Artigo de método

Preparação e caracterização de Individual e Multi-carregadas com droga Fisicamente Entrapped poliméricos Micelles

DOI:

10.3791/53047

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28 de agosto de 2015

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1School of Pharmacy, Pacific University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Oregon State University

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é descrever a preparação e caracterização de fármacos fisicamente aprisionados e pouco solúveis em água em sistemas micelares de liberação de fármacos compostos por copolímeros em bloco anfifílico.

Resumo

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Copolímeros em bloco anfifílicos como bloco polyethyleneglycol- ácido -polylactic (PEG- b- PLA) pode auto-montar em micelas acima da concentração micelar crítica formando núcleos hidrofóbicos cercadas por escudos hidrofílicos em ambientes aquosos. O núcleo destas micelas pode ser utilizado para carregar medicamentos hidrofóbicos, fracamente solúveis em água, como o docetaxel (DTX) e everolimus (EVR). Caracterização sistemática da estrutura de micelas e carregamento de drogas capacidades são importantes antes in vitro e estudos in vivo podem ser conduzidos. O objectivo do protocolo aqui descrito é o de proporcionar os passos de caracterização necessárias para obter produtos normalizados micelares. DTX e IVE têm solubilidades intrínsecas de 1,9 e 9,6 ug / ml, respectivamente, de preparação dessas micelas pode ser conseguido através de evaporação de solvente, que aumenta a solubilidade aquosa da DTX e IVE a 1,86 e 1,85 mg / ml, respectivamente. Estabilidade do fármaco em micelas evalmicas situadas à temperatura ambiente durante 48 hr indica que 97% ou mais dos fármacos são retidos na solução. Tamanho das micelas foi avaliado usando dispersão dinâmica de luz e indicou que o tamanho dessas micelas era inferior a 50 nm e dependente do peso molecular do polímero. A libertação do fármaco a partir das micelas foi avaliada por meio de diálise em condições de imersão a pH 7,4 a 37 ° C durante 48 h. Resultados indicam que o ajustamento da curva de libertação do fármaco é accionado por um processo de primeira ordem indicando que ele está orientado difusão.

Introdução

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Copolímeros em bloco anfifílicos com estrutura de repetição compostas de domínios hidrofílicos e hidrofóbicos pode auto-montar espontaneamente para formar três montagens macromoleculares tridimensionais conhecidas como micelas poliméricas. Estas estruturas têm um núcleo hidrófobo interior rodeado por uma camada hidrófila. O núcleo hidrofóbico tem a capacidade para incorporar drogas hidrofóbicas, quer por armadilha física através de interacções hidrofóbicas ou por conjugação química sobre a espinha dorsal do polímero. 1 Muitas vantagens existem para a utilização desses copolímeros em bloco, para formar micelas para entrega da droga. Estes incluem incorporação de fármacos fracamente solúveis, melhorar a farmacocinética dos fármacos incorporados, e a biocompatibilidade e / ou a biodegradabilidade dos polímeros torna uma alternativa segura para solubilizadores convencionais. 2 Outra vantagem do uso de micelas poliméricas é o seu tamanho de partícula coloidal, entre 15- 150 nm 3, tornando-os atraentes para paentrega renteral. Por conseguinte, ao longo dos últimos 20 anos, surgiram micelas poliméricas como sistemas de distribuição de drogas viáveis ​​para fármacos pouco solúveis em água, especialmente para a terapia do cancro 3,4.

Actualmente existem cinco formulações micelares poliméricos para a terapia do cancro em fase de ensaios clínicos. 4 Quatro das micelas em ensaios clínicos são os copolímeros dibloco baseados em PEG enquanto que a última é um copolímero de tribloco de óxido de polietileno contendo. O tamanho destas micelas variou de 20 nm a 85 nm. A vantagem da utilização de polímeros à base de PEG é a sua biocompatibilidade e, dependendo do segundo bloco também pode ser biodegradável. Recentemente, os sistemas de administração de fármacos à base nova no bloco polyethyleneglycol- ácido -polylactic (PEG-b--PLA) micelas poliméricas têm sido desenvolvidos para a entrega simultânea de vários fármacos anti-cancerígenos. As micelas de PEG-PLA B- são ambos biocompatível e biodegradável. Estes fármacos múltiplos micelas carregadas têm mostrado comoynergistic inibição de diferentes cancros em modelos in vitro e in vivo 2,5,6 e inserem-se no paradigma actual de utilização de vários fármacos em quimioterapia para prevenir a resistência e diminuir a toxicidade. Portanto, há uma grande quantidade de interesse em preparar e caracterizar esses sistemas de entrega de drogas micelares para uso no cancro e outros estados de doença.

