Artigo de método

Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

DOI:

10.3791/52989

⸱

18 de agosto de 2015

 ,  , 
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os macrófagos hepáticos, denominados células de Kupffer, são responsáveis pela captura de nanopartículas circulantes. Descrevemos aqui um método, de alta pureza e rendimento celular, para isolamento de células de Kupffer. O ensaio LDH modificado é usado aqui para medir a toxicidade induzida por nanotubos de carbono em células de Kupffer.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A grande maioria dos estudos in vitro nanotoxicological usaram linhas celulares imortalizadas para a sua viabilidade. No entanto, os resultados de testes de toxicidade de nanopartículas em linhas de células imortalizadas ou células primárias têm mostrado discrepâncias, destacando a necessidade de estender o uso de pilhas para ensaios in vitro. Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos de fígado de rato, células de Kupffer nomeados, e a sua utilização para estudar a toxicidade das nanopartículas. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e fazem parte do sistema retículo endotelial (RES), responsável pela captura de nanopartículas de circulação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método, baseado na digestão com colagenase e centrifugação de densidade, é uma adaptação do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et ai. projetado para rato isolatio células do fígadon e proporciona um rendimento elevado (até 14 x 10 6 culas por ratinho) e de alta pureza (> 95%) das células de Kupffer. Este método de isolamento não requer equipamento sofisticado e caro e, por conseguinte, representa um compromisso ideal entre a complexidade e de rendimento celular. A utilização de ratos mais pesados ​​(35-45 g) melhora o rendimento do método de isolamento, mas também facilita notavelmente o procedimento de canulação da veia porta. A toxicidade de nanotubos de carbono funcionalizadas f -CNTs foi medido neste modelo pelo ensaio de LDH modificado. Este método avalia a viabilidade das células medindo a falta de integridade estrutural da membrana da célula de Kupffer, após incubação com -CNTs f. Toxicidade induzida pelo -CNTs f pode ser medido de forma consistente com este ensaio, destacando que as células de Kupffer isoladas são úteis para testes de toxicidade das nanopartículas. A compreensão global do nanotoxicology poderiam se beneficiar de tais modelos, tornando a seleção de nanopartículas para tradução clínica mais eficient.

Introdução

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O campo da pesquisa nanotoxicology tem como objetivo caracterizar o efeito biológico das nanopartículas. Estudos toxicológicos in vivo com base em investigações continuam a ser os métodos mais precisos. No entanto, seu uso é limitado pelo seu custo, trabalho e requisitos de tempo um. Como alternativas, em ensaios in vitro têm sido utilizados por causa da sua simplicidade e da possibilidade de desenvolvimento de alto rendimento em plataformas de ensaios in vitro, 2 - estendendo-se assim o número de condições testadas. A maioria dos estudos nanotoxicological são realizados utilizando ensaios in vitro com linhas de células imortalizadas. Contudo, existem preocupações em relação à extrapolação destes resultados experimentais in vivo para efeitos toxicológicos 3. Na verdade, as propriedades das linhas celulares imortalizadas pode ser significativamente diferentes dos tecidos que foram derivados a partir de, por exemplo, transformação genética 4, deterioração das características morfológicas principais5, perda da polaridade celular 6 e alterações funcionais, tais como a regulação de mediadores inflamatórios 7.

Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e estão em contacto directo com o sangue, forrando a parede de sinusóides do fígado. Como parte do sistema reticulo-endotelial (RES), estes macrófagos são responsáveis ​​para a captura de nanopartículas de circulação e, por conseguinte, constituir um modelo altamente adequado para estudar a toxicidade de nanopartículas. In vivo 8 9 e in vitro estudos de respostas inflamatórias associadas com as células de Kupffer expostos a nanopartículas ter sido publicado anteriormente. Células de Kupffer também foram envolvidos na patogênese de doenças do fígado, como a doença hepática alcoólica 10, 11 fibrose hepática ou hepatite viral 12. Foi relatado que células de Kupffer isolado fornecer indicações úteis para descrever os mecanismos celulares involved em perturbações do fígado 13,14.

