Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Resumo

Roedores são um modelo apropriado para investigar os substratos moleculares do comportamento e transtornos psiquiátricos complexos. A microinjeção cerebral em roedores acordados pode ser usada para elucidar substratos de doenças. Um método de microinjeção cerebral eficiente e personalizável, bem como a execução de um paradigma operante que quantifica a motivação, é apresentado.

Resumo

A microinjeção cerebral pode ajudar na elucidação dos substratos moleculares de comportamentos complexos, como a motivação. Para esse fim, os roedores podem servir como modelos apropriados, em parte porque a resposta a estímulos comportamentalmente relevantes e os resultados de estímulo-ação de análise de circuitos são surpreendentemente semelhantes entre humanos e roedores. Ao estudar substratos moleculares de comportamentos complexos, a microinjeção de reagentes que modificam, aumentam ou silenciam sistemas específicos é uma técnica inestimável. No entanto, é crucial que o local da microinjeção seja direcionado com precisão para auxiliar na interpretação dos resultados. Apresentamos um método para a fabricação de implementos cirúrgicos e agulhas de microinjeção que permite microinjeção precisa e personalização ilimitada com custo mínimo. É importante ressaltar que essa técnica pode ser concluída com sucesso em roedores acordados se conduzida em conjunto com outros artigos JoVE que cobriram os procedimentos cirúrgicos necessários. Além disso, existem muitos paradigmas comportamentais que são adequados para medir a motivação. A razão progressiva é um método comumente usado que quantifica a eficácia de um reforçador para manter a resposta, apesar de uma necessidade de trabalho (muitas vezes exponencialmente) crescente. Este ensaio é sensível à magnitude do reforçador e às manipulações farmacológicas, o que permite determinar a eficácia e/ou motivação do reforço. Também apresentamos uma abordagem direta para programar o software operante para acomodar um cronograma de reforço de proporção progressiva.

Introdução

Roedores e humanos respondem de maneiras notavelmente semelhantes a estímulos comportamentalmente relevantes^1-3. Isso sugere que os roedores são sujeitos apropriados para elucidar os substratos moleculares do comportamento e condições psiquiátricas complexas⁴. Compreender os substratos moleculares de processos comportamentais complexos, como a motivação, freqüentemente requer microinjeção cerebral. Tanto a técnica de microinjeção cerebral quanto um ensaio de motivação primária serão apresentados aqui. Ratos serão usados como cobaias, mas esses procedimentos podem ser prontamente adaptados a camundongos bem manuseados. Estão incluídos aqui os procedimentos para a fabricação das cânulas, obturadores (cânulas ou estiletes fictícios) e microinjetores necessários. O método apresentado é significativamente mais flexível e mais econômico do que os implementos pré-fabricados. Essa flexibilidade será valiosa ao otimizar as condições. É importante ressaltar porque o procedimento de microinjeção pode ser usado para testar uma infinidade de hipóteses; As técnicas aqui apresentadas devem ser amplamente aplicáveis. Por exemplo, ligantes de receptores podem ser microinjetados para entender a neuroquímica^3,5,6; peptídeos permeáveis a células e pequenas moléculas podem ser microinjetados para entender as vias de sinalização intracelular^7-10; toxinas, bloqueadores de canais iônicos ou coquetéis antagonistas podem ser microinjetados para entender os circuitos^1,11,12.

Embora o protocolo genérico apresentado aqui possa ser prontamente adaptado pelo usuário para suas necessidades específicas, o procedimento é particularmente adequado para ensaios comportamentais, uma vez que a microinjeção ocorre em roedores acordados que estão apenas sob leve restrição das mãos. Nenhuma anestesia ou restrições especiais são necessárias. Isso é possível porque o próprio cérebro não tem sensação de dor. No entanto, se a anestesia não for usada, a microinjeção deve ocorrer através de cânulas previamente implantadas estereotaxicamente. Isso ocorre porque os nociceptores estão presentes no couro cabeludo, as ^meninges,13 que são as membranas que envolvem o cérebro, e o periósteo,14 que é a membrana que cobre o crânio. Deve-se notar que a microinjeção sob anestesia às vezes é desejável. Um exemplo é quando o vírus está sendo injetado, e pode-se querer injetar o vírus diretamente através de agulhas de aço inoxidável¹⁵ ou pipetas de vidro, porque isso pode reduzir o dano tecidual e melhorar a eficiência da transdução. ^16,17 Os microinjetores descritos abaixo podem ser modificados para esse fim e sugestões sobre como fazer isso podem ser encontradas na Discussão. Como outros artigos do JoVE demonstraram implante de cânula cerebral ^{estereotáxica,18-20} esses procedimentos não serão abordados aqui.

Apresentamos esses procedimentos de microinjeção juntamente com um ensaio que quantifica a motivação. Vários modelos de comportamento motivado de roedores estão atualmente em uso, como a caixa da pista e a escalada de barreira. Aqui, descrevemos como usar um esquema de reforço de razão progressiva operante para quantificar a motivação onde a resposta operante está sendo mantida por um reforçador. Responder na proporção progressiva responde à magnitude do reforçador. ^21,22 Assim, este ensaio é rotineiramente usado como um proxy para motivação e/ou reforço da eficácia. ^21,23-30 Como várias revisões excelentes cobriram esse tópico em ^{detalhes,21,24} vamos nos concentrar principalmente em questões práticas.