No trabalho abaixo nós esboçamos um processo passo-a-passo pelo qual tais micelas podem ser preparados e caracterizados antes de avaliá-los em estados de doença de interesse. Para os fins deste trabalho dois agentes anti-cancro fracamente solúveis, docetaxel (DTX) e everolimus (EVR) ter sido escolhido. Ambos DTX e EVR são compostos pouco solúveis em água com solubilidades intrínsecas de água em 1,9 e 9,6 ng / ml, respectivamente. 7,8 Duas PEG polímeros b -PLA com diferentes pesos moleculares foram utilizados neste protocolo como os blocos de construção para a polimérica formulados micelas,estes polímeros são PEG 2000 - b -PLA 1800 (3800 Da) e PEG 4000 - b -PLA 2200 (6200 Da). PEG micelas b -PLA pode, portanto, fornecer uma plataforma única como um nanocarrier para DTX e EVR individualmente e em combinação. Os reagentes necessários / Materiais e equipamentos necessários para preparar e caracterizar estas micelas estão listadas na Tabela 1.

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Protocolo

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1. Preparação de individuais e multi-drogas Micelles carregado pelo método de fundição de solvente

  1. Pesar DTX 1 mg ou 1 mg EVR ou ambas as drogas em 1 mg cada, para as micelas dupla droga (DDM).
  2. Pesar 15 mg de PEG 2000 - b -PLA 1800 ou PEG 4000 - b -PLA 2200 para qualquer indivíduo ou DDM.
  3. Dissolve-se os medicamentos e / ou drogas e do polímero em 0,5 ml de acetonitrilo e colocar num frasco de fundo redondo de 5 ml.
  4. Formar uma película fina de polímero de droga distribuída por evaporação do (s) fármaco -polymer solução de acetonitrilo sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. Definir o evaporador rotativo a 100 rpm, a temperatura do banho de água de 40 ° C e uma pressão de vácuo de 260 mbar durante 5 minutos, seguido de uma redução para 100 mbar durante mais 3 min.
  5. Re-hidratar o filme de fármaco e polímero, com 0,5 ml de água desionizada a 50 ° C e agitar suavemente o frasco para formar as micelas.
  6. Filtrar o resultadoing solução micelar através de um filtro de nylon de 0,2 um para remover qualquer droga ou contaminantes dissolvidos-un para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.

2. Avaliação da droga carregamento e da estabilidade em micelas de fase reversa usando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) de

  1. Realizar a análise por RP-HPLC com uma coluna C8 equilibriated a 40 ° C num modo isocrático com uma fase móvel de acetonitrilo / água (62/38) contendo ácido fosfórico a 0,1% e 1% de metanol a um caudal de 1 ml / min e um volume de injecção de 10 ul.
  2. Diluir micelas recém-preparados (Ponto 1) 1: 100 em fase móvel antes de analisar por RP-HPLC para determinar a carga de medicamento inicial. Loja não diluídas micelas individuais e DDM à temperatura ambiente (25 ° C) durante 48 horas e preparar frescos 1: 100 amostras diluídas em fase móvel para re-avaliar por RP-HPLC e determinar medicamento (s) em micelas estabilidade ao longo de 24 horas.
  3. Monitorar DTX e IVE picos a 227 e 279 nm, respectivamentecom tempos de retenção de 1,7 e 5,7 min, respectivamente. Executar todas as medições em triplicado. Apresentam dados como a carga média ± SD de drogas.