Vários métodos têm sido relatados para isolar e purificar as células de Kupffer. Isolamento das células pode resultar de dissociação mecânica ou enzimática 15. Digestão de colagenase mostra a vantagem de conservar a integridade funcional das células de Kupffer, enquanto conduzindo a elevada produção de células de Kupffer 16. Muitas abordagens experimentais, que variam em complexidade e custos, foram usados ​​para separar células de Kupffer de outras populações de células de fígado. Por exemplo, células de Kupffer pureza pode ser conseguida por imunoafinidade 17, electroforese de fluxo 18, 16 a adesão selectiva ou por técnicas de centrífugas 16, que seleccionam as células de acordo com o seu tamanho e densidade. Uma combinação destes métodos podem ser escolhidos para aumentar a pureza da população 16. Não há consenso sobre o método ideal para o isolamento de células Kupffer, uma vez que na maior parte depende das aplicações e equipmen disponíveist. No entanto, no caso dos ensaios de toxicidade de nanopartículas, a simplicidade e elevado rendimento da técnica associada com a preservação funcional das células de Kupffer parecia ser mais adequado para esta aplicação.

O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método foi modificado a partir do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et al. 16 concebido para o isolamento de células de fígado de rato. A maioria dos estudos relatados e descrito o isolamento de células de Kupffer do fígado de ratos. Aqui, nós descrevemos um método para isolar as células de Kupffer do fígado de rato, com um rendimento elevado e pureza. A utilização de ratinhos reduz o custo experimento e permite o processamento de vários fígados para obter grandes quantidades de células de Kupffer para testes de toxicidade de nanopartículas.

No protocolo seguinte, as células de Kupffer foram incubadas com os nanotubos de carbono funcionalizadas (f -CNTs). As propriedades físico-químicas únicas de nanotubos de carbono - ou seja, alta proporção de comprimento para diâmetro e grande área superficial, fez CNT candidatos interessantes como vectores para fins de terapia e de diagnóstico. No entanto, têm surgido preocupações quanto à toxicidade dos nanotubos de carbono 19, e o desenvolvimento de novos ensaios in vitro destina-se a aumentar a compreensão das CNT efeito biológico. Toxicidade em células de Kupffer é associada com uma falta de integridade estrutural da membrana celular. Isto é medido pela perda da enzima LDH do citoplasma da célula para o sobrenadante. O princípio deste método é, portanto, para remover qualquer LDH libertada e medir o que é deixado nas células 20. Isto é feito, de preferência a medição do LDH libertado no sobrenadante, pois a presença de nanotubos de carbono no sobrenadante interfere com o ensaio de 21.

Propomos o uso deste eficaz meto Kupffer isolamento de células simples e de custod para isolar elevado número de células de Kupffer funcionais. Isto permite o rastreio de toxicidade de uma grande variedade de nanopartículas, num modelo relevante macrófagos primários.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes e regulamentos relevantes e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do regulamento escritório UK Home

1. Perfusão e Cobrança celular (Figura 1)

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Figura 1:. Perfusão do fígado Após anestesia do rato, o tracto digestivo está deslocado lateralmente para a esquerda do abdómen de modo a tornar a veia porta (VP) acessível. O PV é canulada usando uma taxa de fluxo lento (1-3 mL / min) de solução de EGTA / HBSS e a veia veina inferior (IVC) é rompido imediatamente para evitar qualquer excesso de pressão dentro do fígado. Dentro da primeira hora de perfusão, a taxa de fluxo é aumentada gradualmente até 7 ml / min. A solução de colagenase é então perfundido a 10 ml / min, até que a sua digestão completa seja alcançada.

