Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

Resumo

As técnicas apresentadas para colheita, canulação e perfusão hepática usando nosso dispositivo proprietário permitem configurações sofisticadas de perfusão para melhorar os experimentos de descelularização e recelularização em fígados de ratos.

Resumo

A descelularização e recelularização de órgãos parenquimatosos podem permitir a geração de órgãos funcionais in vitro, e vários protocolos para descelularização hepática de roedores já foram publicados. Nosso objetivo foi melhorar o processo de descelularização por meio da construção de um dispositivo de perfusão proprietário que permitisse a perfusão seletiva através da veia porta e/ou da artéria hepática. Além disso, procuramos realizar a perfusão sob condições de pressão oscilante circundante para melhorar a homogeneidade da descelularização. A homogeneidade da descelularização da perfusão tem sido um fator subestimado até o momento. Durante a descelularização, as áreas dentro do órgão que são mal perfundidas ainda podem conter células, enquanto a matriz extracelular (MEC) em áreas bem perfundidas já pode ser afetada por detergentes alcalinos. As mudanças de pressão oscilante podem imitar as mudanças de pressão intra-abdominal que ocorrem durante a respiração para otimizar a microperfusão dentro do fígado. No estudo aqui apresentado, matrizes hepáticas de ratos descelularizadas foram analisadas por coloração histológica, análise de conteúdo de DNA e fundição por corrosão. A perfusão pela artéria hepática mostrou resultados mais homogêneos do que a perfusão venosa portal. A aplicação de condições de pressão oscilante melhorou a eficácia da descelularização da perfusão. Os fígados perfundidos através da artéria hepática e sob condições de pressão oscilante apresentaram os melhores resultados. As técnicas apresentadas para colheita, canulação e perfusão hepática usando nosso dispositivo proprietário permitem configurações sofisticadas de perfusão para melhorar os experimentos de descelularização e recelularização em fígados de ratos.

Introdução

Descelularização e recelularização pode permitir a geração de órgãos funcionais, transplantáveis ​​in vitro ^1. Ao remover as células e material antigénico (por exemplo., ADN, epítopos alfa-Gal) de um órgão, a matriz extracelular ou menos não-imunogénico (ECM) pode ser obtido. Esta matriz conserva a microanatomy tridimensional de um órgão e podem servir como a biomatriz ideal para o repovoamento com células de uma origem diferente, possivelmente xenogénico ^2. Assim, uma matriz de fígado de rato descelularizado poderia ser repovoada com células de fígado humano. Este micro-fígado humanizado poderia servir como um modelo ex vivo para a pesquisa sobre doenças (por exemplo., Doenças metabólicas, doenças virais inatos ou neoplasias) ou para testes pré-clínicos farmacêutica ^3.

Vários protocolos diferentes para perfusão de fígado de rato decellularization já foram publicados ^4-13. Em todos os protocolos, decellularção foi conseguida por perfusão de detergentes iónicos ou não-iónicos alcalinas através da veia portal canulada. Para o melhor de nosso conhecimento, fomos o primeiro grupo a relatar rato decellularization fígado por perfusão seletiva através da veia portal e / ou o rato artéria hepática ^14. Activar a perfusão selectiva dos diferentes sistemas vasculares no fígado pode permitir melhores resultados decelularização e, além disso, podem desempenhar um papel importante no repovoamento celular.

No estudo detalhado aqui, fígados foram perfundidos em um dispositivo de perfusão proprietária feitos sob medida, permitindo a perfusão sob condições de pressão oscilantes. Estas condições de pressão imitar a perfusão fisiológica respiratória dependente do fígado: in situ, o fígado paira sob a cópula do diafragma, cujo movimento durante a respiração tem um impacto direto sobre a perfusão hepática. Inspiração conduz especificamente a redução do diafragma e apertando do fígado, optimizandosaída hepato-venoso, enquanto que leva a expiração do fígado elevação e abaixamento da pressão intra-abdominal para optimizar o fluxo venoso ^portal-15.