Protocolo

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Virginia Commonwealth University e aderir ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação de Implementos antes da cirurgia e Microinjection

1. Configure para a preparação de material:
   1. Obter 26 G um tubo de cânula, 33 G fio obturador, 33 G agulha microinjeção tubulação, tubos microinjector plástico (PE20 ou equivalente), dois peso médio hemostats retas, fita de laboratório, régua, caneta permanente, etanol 70% (v / v), de armazenamento frascos para injectáveis ​​(por exemplo, 20 ml de cintilação de vidro), super-cola, pequenos barcos de pesar, e ferramenta rotativa equipada com um disco de corte dever não-pesado.
      Nota: Protegendo a ferramenta rotativa a uma caixa de ponta da pipeta usando tiras ou fita é útil, uma vez que eleva a ferramenta. Usar óculos de protecção é importante para evitar danos ao utilizar uma ferramenta rotativa.
   2. Anexe um pedaçode laboratório ou fita autoclave para o banco.
2. Preparação de cânulas:
   Nota: Pelo menos duas cânulas são necessários por rato por uma injecção bilateral. Uma cânula adicional vai ser utilizado num passo mais tarde.
   1. Adquirir uma secção de um tubo de cânula de comprimento suficiente para evitar a dobragem durante o processo de marcação e de corte.
   2. Desenhar uma linha de referência 15 milímetros na fita a partir do passo 1.1.2 usando uma caneta de ponta fina. Isto irá servir como um guia para a marcação de secções sequenciais de 15 mm, para a tubulação usando um marcador permanente afiado.
   3. Toque a um tubo de cânula, em pontos marcados, para o disco rotativo de corte lenta da ferramenta rotativa, de modo a entalhar a tubagem. Girar a cânula 180˚ e entalhar o lado oposto da tubagem. Não corte através do tubo completamente, porque pode levar à oclusão.
   4. Acentuadamente dobrar o tubo, a fim de dividi-lo em seções ~ 15 mm.
   5. Segure cada extremidade cortada da cânula perpendicular ao cut-offdisco entre o polegar eo indicador. Girar o tubo de cânula ao tocar a ponta para a grande superfície dianteira do disco de corte (isto é, não a borda). Isso irá gerar uma ponta arredondada. Nota: Não dobre a cânula, para que poderia render uma injeção off-site.
   6. Resma de ambas as extremidades da cânula com uma agulha 26 G chanfrada (Brown cubo) para assegurar que todas as rebarbas foram removidos e que a cânula é desobstruída.
   7. Passe uma amostra de corte do fio do obturador para ~ 35 mm através da cânula de corte para verificar se não existem obstáculos internos.
   8. Pegue cada cânula usando individualmente hemostats Unclamped e medir cada cânula concluída com uma régua para garantir que ele é exatamente 14 milímetros de comprimento.
3. Preparação de obturadores:
   1. Aperte uma cânula com aproximadamente metade do comprimento com peso médio, hemostats retas. Coloque a pinça hemostática bloqueado no banco. A cânula deve ser perpendicular ao banco.
      Nota: Esta cânulanão deve ser utilizado em cirurgia depois de ser mantido por hemostáticos bloqueados, uma vez que é provável dobrada.
   2. De alimentação uma extremidade do fio de obturador para dentro da cânula até que ele tenha atingido o banco. Rejeição do fio na cânula para garantir que uma rebarba não está impedindo-a de alcançar o banco;. Ou seja, atingir a parte inferior da cânula. Comprimento obturador adequada irá evitar o entupimento e cicatrização do tecido adicional.
   3. Dobre o fio apertando com os dedos até que um ângulo de 30˚ ~ é conseguido mantendo contato entre o obturador e do banco. Certifique-se que o ângulo da curva é tal que estabelece nivelada com a tampa da cabeça, eo excesso virado para a frente, tornando mais difícil para o rato para remover.
   4. Remova o fio do cânulas e corte a parte superior em ~ 2,5 mm a partir da curva com pequenas cortadores diagonais (cortadores de arame).
      Nota: Pelo menos dois obturadores será necessário por rato por uma injecção bilateral, uma vez que cada cânula implantada requer um obturador. Criarum meio caminho ~ 35˚ curva adicional através do obturador também ajuda na prevenção de remoção pelo animal. Armazenar tanto as cânulas e os obturadores em frascos separados (por exemplo., De 20 ml de cintilação de vidro) contendo 70% de etanol (v / v) até à sua utilização, mas, pelo menos, S / N.
4. Preparação e ensaio de microinjectores:
   1. Obter um pedaço de microinjector agulha tubulação que é ~ 1 m de comprimento.
   2. Segure uma das extremidades do tubo microinjector perpendicularmente com hemostats retas bloqueados.
   3. Torça a pinça hemostática, mantendo a tensão na tubagem de bobina lo firmemente em torno da pinça hemostática, pelo menos, uma vez.
   4. Medir 32 mm a partir da frente, ponta solta do tubo microinjector e de entender este ponto perpendicularmente com uma segunda linha reta, pinça hemostática peso médio e bloqueá-los. Agarrar a tubagem microinjector com pinças hemostáticas no lado de 32 mm mais próximo de marcar a extremidade solta, em vez de no lado mais próximo da pinça hemostática com fio enrolado.
   5. Bend o tubo e para trás ao mesmo tempo manter a tensão no tubo até que se rompe.
      Nota: A única, acentuada curva ascendente e descendente irá produzir uma pausa sem corte, o que é desejável para assegurar que a micro-injecção ocorre na região do cérebro desejado.
   6. Inspecione a tubulação microinjector para garantir que ambas as extremidades são retas e que o diâmetro interno é desobstruída.
   7. Adquirir um tubo de cânula, que será usado para a fabricação de um colar microinjetor.
   8. Medir e marcar seqüenciais seções 5 mm de um tubo de cânula usando um marcador permanente e uma linha de referência 5 milímetros desenhado em fita (passo 1.1.2).
      Nota: Cada microinjector requer um colar. Colares são simplesmente curto cânulas aderiu ao fio microinjector.
   9. Toque em um tubo de cânula, em pontos marcados, para o disco giratório cut-off lento da ferramenta rotativa, a fim de entalhar a tubulação. Girar a cânula 180˚ e entalhar o lado oposto da tubagem. Cortar completamente podem ocluir a tubagem.
   10. Nitidamentecurvatura tubulação colar microinjector, a fim de dividi-lo em seções ~ 5 mm.
   11. Ream o diâmetro interior de ambas as extremidades do colar com uma agulha 26 G chanfrada (Brown cubo) para garantir que a maioria das rebarbas foram removidos. Algumas pequenas rebarbas vai pegar o fio microinjector e, assim, ajudar na colagem.
   12. Deslize um colar para cada tubo microinjector ~ 2 cm a partir do final.
   13. Criar uma pequena piscina de super-cola no canto de um pequeno barco pesar.
   14. Use sucata cânula tubos cortados em ~ 25 mm para aplicar uma pequena quantidade de super-cola ao tubo microinjetor ~ 5 mm a partir de uma extremidade. Em seguida, deslizar o colar sobre este cordão super-cola para que fique ~ 1 mm a partir da extremidade do tubo de microinjecção. Cubra as duas extremidades do colar com cola.
       Nota: Evite um grande acúmulo de super-cola na gola, uma vez que irá impedir que o tubo de plástico de vedação em torno do microinjector. Embora seja importante para evitar super-cola sobre a extremidade aberta do tubo microinjetor, como isso vai fazero microinjector inutilizável, isto também é importante para fazer deslizar a gola tão perto do final quanto possível para minimizar o volume de vazio (não-injectado).
   15. Inclinar a microinjetor concluída no lado de fora de um outro pequeno barco pesar com o lado do colar-se e deixa-se secar durante 24 horas.
   16. Obter uma ~ 8 cm pedaço de tubo de plástico microinjector (PE20 ou equivalente), 1 ml de uma seringa cheia de água estéril, e 26 L de agulha biselada (hub castanho).
   17. Coloque uma agulha 26 G (hub marrom) na seringa e deslize o tubo de corte para a agulha, assegurando para não perfurar o tubo.
   18. Deslize a tubulação de plástico sobre o fim colarinho da seca, microinjector completa.
   19. Esprema o êmbolo da seringa cheia de água para testar a permeabilidade.
       Nota: A água deve pulverizar muito longe e em linha reta para fora da ponta microinjector. Se o fluxo não é reto, o local da injecção não será correto. A fonte de um spray de lado ou difusa é um pobre pausa (passo 1.4.5). A microinjector não devet ser usado se o jacto para os lados ou é difusa. Solução salina não deve ser utilizado, uma vez que poderia entupir o microinjector ou agulha.
   20. Puxe a seringa para trás, a fim de remover a água do microinjector. Guarde em um recipiente selado, seco, por exemplo, a 20 ml frasco de cintilação de vidro.
       Nota: microinjectores podem ser autoclavados após o fabrico, com a maioria das colas de super, ³¹ mas isso deve ser determinada empiricamente. Técnicas de esterilização alternativos incluem óxido de etileno e irradiação gama.