  1. Prepare recém todos os reagentes descritos na tabela de material.
  2. Aquece-se a EGTA (etileno-glicol Tetra-ácido acético) / HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) de solução (50 ml por ratinho) e a solução de colagenase (100 ml por rato) durante 30 min a 40 ° C.
  3. Lavar a bomba de tubo flexível primeiro com etanol 70%. Pour 40 ml de EGTA / solução de HBSS para um tubo de centrífuga imerso no banho de água e lavar a tubagem flexível com bomba de pré-aquecida de EGTA / solução de HBSS.
  4. Realizar anestesia terminal usando um barbitúrico para produzir de forma confiável inconsciência antes que a depressão respiratória e morte. Injectar fenobarbitona a 1 mg / kg, ip num ratinho CD1 macho ou fêmea (35-45 g). Confirme a anestesia por beliscar dedo do pé.
  5. Raspar os pêlos abdominais e esterilizar a superfície abdominal utilizando uma solução de etanol a 70%.
  6. Cortar através da cavidade abdominal e expor a veia porta e veia cava inferior, movendo o intestino lateralmente para a esquerda do abdómen.
  7. Estrelat a bomba a uma velocidade de 1-3 ml / min com solução de EGTA / HBSS e canular a veia portal usando uma agulha de borboleta de 23 g (asas corte). Prender a secção da veia porta canulada com a agulha 23 G e em seguida virar a pinça serrefine na superfície do abdómen aberto rato. O fígado deve rapidamente pálido nos primeiros 30 segundos de EGTA / Solução HBSS perfusão.
  8. Rapidamente incisar a parte inferior da veia cava inferior para evitar a formação de excesso de pressão no fígado, e em seguida aumentar progressivamente o caudal de 7 ml / min, ao longo do primeiro minuto de perfusão. O animal morre devido a hemorragia secundária à da veia cava punção venosa.
  9. Quando menos de 5 ml de EGTA / Solução HBSS é remanescente no tubo de centrífuga, encha-o com solução de colagenase (40-50 ml). Aumentar a taxa de fluxo gradualmente para 10 ml / min, ao longo de 30 seg.
  10. Faça o swell fígado, aplicando pressão para a veia cava inferior, usando uma pinça, por 5-10 intervalos seg. This pode ser feito periodicamente (5-10 vezes durante a digestão). Este passo vai melhorar a dissociação das células do fígado e reduzir o tempo de perfusão com colagenase.
  11. Quando menos do que 10 ml de solução de colagenase permanece dentro do tubo de centrifugação, derrame 40-50 mL de solução pré-aquecida de colagenase no tubo de centrífuga.
  12. Após 10-15 min de perfusão e cerca de 70-80 ml de solução de colagenase perfundidos, aplicar uma pequena pressão sobre a superfície do fígado com uma pinça. Uma cópia da pressão indica que as células do fígado são dissociados.
  13. Remover o fígado a partir da cavidade abdominal como uma só peça e colocá-lo em um tubo de centrífuga contendo 20-30 ml de células de Kupffer de isolamento médio. Mantenha as células do fígado em gelo ou a 4 ° C por um período máximo de 3 horas para evitar que afetam a viabilidade das células do fígado.
  14. Repetir o procedimento de perfusão em vários animais, se necessário, ao mesmo tempo manter o fígado perfundido em gelo. Piscina 1-3 fígados para purificação e prosseguir com a fase 3.

2. Preparação do por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 2)

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Figura 2:. Preparação do gradiente de densidade Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. O SIP é preparado por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. A 5 ml de SIP são misturados com 15 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP são misturados com 10 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 50%. Um tubo de centrífuga contendo a solução de 50% de SIP (20 ml) é inclinada e a solução SIP 25% (20 ml) é adicionado lentamente, utilizando uma pipeta serológica 25 ml.

  1. Continue com as seguintes etapas (seção 2., 3. e 5.) sob condições estéreis e manter as células em gelo ou a 4 ° C. Prepara-se o SIP (Solução isotónica de partículas de sílica revestidas) por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS.
    2. Para fazer 20 ml de solução SIP 25%, mistura 5 ml de SIP com 15 ml de PBS. Para fazer 20 ml de solução SIP 50%, mistura de 10 ml de SIP com 10 ml de PBS.
  2. Encher um tubo de centrífuga com 20 ml de solução a 50% de SIP. Inclinar o tubo de centrifugação com um ângulo próximo de 90 ° e adiciona-se lentamente a solução SIP 25% (20 ml) na parede lateral do tubo utilizando uma pipeta de 25 ml serológico, sem tocar na superfície da camada de SIP 50%. Quando a adição da solução SIP 25%, reduzir progressivamente o ângulo do tubo. Manter o gradiente de densidade em gelo até à utilização.