O nosso objectivo foi avaliar se a condições de pressão oscilante tem um impacto sobre a homogeneidade de fígado de rato descelularização perfusão intra-abdominais, imitando as condições ex vivo. A homogeneidade do processo de descelularização pode ser um fator subestimado na perfusão descelularização. Todos os agentes conhecidos utilizado para a descelularização fígado provocam alterações nas ECM. Células em áreas mal perfundidos permanecer dentro da ECM, ao passo que outras áreas já estão completamente descelularizados. Para se dissolver as células restantes, a duração ou a pressão de perfusão deve ser elevada, fazendo com que mais alterações às áreas bem perfundidos. Assim, detergentes para a descelularização deve ser distribuído de forma homogénea dentro do órgão.

Protocolo

Os animais foram mantidos no Centro de Medicina Experimental (FEM, Charité, de Berlim, Alemanha), e todos os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Secretaria de Estado da Saúde e Assuntos Locais (LAGeSo, Berlim, Alemanha; Reg. No. 0365 O / 11).

Colheita 1. Fígado

1. Preparação pré-cirúrgica
   1. Use uma placa de cortiça para fixação. Coloque uma cortina médico sobre a placa. Usando quatro agulhas, fixar uma máscara de inalação na placa de cortiça para narcose intraoperatória inalação.
2. Prearrangement do Portal venosa cânula
   1. Conecte-se um cateter venoso periférico (G 20) a uma torneira de três vias. O cateter venoso deve ser cortado obliquamente, com um comprimento de aprox. 1,5 cm.
   2. De-ar do sistema usando uma seringa de 10 ml cheia com solução de Ringer. É muito importante para cuidadosamente-air de embolia gasosa, porque pode afetar negativamente o decellularization perfusão.
3. Prearrangementda cânula arterial
   1. Usar uma cânula borboleta e cortar a agulha com um comprimento de 5 mm. Instale um tubo de 5 centímetros (ID 0,58 milímetros; OD 0,96 milímetros) para a agulha 5 mm e corrigi-lo com supercola. Inserir um tubo 2 cm de comprimento (ID 0,28 milímetros; OD 0,61 milímetros) para dentro do tubo maior e corrigi-lo com supercola.
   2. Deslizamento outro tubo sobre essa construção como um pilar e corrigi-lo com supercola. De-ar da cânula arterial com uma seringa de 5 ml cheio com solução de Ringer.
4. Anestesia e Analgesia
   1. Induzir narcose do rato na câmara de indução da anestesia de 3,5% de isoflurano em oxigénio a um caudal de 1,5 L / min.
   2. Para assegurar a analgesia segura durante a operação, metamizol injectar (100 mg / kg de massa corporal) e a cetamina em dose baixa / medetomidina (10 mg / 0,1 mg por kg de massa corporal) por via intraperitoneal.
   3. Fornecer 1,5% de isoflurano em 1 L / min de oxigênio via máscara de inalação para posterior manutenção da anestesia cirúrgica.
5. Arranjos pré-operatórios
   1. Raspar o abdômen liberalmente com uma máquina de corte elétrica. Humedecer o local da incisão no abdómen rapado com etanol a 70% para desinfecção.
   2. Colocar o animal em decúbito dorsal sobre a placa preparado, insira a cabeça para dentro da máscara de inalação e corrigir os membros com fita adesiva médica e pinos. Retire o excesso de etanol e de pele com uma compressa de gaze.
6. Avaliação anestesia
   1. Avaliar a profundidade da anestesia, observando a freqüência respiratória. Quando a anestesia parece suficientemente profundo (40-60 respirações / min), verifique se a analgesia é suficiente, tentando provocar o reflexo toe pitada usando uma pinça cirúrgica para comprimir a pele entre os dedos de ambas as patas traseiras.
7. Abordagem abdominal
   1. Adicione uma incisão mediana na parede abdominal caudal acima da bexiga. Cortar a partir deste ponto para ambos os arcos hipocôndrios de uma maneira em forma de V. Tome cuidado para não cortar o diafragma. Puxe a parede abdominal corte sobre o peito.