2. preparação e realização Microinjeções

1. Obter microinjetores concluídas, tubos microinjetor plástico (PE20 ou equivalente), a bomba de micro-injecção, duas pequenas pesar barcos, água esterilizada, etanol a 70% (v / v), acetona, duas seringas estanque 1 ul de vidro com uma agulha romba (25 g), algodão derrubou aplicadores de madeira, peças obturadores, seringa de 1 ml, 26 G (hub marrom) da agulha, as pequenas pinças curvas (estilo # 7 é recomendado), e laboratório wipês.
2. Preparando microinjetores para injecção:
   1. Curvatura concluída microinjector 15 mm a partir da extremidade oposta ao colar de modo que o ângulo entre os dois é ~ 95˚.
      Nota: A localização curva precisa é um imperativo para localização de injeção precisas. Usando uma pinça # 7 (ou similar) para pegar o microinjector e dobra para cima é útil. Sempre re-medir o comprimento antes de realizar microinjeções.
   2. Corte a tubulação plástica (PE20) para ~ 70 cm e deslizar sobre colarinho microinjector.
      Nota: A adição de tiras de fita para um tubo de plástico perto tanto a microinjector e ponta solta é útil quando completar injeções, especialmente quando se injecta duas soluções diferentes. As divisórias não são recomendados para os dois tubos que se tornam complicado durante a injecção.
3. Preparando bomba para microinjeções:
   1. Ligue bomba.
   2. Definir diâmetro de agulha microinjeção, taxa de infusão desejado, e alvo volume de injeção.
      Nota: A infusão de ratoe volume de injecção e é dependente exigências experimentais. Este é elaborada na discussão. Algumas bombas têm mesas seringa pré-carregada. Se não, uma mesa de seringa pode ser encontrada no site da fabricação (s).
   3. Defina o modo de bomba para "Volume" para que um volume preciso é entregue automaticamente. Se o modo 'bomba' é selecionado em vez disso, o experimentador deve interromper manualmente a bomba.
   4. Ajustar o recuo da bomba para permitir que a seringa para encher o volume de injecção para além de um adicional de 0,2 mL.
4. Prepara a seringa microinjeção e microinjector para injecção:
   1. Bloqueie cada seringa microinjeção gastight no rack da bomba de microinjeção.
   2. Colocar a ponta da seringa estanque aos gases na água estéril contida num pequeno barco pesar e agitar suavemente o êmbolo para lubrificar o fio interno. Uniformemente puxar o êmbolo para o recuo na bomba para encher com água.
   3. Deslize a tubulação PE20 que é connected para o microinjector (no passo 2.2) para uma agulha 26 G (hub marrom) ligada a uma seringa de 1 ml, que é enchido com água esterilizada. Spray de água estéril através do microinjector, e inspecionar padrão de pulverização e à distância.
      Nota: A água deve pulverizar muito longe e em linha reta para fora da ponta microinjector. Se o fluxo não é reto, o local da injecção não será correto.
   4. Coloque a microinjetor esterilizado para um campo esterilizado.
   5. Deslize o tubo para fora da agulha, mantendo o tubo microinjetor vertical para impedir o gotejamento de água para fora ao mesmo tempo que o corte do tubo por baixo da área danificada pela agulha.
   6. Empurrar o êmbolo da seringa para a frente para microinjecção ligeiramente criar uma gota sobre a extremidade da agulha e deslizar o tubo PE20 cheio de água (que é ligado ao microinjetor) para a agulha.
      Nota: Isto irá criar uma conexão líquido-líquido que permitirá contrapressão apropriado que poderia desalojar uma obstrução que poderia formar aa ponta do microinjetor.
   7. Empurre o êmbolo completamente para a frente para se preparar para o carregamento da amostra e garantir que nenhum traço de etanol permanece no microinjector.
   8. Verifique a configuração para vazamentos tocando a gota de água que se formou na ponta da microinjector a um laboratório limpo limpe várias vezes.
5. Nota: Ao tocar para o laboratório de limpar, apenas uma mancha molhada devem formar. Se houver mais gotas, existe uma fuga no sistema.
6. Evite vazamentos através do controlo de aplicação de cola super (Passo 1.4.14) e aparando a tubulação PE20 com uma tesoura afiada ou uma lâmina de barbear em qualquer altura que a tubulação PE20 é removido a partir de qualquer conexão. Além disso, repita os passos 2.4.3 através de 2.4.8 para corrigir o vazamento.
7. Puxe o êmbolo da seringa para trás 0,2 ul; a criação de uma bolha entre a água esterilizada no tubo PE20 / microinjetor e a solução a ser injectada.
8. Nota: Esta bolha evita a diluição do produto de injecção, a contaminação da água, e permitepara controlo do processo de injecção uma vez que irá mover-se durante a injecção. Uma única bolha, sólido deve ser produzido. Se ele está quebrado, um vazamento está presente ou a ponta microinjector é ocluído; indicando que passo 2.4.8 (ea nota de acompanhamento) deve ser repetido.
9. Colocar o microinjector para o reagente a ser injectado lentamente e puxar o êmbolo da seringa para o recuo.
10. Preparando animal para a injecção:
11. Segure o peito do rato contra o peito do experimentador. Limpar a área em torno de cânulas com um aplicador de algodão embebido em etanol a 70% (v / v).
12. Nota: Com o tratamento adequado, os ratos podem ser suavemente contido em uma mão em concha. Caso contrário, pode ser necessário scruffing.
13. Remover obturadores usando pequenas pinças e lugar para pesar barco com 70% de etanol (v / v).
14. Execução de injeções:
15. Coloque microinjetor cheia (passo 2.4.10) em cânula. Pressione o botão start na bomba de microinjeção e movimento bolha monitor.
16. Nota: may ser necessário aplicar uma leve pressão para garantir que microinjetores não levante. A bolha (formado no passo 2.4.9) deve avançar de maneira uniforme e entrar plenamente no microinjector.
17. Remover os microinjectores a partir da cânula e substituir obturadores, uma vez que a injecção está completa e o período pós-injecção difusão passou.
18. Nota: Os tempos de difusão de pós-injeção típicos são 2-4 min para reagentes farmacológicos, e 2-10 min de vírus. Deixando o microinjector durante o período de perfusão pós impede o injectado a partir do refluxo de volta até a cânulas em vez de difusão para o tecido. Coloque obturadores no lado do barco cheio de etanol pesar para permitir que o etanol para drenar antes reinserindo em cânula.

