax® (v/v) e 1% de Penicllin/Estreptomicina (v/v). Prepare pelo menos 100 ml para 1-3 fígados.
Meio de Cultura de Células Kupffer			RPMI contendo 10% de Soro Fetal Bovino, 1% de Aminoácidos Não Essenciais (v/v), 1% de Glutamax® (v/v) e 1% de Penicllin/Estreptamicina (v/v). Prepare pelo menos 100 ml para 1-3 fígados.
SIP (solução de partículas de sílica revestidas isotônicas)			Misture 1,7 ml de 10x Phosphate Buffered Saline com 15,3 ml de Percoll® para obter 17mL de SIP.
Solução SIP a 25%			Misture 5 ml de SIP com 15 ml de 1x Solução salina tamponada com fosfato
Solução SIP a 50%			Misture 10 ml de SIP com 10 ml de 1x Solução salina tamponada com fosfato
Tampão			DMEM com 0,9% de Solução
		PBS/BSA	Prepare solução salina tamponada com fosfato fresco pH 7,4 com 1% de albumina de soro bovino.