   Fixar o xifóide com uma braçadeira Overholt, puxe-cranial e corrigi-lo com um elástico. Use cotonetes molhados para evacuar o intestino. Enrole intestino em uma atadura de gaze molhada. Além disso, cobrir todas as margens abdominais com compressas húmidas.
8. Preparação fígado
   1. Dissecar o ligamento falciforme. Use uma atadura de gaze molhada para manter os lobos hepáticos medial e cranial esquerda sob a cúpula do diafragma. Expor o ligamento hepatoduodenal eo lóbulo do fígado omental superior.
   2. Use duas micropinças e tesoura primavera para dissecar cuidadosamente o ligamento anexado ao lobo omental superior até que o lobo é móvel. Mova o lobo usando cotonetes molhados sob a compressa de gaze, segurando os lobos medial e deixados no local.
   3. Depois de mobilização do lóbulo do fígado omental superior, passar do estômago para a esquerda. Fixar o estômago com uma braçadeira e dissecar o omento menor com micropinças e os tesoura primavera.
   4. Mobilizar a omentos menorl lóbulo do fígado até que ele é móvel e, posteriormente, mover o lobo de volta em sua cavidade. Usar uma braçadeira Backhaus para reter o duodeno. Mover o duodeno para a esquerda para esticar e expor o ligamento hepatoduodenal. Circunscrever o ducto biliar comum no ligamento hepatoduodenal esticado.
   5. Dissecar o ducto biliar do tecido adiposo e no pâncreas. Corte o ducto biliar 1,5 cm do bifurcação do ducto biliar. Dissecar a veia porta a partir do tecido adiposo circundante. Expor a veia gastroduodenal.
   6. Ligadura da veia gastroduodenal duas vezes com seda 6-0 e dividir a veia entre as duas ligaduras. Dissecar o tronco celíaco e da artéria hepática comum do tecido circundante até que todos rami arterial são revelados.
   7. Libertar a artéria gastroduodenal a partir do tecido circundante. Ate a artéria gastroduodenal duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes um do outro. Dissecção da artéria gastroduodenal entre as duas ligaduras.
   8. Libere a artéria esplênicaa partir do tecido circundante. Amarre a artéria esplênica duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes uns dos outros. Dissecção da artéria esplênica entre as duas ligaduras.
   9. Libertar a artéria gástrica esquerda a partir do tecido circundante. Amarre a artéria gástrica esquerda duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes uns dos outros. Dissecção da artéria entre as duas ligaduras.
   10. Circunscrever a veia cava inferior entre o rim direito e no lobo hepático lateral direito. Dissecar a veia do espaço retroperitoneal. Expor a aorta, seguindo o tronco celíaco.
   11. Dissecar o tecido adiposo retroperitoneal. Injectar 1000 IE de heparina em 1 ml de solução salina na veia cava inferior. Retrair a cânula e fechar a incisão com um algodão. Espera 1-2 min para o efeito sistémico de heparina.
   12. Circunscrever a aorta com uma pinça. Dissecar a aorta e desangrar o rato. Além disso, dissecar a veia cava inferior distalmente a partir do rim.
9. Portal venoso Canulação (Use a cânula preparada na secção 1.2)
   1. Faça uma incisão na boca peixe na veia portal distal. Abra a incisão com uma pinça e canular a veia porta. Lave o fígado com 20 ml de solução de Ringer até os descolore fígado e fixar a cânula com ligaduras de seda (6-0).
10. A canulação arterial (Use a cânula preparada no ponto 1.3)
    1. Dissecar a aorta acima do tronco celíaco. Libere o segmento de aorta a partir do espaço retroperitoneal. Corte o segmento de aorta longitudinalmente para gerar um remendo aórtico. Insira a cânula auto-construído em um suporte estático.
    2. Use uma pinça para deslizar 2 a correção da aorta através da cânula. Ligadura da artéria hepática com seda 6-0 sobre a cânula e corrigir o patch no pilar.
11. Explantation fígado
    1. Abra o diafragma, fazer uma incisão circular e dissecar o fígado a partir das estruturas circundantes.
12. Armazenamento
    1. Store o fígado num tanque estéril de 500 ml cheio com 350 ml de solução de Ringer até à sua utilização.