3. pós-injeção Clean Up

1. Obter um pequeno frasco de cada um: água esterilizada, etanol 70% e acetona.
2. Limpeza microinjector e microinjecção seringa:
   1. Remover seringa de vidros a partir da cremalheira da bomba de seringa e a tubagem microinjecção de seringa de vidro.
   2. Tubulação microinjector Desligar da seringa de vidro e anexar uma seringa de 1 ml preenchido com água esterilizada para a tubulação microinjector através de uma agulha de 26 G (hub marrom). Empurre a 1 ml êmbolo da seringa para a frente para expulsar ~ 0,3 ml. Em seguida, toque na ponta do microinjector a um laboratório-limpe e puxar o ar de volta através do microinjector.
      Nota: O microinjector e tubulação pode ser re-utilizado para experimentos similares, se for considerado prudente.
   3. Coloque a seringa da agulha de vidro em água estéril e desenhar êmbolo totalmente para trás. Em seguida, empurre o êmbolo totalmente para frente para liberar. Toque a ponta da seringa de vidro de um laboratório de limpar para garantir que nenhum líquido permanece.
   4. Repetir o passo 3.2.3, com água estéril, ar, 70% de EtOH, acetona e na seguinte ordem: água estéril, água estéril, ar, ar, 70% de EtOH, 70% de EtOH, ar, ar, acetona, acetona, ar, ar. A execução de todas essas etapas de limpeza vai ajudar a preservar a seringa microinjeção.
   5. Coloque a seringa (s) microinjector em embalagem e puxar o êmbolo para trás a 0.05 l.
      Nota: Isto é importante, pois permite que o êmbolo para ser puxado ou empurrado a fim de desalojar um êmbolo preso que pode ocorrer no caso de qualquer depósitos de sal formar após o armazenamento.

4. Programação de Motivação Assay

1. Faça o login no Estado gráfico com credenciais de administrador.
2. Selecionar ou criar banco de dados relevante.
3. Criação de esquema de razão reforço progressivo:
   1. Seleccione Lists> Listas de nível de banco de Eventos> Listas de Transição parâmetro.
   2. Selecione 'Adicionar'. Digite o número apropriado lista (L #) e descrição.
   3. Selecione 'Adicionar Eventos'.
   4. Digite o primeiro valor esquema de reforço e selecione "Adicionar". Repita.
      Nota: Os valores podem ser determinados por meio de uma fórmula em que o esquema de razão progressiva = 5e ^{(J * (reforçador ganhou + 1))} -5 ^7.A fim de adaptar esta equação para testar a hipótese adequadamente, o valor J deve ser determinada empiricamente ou obtido a partir da literatura.
   5. Selecione 'In Order' dentro da caixa de "Ordem Selection '.
   6. Selecione 'Hold Valor = a: ____ "dentro da caixa" quando concluído'. Digite o valor esquema de reforço na caixa de texto que excede em muito esperado responder. Este será o esforço necessário para todas as entradas subsequentes uma vez que a lista tenha sido esgotada.
4. Criando um protocolo experimental:
   Nota: Estado Graphic move o assunto através de uma série de estados que são encerradas com base no tempo ou critérios de desempenho. Defina todos os sinais e parâmetros discretos e contextuais marcadas abaixo como '$' para testar adequadamente a hipótese em exame.
   1. Selecione Arquivo> Criar Experiment protocolo.
   2. Digite o número do protocolo desejado e descrição na caixa de texto adequado.
   Selecione 'Criação Estado ».
5. Defina todos os estímulos, tanto para o 'RDY - Estado Ready' e 'FIN - estado acabado'.
6. Selecione Estado Novo e nomeá-la 'S2 - PR responder.
7. Selecione Estado Novo e nomeá-la 'S3 -. Reinforcer PR e Cue "
8. Selecione Estado Novo e nomeá-la 'S4 - Timeout ".
9. Destaque 'S1' e nomeá-la 'S1 - Habituação.'
   1. Selecione Adicionar 'Time To Go.'
   2. Digite momento apropriado ($) e as unidades ($), por exemplo., Minutos e selecione 'S2' do S caixa suspensa TO. Foi determinado quando o banco de dados foi criado inicialmente o tempo de "unidades" de unidade.
      Nota: O tempo de transição criado deve ler semelhante ao [Após $ minutos GO P = 100%, A S2] Figura 1 é um exemplo deste evento, uma vez criado.

Figura 1. exemplo de programação Representante # 1. Neste caso um estado delimitado tempo é ilustrada em que um valor definido pelo usuário de US $, mostrado aqui em minutos, indica quando o estado atual deve sair para o estado 2 (S2).

