Modelos cirúrgicos de refluxo gastroesofágico com Ratos

Resumo

Este artigo demonstra procedimentos cirúrgicos de refluxo gastroesofágico com camundongos. Esses modelos são ferramentas úteis para pesquisa sobre mecanismos e tratamento da doença do refluxo gastroesofágico e potencialmente esôfago de Barrett e adenocarcinoma esofágico.

Resumo

Vários procedimentos cirúrgicos têm sido relatados como indutores de refluxo gastroesofágico em animais. Aqui, relatamos três modelos cirúrgicos com camundongos visando induzir refluxo de conteúdo gástrico, conteúdo duodenal ou conteúdos mistos. Procedimentos cirúrgicos e princípios gerais foram descritos em detalhes. Um pesquisador com experiência cirúrgica deve ser capaz de dominar a técnica após um curto período de prática. Após a cirurgia, a maioria dos camundongos pode sobreviver e desenvolver esofagite por refluxo semelhante à dos humanos. No entanto, deve-se notar que as diferenças histológicas entre o esôfago de camundongo e humano são as limitações inerentes desses modelos cirúrgicos. Se usados para pesquisa sobre esôfago de Barrett e adenocarcinoma, esses procedimentos podem precisar ser combinados com modificações genéticas.

Introdução

A doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) é uma doença crônica causada pela exposição prolongada do esôfago distal a conteúdo gástrico ou gastroduodenal¹. A exposição prolongada a esses refluxos nocivos prejudica as defesas intrínsecas dentro do epitélio esofágico e, portanto, resulta em esofagite². O esôfago de Barrett surge no contexto do refluxo crônico e é uma lesão pré-maligna com risco aumentado de adenocarcinoma esofágico^3,4. Apesar da importância clínica, os mecanismos da DRGE, do esôfago de Barrett e do adenocarcinoma não foram bem compreendidos.

Modelos animais são essenciais para a pesquisa sobre etiologia, patologia, mecanismos moleculares, prevenção e tratamento de doenças humanas. Até o momento, vários modelos animais de DRGE, esôfago de Barrett e adenocarcinoma foram desenvolvidos usando animais modelo^5,6. O esôfago do camundongo é revestido com epitélio escamoso estratificado que é histologicamente semelhante ao do esôfago humano. Embora o esôfago do camundongo seja diferente do esôfago humano em termos de queratinização e ausência de glândulas submucosas, o camundongo ainda é um modelo animal atraente devido ao seu custo relativamente baixo de manutenção e seu potencial de modificações genéticas sofisticadas. Duas abordagens são comumente usadas para modelar DRGE, esôfago de Barrett e adenocarcinoma em camundongos: cirurgia de refluxo e modificação genética. A cirurgia de refluxo é a melhor maneira de induzir refluxo e as modificações genéticas imitam alterações moleculares^5,7. A cirurgia de refluxo pode ser combinada com modificações genéticas para entender melhor os mecanismos da doença⁸.

Muitos procedimentos cirúrgicos foram relatados por nós e outros^6,9: (1) refluxo gástrico: ligadura pilórica, constrição pilórica com ligadura do estômago anterior, cardioplastia Wendel e anastomose esofagogástrica; (2) refluxo misto: anastomose esofagogastroduodenal, esofagoduodenostomia (ou esofageojejunostomia); (3) refluxo duodenal: anastomose esofagogastroduodenal mais gastrectomia; (4) refluxo de componentes químicos: refluxo biliar, refluxo pancreático, perfusão esofágica; e (5) transplante esofágico⁵. Recentemente, um modelo microcirúrgico em camundongos foi relatado para produzir refluxo jejunal via esofageojejunostomia com ímãs¹⁰. Esses modelos cirúrgicos têm vantagens sobre modelos de cultura celular in vitro ou modelos de cultura organóide. In vitro, as células esofágicas não toleram um meio com alta acidez ou altas concentrações de ácidos biliares. Ácidos biliares não conjugados, comumente usados para produzir mudanças nas células epiteliais esofágicas in vitro não estão geralmente presentes no refluxo duodenal in vivo. Assim, as conclusões tiradas de tais estudos in vitro devem ser tomadas com cautela.

A cirurgia no esôfago do camundongo continua sendo um desafio técnico devido ao seu tamanho pequeno. Uma baixa taxa de sobrevivência pós-operatória não permite experimentos que requerem certo tamanho de amostra para chegar a conclusões estatisticamente sólidas. No passado, desenvolvemos e caracterizamos com sucesso modelos cirúrgicos de refluxo gástrico, refluxo misto, refluxo duodenal com camundongos em experimentos de longo prazo^9,11,12. Também fornecemos consultoria a vários outros grupos em sua cirurgia em camundongos. Aqui, descrevemos três procedimentos cirúrgicos em camundongos para ajudar a comunidade a estabelecer esses modelos em seus laboratórios.

Protocolo

Todas as experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional.

1. Preparação do rato

1. Use camundongos mais ~ 20 g no peso corporal ou superiores a 6 semanas de idade para a cirurgia.
2. Antes da cirurgia, dar camundongos um laboratório de comida e água ad libitum e manter em um ciclo claro-escuro de 00:12 h.
3. Raspar a área cirúrgica com uma máquina de cortar cabelo. Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de 80 mg / kg de cetamina e 12 mg / kg de xilazina. Esta dose coloca ratos no sono em poucos minutos e fornece anestesia suficiente para os seguintes procedimentos cirúrgicos.
4. Confirme anesthetization adequada com base na ausência do reflexo corneal e retração membro quando a pata é comprimido. Aplicar lubrificante pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento.
5. Esterilizar a pele com solução de betadine.