2. As soluções de detergentes

1. Solução Triton X-100 estoque 10%
   1. Encha uma garrafa de 1000 ml com 900 ml água destilada. e adiciona-se 100 ml de Triton X-100 (99,9%). Usar um agitador para dissolver o Triton X-100. Encha a garrafa com água destilada. até um volume total de 1000 ml foi atingido.
2. 1% de Triton X-100
   1. Adiciona-se 100 ml da solução de reserva (10%) a um frasco de 1000 ml. Adicionar 900 ml de água destilada. e agitar o frasco duas vezes. Filtra-se a solução a 1% de Triton X-100 através de um filtro estéril.
3. SDS a 10% da Solução
   1. Encha uma garrafa de 1000 ml com 900 ml água destilada. e adicionar 66,99 g de SDS (99,9%, densidade 0,67). Usar um agitador para dissolver o SDS. Encha a garrafa com água destilada. até um volume total de 1000 ml foi atingido.
4. SDS a 1%
   1. Adiciona-se 100 ml da solução de reserva (10%) de um bot de 1000 mlTLE. Adicionar 900 ml de água destilada. e agitar o frasco duas vezes. Filtra-se a solução de SDS a 1%, através de um filtro estéril.

3. Decelularização

1. Set-up de Perfusão Dispositivo

Figura 1:. Esquema do aparelho de perfusão para a Seletiva Arterial e Venoso Portal Perfusão de quatro fígados de rato sob oscilantes Condições Pressão (. Modificado a partir Struecker et al ¹⁴⁾

1. Vincular o dreno para uma torneira de três vias e uma extensão Heidelberger para regular o nível de preenchimento e preencha o reactor com 500 ml de NaCl 0,9%.
   

Figura 2:. Esquema da perfusão set-up Ligar a câmara de perfusão (1,400 centímetros ³⁾ (1) à extremidade distai (4) do borbulhador (5) através do acesso venoso portal (2) ou por meio da ac arterialcesso (3). O borbulhador (5) deve ser equipado com uma obturação (4), na extremidade distai e uma abertura (6). Ligue o borbulhador (5) para uma extensão de Heidelberger (7). Ligar a extensão Heidelberger para o segmento de bomba (8). Além disso, ligar o segmento de bomba (8) para o outro ramal de Heidelberger (9). Inserir a última extensão Heidelberger (9) para dentro do frasco de detergente (10). Ligue o respirador (11) para a câmara de perfusão (ou para o distribuidor de pressão no caso de múltiplas perfusões). Para drenar os fluidos do reator, conecte a saída para o frasco de resíduos (12).