9. Destaque 'S2 - PR responder.
   1. Selecione Add 'Evento Go To. "
   2. Digite o nome da lista que contém o esquema de razão progressiva que foi criado na etapa 4.3 na primeira caixa de texto como L $ (por exemplo, L1), selecione o operandum adequado (por exemplo., Alavanca ou nariz puxão) da primeira caixa suspensa, e selecione ' S3 'da TO S caixa suspensa.
      Nota: O evento criado pode ler semelhante ao [IF L $ 1 - Ativo GO P = 100%, TO S3]. O identificador 1 - ativo foi designado durante a criação do banco de dados. Aqui, 1 - Ativoestá se referindo ao operandum ligado a um interruptor.
   3. Selecione 'Adicionar Tempo Go To. "
   4. Marque a caixa "R", digite o tempo e as unidades adequadas ($), e selecione 'FIN' de TO S caixa suspensa.
      Nota: O evento de tempo criado pode ler semelhante ao [R (marcada) se $ minutos GO P = 100%, TO FIN]. Isso irá garantir que a sessão será encerrada se não houver nenhuma atividade em que operandum após o limite definido;. Ou seja, a sessão será interrompida depois que o animal retém responder no operandum emparelhado-reforçador para o período de tempo definido.
   5. Selecione Add 'Evento Go To. "
   6. Marque a caixa "R", digite 1 na primeira caixa de texto, selecione a liberação de operandum apropriado da primeira caixa suspensa, e selecione 'S2' do S caixa suspensa TO.
      Nota: O evento criado pode ler semelhante ao [R (marcada) Após $ [1] Ativo GO P = 100%, A S2]. Essa etapa assegura que após a libertação do operandum(indicado por colchetes acima), que o Estado está reentrou, redefinindo, assim, o limite de tempo limite de sessão (4.4.9.4). Neste ponto, o Estado vai sair quando a relação progressiva contida na lista é completada (Passo 4.4.9.2) ou a sessão expira (Passo 4.4.9.4). Assim, toda vez que o operandum é ativado, ele conta para a relação progressiva. . E, cada vez que o operandum é inativado, por exemplo, a alavanca é liberado ou o puxão nariz é encerrado, o limite de tempo limite de sessão (Passo 4.4.9.4) é reposto Figura 2 representa todas as transições programadas para 'S2 - PR Respondendo.. '

Figura 2. Representante programação exemplo # 2. Aqui, o estado é encerrado mediante qualquer um dos dois critérios. L $ é o esquema de razão progressiva criado na etapa 4.3. Após a programação completion, o Estado sai para o estado 3 (S3). Note-se que este critério não tem um R, que permite o agendamento para avançar ao invés de começar de novo em cada reentrada para este estado. O estado também pode sair depois de minutos "$" para indicar FIN. Este é o limite de tempo limite pré-determinado após o qual a sessão será cancelada caso não responder ocorre dentro desta janela. Isto é explicado mais detalhadamente na discussão. Por último, o limite de tempo limite da sessão é redefinir sobre cada lançamento operandum. Assim, "[1] 'indica liberação do operandum' 1 '.

9. Destaque 'S3 - PR Reinforcer e Cue.
   1. Selecione 'Adicionar Tempo Go To'
   2. Digite o tempo e as unidades apropriadas para entregar o reforçador ($), e selecione 'S4' do S caixa suspensa TO.
      Nota: O evento de tempo criado pode ler semelhante ao [Após $ segundos GO P = 100%, a S4].
10. Destaque 'S4 - Timeout ".
    Selecione Adicionar 'Time To Go'
11. Digite o tempo e as unidades adequadas para permanecer em um estado inativo ($) após a entrega reforçador, e selecione 'S2' do S caixa suspensa TO.
    Nota: O evento de tempo criado pode ler semelhante ao [Após $ segundos GO P = 100%, A S2]. Estado 'S4 - Timeout' pode não ser necessária para todos os projetos.

Estados selecionados determinação.
Nota: Este protocolo está agora pronto para ser executado.

Resultados

Aqui, ilustramos exemplos de resultados que podem ser obtidos com o processo acima descrito. É mostrada uma primeira área que é típico transfectadas por vectores virais (Figura 3). Em geral, um volume de ~ 1 transfectadas mm ³ é obtido em tecido estriado. O volume da região transfectadas pode ser quantificada através de secções em série e utilizando o método de Cavalieri ³² importante notar que o volume de transfectada depende de muitos factores tais como o tipo de tecido a ser transfectada.; serotipo viral; promotor; taxa e volume injetado; número de partículas injetados; injectado pH; e se os reagentes hiperosmolar, tais como manitol, foram usadas. ^33,34 Tipicamente, nós microinject 10 ¹² partículas / ml, 1 ml / min ao longo de 10 laterais, e permitir que 7 minutos adicionais antes de substituir os obturadores. Além disso, o produto de injecção é geralmente cerca de pH 8. Em seguida, mostra-se que a motivação pode ser manipulada por qualquer expressão do transgene (Figura 4)ou microinjecção reagente farmacológico (Figura 5).

Na Figura 4, que expressa um receptor Designer Exclusivamente ativado por Designer Drugs (DREADDs). A região codificadora do receptor DREADD foi seguido por um local de entrada de ribossoma interno e uma cassete mCitrine. O mCitrine permite a visualização conveniente de células transfectadas. O DREADD foi acoplado à proteína G heterotrimérica Gαq. A activação do DREADD Gαq acoplado pode estimular astrócitos, ^28,35 e o próprio DREADD pode ser activado pela administração sistémica de clozapina-N-óxido (CNO, 3 mg / kg, ip). Os ratos foram treinados ^14,22,36 para alavanca de responder para reforço de etanol, onde 3 prensas alavanca rendeu uma chance de beber durante o dia 1 sessões de RH mais de 60 dias contíguos. Em seguida, os ratos foram forçados a abstinência, e DREADDs Gαq acoplados foram expressos em astrócitos núcleo accumbens do núcleo. Após três semanas de abstinência, a motivação para a auto-admi Nister etanol foi medida por ponto de interrupção. ^21,27-30 A activação de astrócitos do núcleo accumbens do núcleo, pela administração sistémica CNO, diminuiu a motivação para recomeçar os ratos de etanol auto-administração após a abstinência em relação ao veículo. É importante ressaltar que a CNO não teve nenhum efeito em uma coorte igualmente treinados que estava expressando Proteína Fluorescente Verde em vez do DREADD.

