As técnicas apresentadas para colheita, canulação e perfusão hepática usando nosso dispositivo proprietário permitem configurações sofisticadas de perfusão para melhorar os experimentos de descelularização e recelularização em fígados de ratos.
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Artigo de método
Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão
Neste artigo
Resumo
Resumo
A descelularização e recelularização de órgãos parenquimatosos podem permitir a geração de órgãos funcionais in vitro, e vários protocolos para descelularização hepática de roedores já foram publicados. Nosso objetivo foi melhorar o processo de descelularização por meio da construção de um dispositivo de perfusão proprietário que permitisse a perfusão seletiva através da veia porta e/ou da artéria hepática. Além disso, procuramos realizar a perfusão sob condições de pressão oscilante circundante para melhorar a homogeneidade da descelularização. A homogeneidade da descelularização da perfusão tem sido um fator subestimado até o momento. Durante a descelularização, as áreas dentro do órgão que são mal perfundidas ainda podem conter células, enquanto a matriz extracelular (MEC) em áreas bem perfundidas já pode ser afetada por detergentes alcalinos. As mudanças de pressão oscilante podem imitar as mudanças de pressão intra-abdominal que ocorrem durante a respiração para otimizar a microperfusão dentro do fígado. No estudo aqui apresentado, matrizes hepáticas de ratos descelularizadas foram analisadas por coloração histológica, análise de conteúdo de DNA e fundição por corrosão. A perfusão pela artéria hepática mostrou resultados mais homogêneos do que a perfusão venosa portal. A aplicação de condições de pressão oscilante melhorou a eficácia da descelularização da perfusão. Os fígados perfundidos através da artéria hepática e sob condições de pressão oscilante apresentaram os melhores resultados. As técnicas apresentadas para colheita, canulação e perfusão hepática usando nosso dispositivo proprietário permitem configurações sofisticadas de perfusão para melhorar os experimentos de descelularização e recelularização em fígados de ratos.
Introdução
Descelularização e recelularização pode permitir a geração de órgãos funcionais, transplantáveis in vitro 1. Ao remover as células e material antigénico (por exemplo., ADN, epítopos alfa-Gal) de um órgão, a matriz extracelular ou menos não-imunogénico (ECM) pode ser obtido. Esta matriz conserva a microanatomy tridimensional de um órgão e podem servir como a biomatriz ideal para o repovoamento com células de uma origem diferente, possivelmente xenogénico 2. Assim, uma matriz de fígado de rato descelularizado poderia ser repovoada com células de fígado humano. Este micro-fígado humanizado poderia servir como um modelo ex vi....
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Protocolo
Os animais foram mantidos no Centro de Medicina Experimental (FEM, Charité, de Berlim, Alemanha), e todos os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Secretaria de Estado da Saúde e Assuntos Locais (LAGeSo, Berlim, Alemanha; Reg. No. 0365 O / 11).
Colheita 1. Fígado
- Preparação pré-cirúrgica
- Use uma placa de cortiça para fixação. Coloque uma cortina médico sobre a placa. Usando quatro agulhas, fixar uma máscara de inalação na placa de cortiça para narcose intraoperatória inalação.
- Prearrangement do Portal venosa cânula
- Conecte-se um cateter venoso periférico (G 20) a uma torn....
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Resultados
A homogeneidade e, assim, a eficácia de diferentes protocolos de decelularização foram avaliadas por observação macroscópica, análise histológica e análise do conteúdo de ADN permanecendo dentro do fígado descelularizados matrizes. Além disso, a carcaça corrosão foi realizada para visualizar a microanatomia intacta de fígados após a descelularização.
Macroscopia
Durante decellularization, fígados tornar Lucent, indicando a remoção de conteúdo celular. Fígados per.......
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Discussão
Embora a técnica apresentada para a colheita de fígado de rato e descelularização é facilmente reprodutível, existem certos passos críticos a serem considerados:
Durante a preparação para a colheita do fígado, é importante para evitar o sangramento grave, porque ele vai activar a coagulação do sangue e podem conduzir à formação de coágulos sanguíneos dentro do fígado. Em nossa opinião, é vantajoso entalhar a aorta abdominal directamente antes da canulação da veia porta, para evitar fluxo de .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens e Katharina Struecker por sua ajuda durante este projeto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cânula arterial autoconstruída | |||
| Tubulação de Polietileno Não Estéril Portex | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0.28 mm ID 0.61 mm OD& |
| nbsp; Tubo de polietileno não estéril Portex | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58 mm ID 0,96 mm |
| OD Venodrop Cateter borboleta seguro | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| cânula de veia portal | |||
| Cateter Venoso Periférico | BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| Torneira de três vias | smiths medical | 888-101RE | |
| Hecht-Assistent | 4302 | Almofadas | |
| algodão | Curativo cirúrgico Shaoxing Zhengde | 13H118-03 | |
| Atadura de gaze | Hubei Haige Instrumentos Médicos | 14388 | |
| Solução de campainha | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000 ml |
| 10 ml Seringa | Braun | 4606108V | 10 ml / Luer Solo |
| 5 ml Seringa | Braun | 4606061V | 5 ml / Luer Solo |
| Sutura (Seda 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| campo médico | Shaoxing Zhengde Curativo cirúrgico | D0613011 | |
| surgical porta-agulha para instrumentos | |||
| Geuder | 17570 | ||
| microfórceps | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-tesoura | Martin | 11-740-11 | |
| micro-pinça | S& T | ||
| Clamp | Aesculap | BH111R | |
| tesoura | F S T | 14501-14 | |
| pinça cirúrgica | Aesculap | BD 557 | |
| Respirador de Descelularização | |||
| Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST | |
| Dispositivo de Perfusão | Charite, laboratório de engenharia médica | dispositivo personalizado dispositivo de | descelularização |
| bomba peristáltica ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | de 4 canais |
| Extensão Heidelberger 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA segmento de bomba | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| Tubo de 2 paradas CA | Armadilha | BPT NSF-51 | |
| item | |||
| Conector de mangueira Luer Lock | Neolab | No. 02-1887 | |
| Detergentes | |||
| Pellets SDS | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.1 | 10 L |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| coloração | |||
| Eosin 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxilina | AppliChem | A4840 | |
| coloração gomori | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS coloração Morphisto | 11388 | ||
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
Referências
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials
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Reimpressões e permissões