3. Purificação de Kupffer celular (Figura 3)

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Figura 3:. Purificação de Kupfer células por centrifugação em gradiente de densidade e adesão celular Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. (A) após a ruptura da cápsula de Glisson, células do fígado são filtrados através de um 100 mm filtro. A suspensão é centrifugada a 50 x g para descartar hepatócitos (granulados) e recolher a fracção de células não-parenquimatosas (sobrenadante). Este passo é repetido três vezes. As células não-parenquimatosas são adicionadas no topo de um gradiente descontínuo isotónica e centrifugado a 800 xg durante 15 min. Células de Kupffer recolhidos a partir da almofada SIP 25% são purificados adicionalmente por selecção de adesão celular. (B) As células foram semeadas em placa de 24 poços e incubou-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 30 min. As células não aderentes são lavadas uma vez com 500 ul de HBSS. Células de Kupffer exibir a sua morfologia aderente 4 h após o plaqueamento, quando -CNTs f pode ser adicionado às células. A barra de escala representa 25 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Coloque um fígado perfundido em uma placa de Petri com 15 ml de Kupffer isolamento celular Médio. A ruptura da cápsula de Glisson (membrana do fígado), utilizando tesouras e libertar todas as células do fígado para o meio de isolamento de células de Kupffer. Filtrar a solução através de uma filtro de células 100 um a ser coletado em um tubo de centrífuga. Repita o procedimento de perfusão em fígados perfundidos adicionais e reunir as células no mesmo tubo de centrífuga (15 ml de um rato, até 45 ml de três ratos).
  2. Centrifugar a suspensão de células a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Células parenquimatosas (hepatócitos) será no sedimento e células não-parenquimatosas (incluindo células de Kupffer) será no sobrenadante.
  3. Recolhe-se o sobrenadante num tubo de centrífuga limpo e centrifuga-se a 50 x g durante 2 minutos cada. Repita este passo três vezes mais.
  4. Centrifugar a 1.350 xg durante 15 min para sedimentar as células não-parenquimatosas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de isolamento de células de Kupffer Médio.
  5. Adicionar a solução de células não-parenquimatosas sobre o gradiente descontínuo isotónica 25/50%, tal como descrito em 2.3. Centavorifuge a 850 g durante 15 min sem aceleração ou pausa.
  6. Localizar a fracção de célula de Kupffer enriquecido turvas na fracção SIP 25% nas proximidades da interface de SIP 25/50% (Figura 3). Utilizando uma pipeta de 10 mL serológico, aspirado de cerca de 12 ml da fracção de células enriquecida de Kupffer. Transferência de células para um tubo de centrífuga contendo 35-40 ml de isolamento de células de Kupffer meio. Misturar suavemente e centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as células.
  7. Descarte as células sobrenadante e ressuspender em 5-10 ml de pré-aquecido celular Kupffer Meio de Cultura. Contagem de células (hemocit�etro) e medir a viabilidade utilizando a coloração azul de tripano.
  8. Placa as células não-parenquimatosas purificados em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10 5 células / poço. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 (Figura 3). Após 30 min, remover suavemente o meio, lava-se com pré-aquecido Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS), em seguida, uma vez substituircom 500 ul de fresco e pré-aqueceu-se Meio de Cultura celular de Kupffer (por poço).
  9. Deixar as células de Kupffer durante pelo menos 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2 antes do tratamento com nanopartículas, para permitir que eles adquirem a sua morfologia aderente.

4. Caracterização

  1. As células Kupffer Pureza
    1. Preparar a solução de PBS / BSA fresca utilizada para manter a viabilidade das células de Kupffer. Lave as células uma vez com 500 ul de solução de PBS / BSA. Remover a solução de PBS / BSA e separar as células de Kupffer em 500 uL de solução de PBS / BSA fresco utilizando raspagem suave. Quando as células são plaqueadas em placas de 24 poços, encurtam as extremidades de lâminas de raspagem com uma tesoura para fazer a separação mais fácil de prosseguir. Transferência de células em tubos de citometria de fluxo.
    2. Contagem de células de Kupffer, utilizando um hemocitómetro e centrifuga-se 1 x 10 5 células a 1350 x g. Ressuspender as células de Kupffer em 30 ul de F4 / 80 anticorpo (puro). Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Manter as células não coradas (não incubadas com o anticorpo) em gelo.
    3. Adicionar 2 ml de solução de PBS / BSA em células coradas, centrifugar a 1350 g durante 5 min e desprezar o sobrenadante resultante. Ressuspender as células coradas em 200 ul de PBS / BSA.
    4. Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-1 canal.
    5. Repita o procedimento para as células de Kupffer manchadas mantendo as mesmas configurações utilizadas para a análise de citometria de fluxo de células de Kupffer não coradas. Escolher e quantificar a fluorescência de células coradas para avaliar a pureza de célula de Kupffer.
  2. Kupffer células fagocíticas Atividade
    1. Substituir meios com 0,5% (v / v) de partículas fluorescentes de Kupffer em meio de cultura celular e incubar durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
    2. A fim de remover os grânulos não-internalizados, centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, diScard o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de PBS / BSA. Repita este passo mais 2 vezes.
    3. Raspe células de Kupffer em 500 ul de células e de transferência de solução de PBS / BSA para um tubo de citometria de fluxo.
    4. Centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, descartar as células sobrenadante e ressuspender em 200 ul de PBS / BSA.
    5. Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-2 canais.