Figura 3. Representante região do estriado ventral transfectada pelo vírus microinjectados. Esta imagem ilustra a região de núcleo accumbens astrócitos que foram transfectadas, seguindo o método acima. Os dados são reproduzidos a partir de Bull et al. ¹³ com a permissão do detentor dos direitos autorais. Detalhes podem ser encontrados na publicação e que o material complementar de acompanhamento.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. A motivação dos ratos para auto-administrar o etanol foi reduzido por activação de um transgene que era sobre-expresso no núcleo accumbens astrócitos do núcleo. O vírus foi microinjectado motivação e medido através de um ponto de interrupção após permitindo semana para o vírus para expressar. O transgene foi expresso um Designer Receptor Exclusivamente ativado por Designer Drugs (DREADDs). Uma ANOVA one-way (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), seguido de um teste post-hoc de Scheffé revelou que a activação do DREADD por administração sistémica de clozapina-N-óxido (CNO, 3 mg / kg, ip ) reduziu significativamente a motivação dos ratos para auto-administrar etanol após a abstinência em relação ao veículo CNO não teve qualquer efeito na formação de uma coorte que foi igualmente que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) em vez do DREADD. Os dados são reproduzidos a partir de Bull et al. ¹³ com a permissão do detentor dos direitos autorais. Detalhes podem ser encontrados na publicação e que o material complementar de acompanhamento.

Figura 5. A microinjecção de bloqueadores de junções de hiato aumentou a motivação dos ratos para auto-administrar etanol após a abstinência dois bloqueadores de junções de hiato foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a motivação (medido através do ponto de interrupção) de ratos para auto-administrar etanol:. Mefloquina e 18- ácido (18-α) -a-glicirretínico. A two-way ANOVA revelou que a microinjeção de bloqueadores de gap-junction no núcleo accumbens do núcleo aumentou a motivação dos ratos para auto-administrar etanol após a abstinência (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Os dados são reproduzidos a partir de Bull et al. ¹³ com a permissão do detentor dos direitos autorais. Detalhes podem ser encontrados na publicação e queo material suplementar que acompanha.

Discussão

O procedimento apresentado aqui é um meio eficiente para a fabricação de cânulas microinjeção e microinjetores que irão auxiliar na elucidação dos substratos moleculares do comportamento motivado. Este método oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, pela fabricação dos próprios implantes e microinjetores, novos parâmetros experimentais podem ser rapidamente otimizado, ou seja, a pessoa não precisa esperar por componentes personalizados feitos para chegar. Em segundo lugar, devido ao pequeno diâmetro da cânula, mais cânulas pode ser implantado em simultâneo. Isto encurta o tempo necessário cirúrgico, o que pode melhorar a capacidade de sobrevivência, e também permite que múltiplos implantes por animal. Em terceiro lugar, o software utilizado para controlar as câmaras operantes acomoda prontamente horários razão progressiva desde um paradigma proporção fixa pode ser rapidamente convertido em uma proporção paradigma progressiva, simplesmente aplicando uma lista de parâmetros do evento de transição que contém o esquema de reforço desejado.

Seramplamente útil, um processo de microinjecção genérico que foi apresentada deve ser amplamente aplicáveis ​​para a microinjecção de quase qualquer reagente que está disponível. Conseqüentemente, prevemos que esta técnica vai continuar a ser de utilidade alta semelhante no futuro, com pequenas modificações. Por mudando apenas algumas variáveis, esta abordagem pode ser aplicada a uma grande número de reagentes. Os parâmetros que normalmente seriam manipuladas incluem a extensão a que se projecta a partir de microinjector da cânula, o volume de injecção, e taxa de injecção. Por exemplo, pode-se desejar que o injector ainda mais a projectar-se a partir da ponta da cânula para evitar cicatriz glial que tipicamente se forma em torno implantes crónicas. Além disso, pode-se desejar injectar um volume maior. Para microinjections vírus do estriado, num volume de 1 mL é tipicamente utilizado e este volume é tipicamente injectado ao longo de um período mais longo de tempo (frequência 7 - 10 min + 3 - 10 min de tempo de difusão adicional) em comparação com a utilizaçãod para reagentes farmacológicos (tipicamente 0,3 - 0,5 mL durante 2 - 3 minutos mais 1 - 3 minutos de tempo de difusão adicional). O usuário deve consultar a literatura e / ou empiricamente determinar os parâmetros mais adequados para suas necessidades. Independentemente disso, o sucesso deste procedimento é criticamente dependente de variáveis ​​4: 1) o comprimento da cânula, 2) comprimento microinjetor, 3) a qualidade do padrão de pulverização microinjetor, e 4) a integridade do sistema, antes da injecção. Porque microinjecção localização é dependente da profundidade que o microinjector se projecta a partir da cânula, é imperativo que ambas as cânulas (Passo 1.2.8) e comprimento de microinjector (pós-flexão, Passo 2.2.1) são ambos precisamente conhecida e uniforme entre todos os sujeitos . Isso pode ser facilmente controlado pelo prontamente rejeitando qualquer aplicação que não é o comprimento necessário na final re-medição. Além disso, o local de injecção só pode ser prevista, se ele ocorre imediatamente abaixo da cânula guia. Assim, qualquer que microinjector corças não pulverizar uma corrente longa, muito bem em testes (Passos 2.4.6) deve ser rejeitado. Uma injecção de qualidade também está relacionada com a integridade do sistema, antes da injecção. Se depois de dispensar toda a água do injector (antes do enchimento com o reagente) múltiplos pontos são observados em laboratório-limpe, em seguida, um vazamento precisa ser remediado (Nota sobre Passo 2.4.8). Além disso, se a bolha (Passo 2.4.9) que separa o fármaco a partir da água na tubagem PE20 não é uma, única bolha (depois de encher o microinjector com reagente), em seguida, o injector está parcialmente obstruído. Esta obstrução pode prevenir ou desviar a injeção. Isso também pode ser facilmente remediado (Nota sobre a etapa 2.4.8).