3. Avaliação das micelas de tamanho de partículas por espalhamento dinâmico de luz (DLS)

  1. Diluir micelas preparadas de fresco (como descrito na secção 1) em água desionizada a uma razão de 1:20 para dar uma concentração final de polímero de 1,5 mg / ml.
  2. Medir a intensidade do laser He-Ne (633 nm) a 173 ° para determinar espalhamento. Executar todas as medições a 25 ° C após um pré-equilibração durante 2 min.
  3. Executar todas as medições em triplicado. Dados apresentam-se como a dimensão média de Z-média ± DP, juntamente com o índice de polidispersibilidade (PDI) da distribuição.

4. Avaliação da In Vitro Drogas lançamento de micelas individuais e DDM

  1. Prepare micelas individuais e DDM, conforme descrito na secção 1. Carga de 2,5 ml das micelas numa cassete de diálise com 3 mlum peso molecular de corte (MWCO) de 7000 g / mol.
    NOTA: Este MWCO foi escolhido para permitir que o fármaco livre (s), juntamente com as moléculas do polímero não associados a difundir livremente para fora da cassete e, assim, assegurar as condições de imersão.
  2. Coloque as cassetes em 2,5 L de pH 7,4 mM de tampão de fosfato 10 (preparado por diluição de solução stock de 200 mM) e mudar o tampão de cada 3 horas para garantir as condições de imersão. Manter a temperatura do tampão a 37 ° C durante toda a duração da experiência.
  3. Aos 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, e 48 h, retirar 150 ul da solução nas cassetes e substituir com 150 ul de tampão fresco.
  4. Analisar as amostras usando RP-HPLC, tal como estabelecido na secção 2 para determinar a concentração do fármaco. Curve-se ajustar os dados de liberação da droga (s) com base em um modelo de difusão simples, com uma fase de uma associação exponencial usando software stastitical.
  5. Calcular o tempo necessário para alcançar 50% de libertação do fármaco (t 1/2) de eACH droga em micelas individuais ou DDM com base no ajuste de curva. Executar todas as medições em quádruplo.

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Resultados

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DTX individual ou micelas EVR e DTX e IVE DDM em micelas de PEG-b--PLA são formuladas com sucesso, quer em PEG 4000 - b -PLA 2200 ou PEG 2000 - b -PLA 1800 (Figura 1).

DTX, RVP e o DDM mostraram estabilidade semelhante em PEG 4000 - b -PLA 2200 ou PEG 2000 - 1800 b -PLA mais de 48 h (Figura 2). Carga de droga inicial de EVR em ...

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Discussão

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O uso de micelas poliméricas para administração de medicamentos continua a se expandir devido à sua versatilidade e capacidade de fornecer medicamentos hidrofóbicos para vários estados de doença. Portanto, as técnicas necessárias para preparar e caracterizar essas formulações antes do uso em cultura de células ou animais são um primeiro passo crítico para determinar o melhor emparelhamento entre o medicamento e o polímero. PEG-b-PLA são excelentes copolímeros em bloco anfifílicos para fins de administração de ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pela doação do AACP New Pharmacy Faculty Research Award Program, Medical Research Foundation of Oregon New Investigator Grant, Oregon State University-Startup fund e Pacific University, School of Pharmacy Start-up fund.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PEG2000-b-PLA1800Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA/2000PLA MW pode ser especificado no pedido
PEG4000-b-PLA2200Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA/4000PLA MW pode ser especificado no pedido
DocetaxelLC LaboratoriesD-1000100 mg
EverolimusLC LaboratoriesE-4040100 mg
AcetonitrilaEMD/VWREM-AX0145-1Grau HPLC; 4 L
Balão de fundo redondoGlassco/VWR89426-4965 ml
RV 10 Control EvaporadoresIKA Works8025001Rotoevaporador
Shimadzhu HPLC com detector DADShimadzhuRP-HPLC
de diálise Slide-a-lyzer MWCO 7000Thermo Scientific, Inc663703 ml
Tampão fosfato pH 7,4, 200 mMVWR100190-870500 ml
Malvern NanoZSMalvern Instruments, UKDLS
Filtro de nylonAcrodisc/VWR28143-24213 mm; 0.2µ
M Ácido fosfórico, NFSpectrum Chemical/VWR700000-626100 ml
GraphPad Prismwww.graphpad.comSoftware de análise
Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge Agilent Technologies866953-9064.6 &vezes; 75 mm, 3,5 μ m

Referências

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  1. Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
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