5. Incubação de Quimicamente nanotubos de carbono funcionalizados (f -CNTs)

  1. Prepara-se uma dispersão de -CNTs f (1 mg / ml) em água por sonicação durante 15 min antes da utilização. -CNTs F são preparados em casa 22.
  2. Prepare 2x CNTs concentrados f- dispersão em Kupffer meio de cultura celular. CNT f- sonicate dispersos em meio para2 min antes de prosseguir com o passo 5.3).
  3. Para cada bem, substituir 250 � de meio de idade com 250 ul de 2x dispersão -CNTs f. Poços não tratados (250 ul de meio condicionado + 250 ul de células de Kupffer fresco meio de cultura) e os poços tratados com 10% de DMSO são utilizados como controlo negativo e positivo, respectivamente.
  4. Incubar as células de Kupffer a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 ou 72 h.

6. Avaliação da Toxicidade -CNTs f em células de Kupffer pela lactato desidrogenase (LDH) Ensaio de modificação

  1. Desprezar o sobrenadante.
  2. Adicionar 200 uL (por poço da placa de 24 poços) de tampão de lise e incubar a 37 ° C durante 30 min-1 h.
  3. Após a realização de pipetagem vigorosa, recolher lisadas células de Kupffer em tubos de microcentrifugação e centrifugar a 40000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que foram absorvidos pelas células e os restos celulares.
  4. Recolher os sobrenadantes (ƒ-CNT livre) emmicrotubos e armazenar a -20 ° C ou vá para o passo 6.5).
  5. Transferir 50 ul numa placa de 96 cavidades e adicionar um volume igual da solução de mistura de substrato (kit de LDH) a cada poço. Cobrir a placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes da adição de 50 ul da solução de paragem (kit de LDH). Adicionar triplicados de poços em branco, contendo 50 ul de tampão de lise, 50 ul de solução de mistura de substrato e 50 ul de solução de paragem.
  6. Ler a absorvância a 490 nm num leitor de microplacas e utilizar a seguinte fórmula para calcular a (%) de viabilidade celular.

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Resultados

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O número de células não-parenquimatosas purificadas foi consistente e variou entre 8 e 14 x 10 6 culas por rato (17 isolamentos foram realizadas). Cada isolamento do mouse foi suficiente para a chapa 16-28 poços. A viabilidade das células por coloração com azul de tripano demonstrou a viabilidade das células ~ 95%. Células de Kupffer mostrou uma forma redonda dentro de 30 min de incubação a 37 ° C, relacionada com a sua morfologia aderente incompleta (Figura 4A). Às 4 horas de incubação e, po...

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Discussão

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Os passos seguintes são fundamentais para alcançar alta produtividade e alta viabilidade das células de Kupffer. Condições assépticas devem ser usadas para limitar o risco de contaminação bacteriana e fúngica. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes da utilização. Os reagentes devem ser preparadas antes de realizar o procedimento de isolamento.