2. Modelo refluxo gástrico (Figura 1B)

1. Realizar uma superiorincisão na linha média de ~ 2 cm a partir da xifóide apontando para o ânus.
2. Abra-se a cavidade abdominal através da linha média. Remova o xifóide para aumentar a exposição com um par de tesouras.
3. Separa-se e cortar os tecidos conjuntivos entre o fígado e o estômago. Ligadura e cortar o feixe vascular entre o baço e do fundo, a fim de completamente livre até o fundo.
4. Ligue o fundo ligeiramente para a esquerda e expor o lado esquerdo da junção gastro-esofágico no campo. Adicione uma incisão longitudinal de 5 mm no músculo distai ao longo do esófago utilizando um par de tesouras para expor o epitélio.
5. Corte aberto do epitélio ao longo da mesma direcção (incisão 1, Figura 1B). Adicione três incisões na pança de incisão (2, 3 e 4, Figura 1B) para eliminar a maioria da pança com uma tesoura afiada operacionais. Se o estômago não está vazio, remova cuidadosamente o conteúdo gástrico.
6. Coloque um Sutu prolene 8-0re (com um ponto de afunilamento agulha) através de um ponto (no esôfago) e ponto A '(na pança) com uma precisão de mucosa da mucosa oposição. De igual modo lugar suturas através do ponto b e Ponto b ', e outros pares de pontos, respectivamente. Uniformemente espaço estas suturas 3-4 mm uns dos outros.
7. Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal para limpar o sangue e o conteúdo gástrico. Feche a parede abdominal com fio de seda e pele com grampos metálicos.

3. Modelo de Refluxo mistos (Figura 1C)

1. Siga os passos 2.1 a 2.4 para expor a junção gastroesofágico.
2. Suavemente separar o lado dorsal do esófago a partir dos vasos sanguíneos por trás do esófago. Passe uma ponta de algodão pequena entre os vasos sanguíneos e esôfago.
   Nota: O algodão pode ser parcialmente removida a partir da ponta para reduzir o seu tamanho. Esta dica de algodão serve a dois propósitos, levantando o esôfago e proteger os vasos sanguíneos.
3. Faça inc dois cinco milímetros longitudinalisions cada na junção gastro-esofágico e a extremidade proximal do duodeno adjacente ao piloro com uma tesoura afiada operacionais. Para a incisão no duodeno, evitar vasos sanguíneos e coloque na fronteira anti-mesentérica.
4. Anastomosar as incisões com mucosa com precisão de mucosas oposição interrompidas 8-0 suturas de Prolene. Normalmente coloque 3-4 suturas na face dorsal e 2-3 suturas na parte da frente.
5. Retire a ponta de algodão. Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal e fechar a parede abdominal e a pele.

4. Modelo Duodenal refluxo (Figura 1D)

1. Siga o passo 3.1 a 3.4 para gerar misto de refluxo.
2. Com cuidado, levante o estômago para expor a sua parte de trás. Um lobo do fígado podem ser abrangidos pelo tecido conjuntivo entre o fígado e parte de trás do estômago. Corte cuidadosamente os tecidos conjuntivos, corretamente proteger o fígado, e expor os vasos sanguíneos no lado dorsal do esôfago.
3. Ligadura ecortar os vasos sanguíneos. Ligadura e cortado o esófago na junção gastroesofágico.
4. Ligar o duodeno no piloro. Ligadura e cortar o mesentério. Remover todo o estômago.
5. Lava-se a cavidade abdominal com solução salina normal. Fechar a parede abdominal e a pele.

5. O tratamento pós-cirúrgico

1. Após a cirurgia manter a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento. Só depois de recuperar decúbito esternal, coloque os ratos de volta com outros animais.
2. Dar antibióticos e analgésicos para prevenir a infecção e aliviar a dor. Injectar Baytril (10 mg / kg, ip, qd, durante 3 dias) para prevenir a infecção, e cloridrato de buprenorfina (0,05 mg / kg, sc, bid. Dois dias) como analgésico. O jejum não é necessário após a cirurgia.
   A dieta líquida ou mole pode ser dada.
3. Avaliar o estado de saúde geral sobre basis.If diários os ratos mostram os seguintes sinais (dramática perda de peso> 15%, a falta de appetite, vocalização, descarregar a partir da boca, nariz ou olhos, gesto curvado, inatividade, atividade aliciamento anormal), sacrificar os ratos.

Resultados

A maioria dos ratinhos (> 95%) pode sobreviver à cirurgia. Durante o período perioperatório, as principais causas de morte incluem overdose de anestésicos, sangramento e razões desconhecidas.

Quatro semanas após a cirurgia,> 90% de ratinhos com refluxo gástrico ou misto de refluxo e> 80% de ratinhos com refluxo duodenal podem sobreviver. Durante este período, os ratos morrem principalmente de estenose esofágica e incapacidade para comer. Estes ratos mostram sinais de estresse grave ...

Discussão

Vários modelos cirúrgicos foram criados para imitar gástrica, duodenal e misto de refluxo em roedores. Estes três procedimentos aqui descritos são adequados para experimentos de longo prazo com taxas razoáveis ​​de sobrevivência pós-operatória. Um pesquisador com experiência cirúrgica deve ser capaz de compreender a técnica, após um curto período de prática.

A hemorragia pode resultar de injecção intraperitoneal de anestésicos antes da cirurgia, laceração do fígado durante a separação dos te...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dumont #1 Forceps Dumostar Tip	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Clip Applying Forceps 5.5"	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Halsey Needle Holder 5" Smooth	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock.6 mm	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100	Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0	Ethicon US, LLC
Ringer's solution	Henry Schein, Inc.
ketamine	Henry Schein, Inc.
xylazine	Henry Schein, Inc.