1. Inserir o segmento de bomba para dentro da bomba. Iniciar a bomba para encher o ciclo com PBS, fechar a extremidade distal do borbulhador e abrir o respiradouro. Quando o fundo da bolha está firmemente coberto com PBS (03/02 centímetros), a fechar a abertura e abrir a extremidade distal do borbulhador.
2. Instalação de fígado
   1. Ligar a torneira de três vias da cânula da veia porta para o reactor de acesso relacionados. CONECTE da cânula arterial para o acesso arterial. Tenha cuidado para garantir que nenhum ar entra nos sistemas.
3. Aplicação de oscilantes Condições Pressão
   1. Use uma máscara com uma frequência de 15 bpm e uma amplitude de 26 mbar (min. 4 mbar, 30 max. Mbar). Ligue o respirador para a câmara de distribuição de pressão e ligar a câmara ao reactor. Iniciar a aplicação de pressão.
4. Decelularização Protocolo
   1. Execute as etapas de perfusão com um caudal de 5 ml / min. Iniciar a descelularização com a perfusão do fígado com 1% de Triton X-100 durante 90 min. Permitir effluence resíduos através do fluxo de saída do dispositivo de perfusão para manter o nível do fluido no interior da câmara de perfusão e constante sobre o fígado perfundido. Após 90 min, alterar o detergente a 1% de SDS.
      
      

Figura 3: Protocolo de Perfusão para todos os grupos experimentais.

Resultados

A homogeneidade e, assim, a eficácia de diferentes protocolos de decelularização foram avaliadas por observação macroscópica, análise histológica e análise do conteúdo de ADN permanecendo dentro do fígado descelularizados matrizes. Além disso, a carcaça corrosão foi realizada para visualizar a microanatomia intacta de fígados após a descelularização.

Macroscopia

Durante decellularization, fígados tornar Lucent, indicando a remoção de conteúdo celular. Fígados per...

Discussão

Embora a técnica apresentada para a colheita de fígado de rato e descelularização é facilmente reprodutível, existem certos passos críticos a serem considerados:

Durante a preparação para a colheita do fígado, é importante para evitar o sangramento grave, porque ele vai activar a coagulação do sangue e podem conduzir à formação de coágulos sanguíneos dentro do fígado. Em nossa opinião, é vantajoso entalhar a aorta abdominal directamente antes da canulação da veia porta, para evitar fluxo de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cânula arterial autoconstruída
Tubulação de Polietileno Não Estéril Portex	SIMS Portex	REF 800/110/100	0.28 mm ID 0.61 mm OD&
nbsp; Tubo de polietileno não estéril Portex	SIMS Portex	REF 800/110/200	0,58 mm ID 0,96 mm
OD Venodrop Cateter borboleta seguro	Fresenius Kabi	3275851	21 G
cânula de veia portal
Cateter Venoso Periférico	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
Torneira de três vias	smiths medical	888-101RE
Hecht-Assistent	4302		Almofadas
algodão	Curativo cirúrgico Shaoxing Zhengde	13H118-03
Atadura de gaze	Hubei Haige  Instrumentos Médicos	14388
Solução de campainha	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml Seringa	Braun	4606108V	10 ml / Luer Solo
5 ml Seringa	Braun	4606061V	5 ml / Luer Solo
Sutura (Seda 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
campo médico	Shaoxing Zhengde Curativo cirúrgico	D0613011
surgical porta-agulha para instrumentos
	Geuder	17570
microfórceps	Inox-Electronic	91150-20
micro-tesoura	Martin	11-740-11
micro-pinça	S& T
Clamp	Aesculap	BH111R
tesoura	F S T	14501-14
pinça cirúrgica	Aesculap	BD 557
Respirador de Descelularização
	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
Dispositivo de Perfusão	Charite, laboratório de engenharia médica	dispositivo personalizado dispositivo de	descelularização
bomba peristáltica ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	de 4 canais
Extensão Heidelberger 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA segmento de bomba	IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
Tubo de 2 paradas CA	Armadilha	BPT NSF-51
		item
Conector de mangueira Luer Lock	Neolab	No. 02-1887
Detergentes
Pellets SDS	Carl Roth	CN30.4	2,5 kg
Triton X-100	Carl Roth	3051.1	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
coloração
Eosin 1%	Morphisto	10177
Mayer hematoxilina	AppliChem	A4840
coloração gomori	Morphisto	11104
AlcainBlue-PAS coloração Morphisto		11388
Direct Red 80	Sigma Aldrich	365548