A escolha de colagenase IV, com baixa atividade tríptico, é crucial. Lotes diferentes do mesmo fornecedor tem actividade enzimática difer...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo programa RADDEL da Rede Marie-Curie FP7-ITN da UE. MB e KAJ gostariam de agradecer a Joe Varguese e Rui Serra Maia por sua ajuda e sugestões ao longo da otimização do isolamento de células de Kupffer.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos CD1 euthatal (pentobarbital sódico)Merial
Charles River   -O peso do mouse deve variar de 35 a 45 g. Aconselhamos o uso de camundongos CD1 machos, pois seu peso aumenta rapidamente (por exemplo um camundongo CD1 macho de 7 semanas de idade excede 35 g de peso). Também é aconselhável entrar em contato com o fornecedor de animais com antecedência para providenciar a entrega de animais mais velhos. Alternativamente, os animais podem ser internos para atingir o peso desejado.
HBSS (Ca2+ e Mg2+ free, com bicarbonato)   Tecnologias de Vida   14175-053HBSS deve ser  Ca2+ grátis. 
Sal tetrassódico de ácido etilenoglicol tetracético (EGTA)Sigma-Aldrich   E8145   O EDTA também pode ser usado, mas o EGTA tem a vantagem de quelar Ca2+ seletivamente.
HEPES (1 M) Tecnologias de Vida   15630-056 100 ml 
Colagenase tipo IV Worthington CSL-4 É aconselhável testar diferentes lotes de colagenase ou pelo menos mencionar ao fornecedor que o produto deve ser adequado para isolamento de células hepáticas 
  DMEM de baixa glicoseSigma-Aldrich   D5523 500 ml 
RPMI (com piruvato de sódio e Glutamax) Tecnologias de Vida   12633-012500 ml
Penicilina/Steptomicina Tecnologias de Vida   15140-122Soro Fetal Bovino de 100 ml
 Primeiro link   60-00-850 500 ml 
Solução de azul de tripano Sigma-Aldrich T8154 100 ml 
Solução de partículas de sílica revestida (Percoll)GE Healtcare   17-0891-02 O Percoll® é muito estável e pode ser mantido por vários anos 
1x Solução salina tamponada com fosfato   Tecnologias de Vida   10010-023500 ml 
10x Fosfato Tampolado Salino   Tecnologias de Vida   70011-036500 ml
de dimetilsulfóxido FisherD/4120/PB08 500 ml 
Kit LDH (CytoTox 96) Promega G1781 Mantenha-se protegido da luz
DMEM vermelho de fenol livreLife Technologies   31053-028 500 ml 
Anticorpo F4/80 (Alexa 488)AbD SerotecMCA497A488Não diluir, usado puro para citometria de fluxo
Grânulos fluorescentesSigmaL2778Grânulos de látex, poliestireno modificado com amina, vermelho fluorescente. 1 ml
Nome do MaterialEmpresa Número de catálogo Comentários/Descrição 
Conjunto de coleta de sangue de borboleta (tubo de 23 G/305 mm de comprimento)   BD 
Filtros de Seringa (0,22 μ m Blue Rim) Minisart 16534-K 
Tubos de Centrífuga (50 ml Tampa Azul) BD Biosciences, Falcon35 2070 
Placa de Petri (90 x 15 mm) Thermo Fisher Scientific   BSN 101VR20 
100 μ Filtro de célula M   BD   352360
Bomba peristáltica Watson Marlow SciQ 300   Enxágue o tubo antes e depois de cada uso com PBS estéril e etanol a 70%.
Placas de 24 poçosCorning   3526
placas de 96 poços Corning   Centrífuga 3595
Eppendorf5810R
Leitor de placasBMG LabtechFLUOstar Omega
Serrefine fórcepsHammacher GmbH Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051A pinça serrefine permite pinçar o vaso canulado com a agulha 23 G sem a necessidade de segurar a pinça durante o procedimento de perfusão. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
Tubos de citometria de fluxoBD Biosciences, Falcon 
Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)Elkay  000-MICR-150
Raspador de célulasBD Biosciences, Falcon353086Corte as extremidades da lâmina com uma tesoura para raspar as células em placas de 24 poços.
Nome da empresa de reagentes Número de catálogo Comentários/Descrição 
  Solução EGTA (Ácido Etilenoglicol Tetracético)/HBSS (Solução Salina Balanceada de Hank) HBSS contendo 0,5 mM EGTA e 25 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,4. Prepare 50 ml para cada fígado perfundir.   
Solução de colagenaseDMEM baixa glicose contendo colagenase tipo IV a 100 UI/ml, HEPES 15 mM e Penicllin/Estreptamicina a 1% (v/v). Ajuste o pH para 7,4. Prepare 100 ml para cada fígado perfundir. Após a adição da colagenase, é aconselhável aquecer a solução por 30 min antes do uso. Isso permite que a atividade da colagenase seja ótima.
Meio de Isolamento de Células KupfferRPMI contendo, 1% de Aminoácidos Não Essenciais (v/v), 1% de glutamax® (v/v) e 1% de Penicllin/Estreptomicina (v/v). Prepare pelo menos 100 ml para 1-3 fígados.   
Meio de Cultura de Células KupfferRPMI contendo 10% de Soro Fetal Bovino, 1% de Aminoácidos Não Essenciais (v/v), 1% de Glutamax® (v/v) e 1% de Penicllin/Estreptamicina (v/v). Prepare pelo menos 100 ml para 1-3 fígados.   
SIP (solução de partículas de sílica revestidas isotônicas)Misture 1,7 ml de 10x Phosphate Buffered Saline com 15,3 ml de Percoll® para obter 17mL de SIP.
Solução SIP a 25%Misture 5 ml de SIP com 15 ml de 1x Solução salina tamponada com fosfato   
Solução SIP a 50%Misture 10 ml de SIP com 10 ml de 1x Solução salina tamponada com fosfato 
TampãoDMEM com 0,9% de Solução
PBS/BSAPrepare solução salina tamponada com fosfato fresco pH 7,4 com 1% de albumina de soro bovino. 
367288352052 de Lise Triton X-100

Referências

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