Se um deseja microinject enquanto o animal está no quadro estereotáxico há três alternativas. Em primeiro lugar, pode-se aumentar o comprimento do colar microinjetor tal que pode ser segurado firmemente pelo manipulador estereotáxico e também estender o suficiente para permitir a ligação ao tubo de PE20. Em segundo lugar, sobreE pode temporalmente implantar uma cânula e usar o microinjector padrão aqui apresentada. Em terceiro lugar, pode-se usar pipetas de vidro polido e desenhado ^16,17.

Uma limitação significativa do procedimento apresentado aqui é que ele é melhor realizado em ratos bem tratadas que estão familiarizados com o procedimento. Os ratos utilizados para os dados descritos na seção de resultados necessário nenhum procedimento de manuseio especial porque o mesmo investigador manipulados os ratos diariamente por mais de 2 meses. Isto incluiu a observação diária e manipulação do implante cirúrgico durante pelo menos 2 semanas. No entanto, os ratos podem ser rapidamente habituam por um número de técnicas que são usadas para antes do ensaio de inibição de pré-pulso, que pode ser afectada pelo stress. Estas técnicas especiais de habituação foram bem detalhados anteriormente. ⁴³ Em adição a estes procedimentos, é aconselhável que os ratos se habituam ao procedimento microinjecção onde microinjetores encurtadas são utilizados duanel injeções 'falsos'. Durante estas injecções simuladas, é crítico que o microinjector não sobressair para o tecido, a fim de limitar os danos de tecidos. Em outras palavras, o microinjector deve ser não mais do que 14 mm dobrado. Assim, a habituação completa necessária para uma aplicação óptima desta técnica pode ser visto como uma limitação.

Embora existam vários paradigmas comportamentais para medir a motivação, o rácio progressiva é comumente usado para quantificar o esforço que o assunto está disposta a exercer para obter um reforçador. A proporção paradigma progressiva produz uma medida conhecida como ponto de interrupção, o que é muitas vezes definida como o número máximo de pressões da alavanca na última relação concluída;.. Isto é, ²¹ máxima de responder que gerado um reforçador A razão progressiva é sensível à reforçador magnitude. Por exemplo, superior a cocaína (ou sacarose) doses produzir um ponto de interrupção superior e inferior cocaína (ou sacarose) doses produzir um breakp menoroint. ^21,22 Assim, breakpoint é um proxy usado rotineiramente para a motivação e / ou reforçar a eficácia. ^21,23-26 Porque a intenção de o ponto de interrupção é determinar quando o animal pára de responder, um parâmetro importante do paradigma razão progressiva é duração da sessão. Comprimentos sessão finitos pode colocar uma falsa cap em valores de ponto de interrupção e isso pode ser exacerbado pela pré-tratamentos que diminuem de forma anormal a taxa de auto-administração ou que a pausa aumento de pós-reforço. Este confundem pode ser superada por qualquer número de abordagens;.. Por exemplo, as sessões que terminam quando o animal tenha retido responder por algum múltiplo do intervalo médio inter-infusão ⁴⁴ Uma variante mais comumente aplicado dessa abordagem é para encerrar sessões uma vez de responder tem foi retido por algum valor determinado empiricamente que se mantém constante entre os indivíduos. Nós fornecemos o método a aplicar esta abordagem no Passo 4.4.9.11.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de cânula	Amazon Supply / Peças pequenas	HTXX-26T-60	26 G, Hipotubo S / S 316-TW 26GA
Obturador	Amazon Supply / Peças pequenas	GWXX-0080-30-05	33 gauge, Fio S / S 316LVM 0,008 IN
Microinjetor Fio	MicroGroup	33RW 304	33 gauge
Super Cola	Loctite	3924AC	Líquido, Não-gel, pode ser autoclavado
Tubo de plástico microinjetor	Becton Dickson	427406	PE20
Hemostáticos de peso médio	World Precision Instruments	501241-G
Régua	Fisher	09-016	150 mm
# 7 Armazenamento de fórceps		52100-77	Dumont, Dumostar
Ferramenta Rotativa	Dremmel	285	de duas velocidades
	McMaster Bomba de Microinjeção Carr	3602	15/16" x 0.025"
	Harvard Apparatus	PhD 2000
1 ul Seringa de Vidro	Hamilton	7001KH	Estilo da Agulha: 25s/2.75"/3
Aplicador com Ponta de Algodão	Toalhetes de Laboratório Fisher	23-400-101
	Kimwipes	34133
Software Operante	Coulbourn	Câmaras
	Coulborun	Habitest