Uma plataforma microfluídica para processamento de precisão de pequeno volume de amostra e respectiva utilização para Tamanho partículas biológicas separadas com um microdispositivos Acústico

Summary

Este protocolo descreve uma arquitetura de sistema para realizar separações automatizadas de partículas de pequeno volume (0,15–1,5 ml) usando um dispositivo microfluídico e discute métodos para otimizar o desempenho e a operação do dispositivo acustofluídico.

Abstract

Uma grande vantagem dos microcanais é a capacidade para manipular pequenos volumes de amostra, reduzindo deste modo os resíduos de reagente e amostra a preservação precioso. No entanto, para alcançar a manipulação da amostra robusta é necessário abordar a integração de dispositivos com o ambiente de macroescala. Para realizar a separação de partículas repetível, sensível com dispositivos microfluídicos, este protocolo apresenta uma plataforma microfluídica automatizado e integrado completo que permite o processamento preciso de 0.15-1.5 ml amostras utilizando dispositivos microfluídicos. Aspectos importantes deste sistema incluem o layout modular dispositivo e acessórios robustos, resultando em mundo confiável e flexível para chip conexões, e manuseio de fluidos totalmente automatizada que realiza a coleta de amostras em circuito fechado, limpeza do sistema e priming passos para garantir a operação repetível. Diferentes dispositivos microfluidicos podem ser utilizados indiferentemente com esta arquitectura. Aqui nós incorporar um dispositivo acoustofluidic, detalhe sua characterizção, otimização de performance, e demonstrar a sua utilização para o tamanho-separação de amostras biológicas. Usando feedback em tempo real durante as experiências de separação, coleta de amostras é otimizado para conservar e concentrar amostra. Embora exigindo a integração de múltiplas peças de equipamento, as vantagens desta arquitetura incluem a capacidade de processar amostras desconhecidas sem otimização adicional do sistema, a facilidade de substituição do dispositivo, e, robusto processamento preciso de amostra.

Introduction

Amostra separação e fracionamento é uma das áreas mais promissoras da aplicação de tecnologias microfluídicos. Tais etapas de manipulação de amostras são essenciais para o diagnóstico eficazes clínicos, desenvolvimento de terapêutica, os esforços biosurveillance e progresso na pesquisa de ciências da vida e tecnologia. A miríade de estratégias de separação de microfluidos foram demonstradas para as partículas suspensas e colóides de líquido, bem como para as espécies químicas e biológicas; vários comentários fornecem visões gerais dos progressos recentes e os desenvolvimentos nestes domínios ^{1 - 9.} Embora muitas dessas tecnologias de separação microfluídicos (doravante referidos como "dispositivos de núcleo") têm sido amplamente caracterizada, alguns relatórios têm considerado o problema da separação da amostra a nível de sistema. Os dispositivos de núcleo são tipicamente fritas centímetro escala individuais, interligados à tubulação fluoropolímero, com fluido entregue por uma bomba de deslocamento ou pressão.No entanto, se a promessa de microfluídica - incluindo uma maior automatização, confiabilidade e redução de volumes de amostra - é tornar-se realidade, pelo menos, um esforço equivalente deve ser dedicada à concepção de um sistema de separação completa em que o dispositivo de núcleo é integrado .

Além disso, um grande desafio para abordagens microfluídicos para biodetection é a macro a micro interface. Isto refere-se não só às conexões físicas de um dispositivo microfluídico para componentes macroescala "mundo-a-chip", e à incompatibilidade entre os volumes típicos de amostra clínica ou analítica (~ 0,1-10 ml) e o volume interno de chips microfluídicos (~ 0,01-10 ul), mas também para as limitações de amostragem estatísticos que derivam de colmatar essas escalas de tamanho. Estas questões contribuem para a percepção de que a amostra de pré-processamento e preparação são o "elo mais fraco" do biodetection. ¹⁰ A plataforma descrito neste trabalho taKES grandes passos em direção a enfrentar esses desafios.

Tendo uma visão de nível de sistema, este protocolo detalha o processamento confiável de volumes analítica escala precisamente calibrada-(variando de 0,15 a 1,5 ml) em ~ 10 min prazos. Esta é uma operação "one-button": uma vez que o frasco fonte contendo os frascos de amostra e de destino para recolha de fracções são colocados no sistema, o comando "run" inicia o procedimento, e todos os passos são controlados por computador. No final de um ciclo, os frascos de recolha pode ser retirado do sistema para análise a jusante das fracções separadas.

O dispositivo de núcleo neste sistema é um chip acoustophoresis que extrai (5-20 uM) de células de partículas de tamanho de mamífero a partir da amostra. Acoustophoretic separação é escolhido aqui principalmente porque é de alto rendimento (até 100s de l / min), livre-label, e sem contato, oferecendo assim vantagens em separar Viru viávelses a partir de células que algumas outras técnicas microfluídicos pode igualar. A física de partícula acústico focagem têm sido amplamente descrito, ^11-13 e não são o foco deste protocolo, mas um breve resumo dos conceitos subjacentes segue para ajudar a compreender a aplicação à separação microfluídico.

Ultra-som ondas estacionárias ressoando em microcanais cheios de líquido produzem campos de pressão, que dão origem a forças que impulsionam as partículas em direção a nós de baixa pressão. O módulo da força depende do volume da partícula, e em um factor de contraste acústica derivada das densidades relativas e de compressibilidade da partícula e o fluido de suspensão. ¹⁴ Como tal, acústica de focagem é idealmente adequado para a separação de células de tamanho (~ 7-15 mm) a partir de (~ 50-200 nm) partículas de vírus de tamanho. As partículas maiores migram para um nó de pressão; No entanto, uma vez que o módulo da força é muito pequeno parapartículas menores que de 2-3 uM, estas pequenas partículas ou espécies dissolvidas praticamente não se movem de todo. A implementação específica de separação acústica, conforme descrito anteriormente, ¹⁵ incorpora uma parede fina para subdividir o canal de fluido e permite sintonizável, a colocação assimétrica da posição de focagem. Isso adiciona flexibilidade no projeto do dispositivo, e os benefícios de desempenho, incluindo-o aumento da qualidade de separação e velocidade estão completamente descritos em outros lugares ^16,17.

No entanto, uma vantagem importante da abordagem de design de nível de sistema descrito neste trabalho é que é adaptável a uma grande variedade de dispositivos de núcleo de microfluidos. Por exemplo, a maioria dos outros modos de separação de fluxo contínuo, incluindo inercial, o fluxo de campo fracionamento, deslocamento lateral determinista (DLD), e vários tipos de dispositivos eletrocinéticos pode ser facilmente incorporada, com ajustes apropriados feitos para contabilizar as alterações no entrada de configuração / saída , as taxas de fluxo,e os volumes de amostra. Dispositivos com vários tipos de campos on-chip (elétricos, magnéticos) ou gradientes (térmicos, químicos) podem requerer conexões adicionais para o chip, ou a integração de hardware adicional, que esta plataforma acomoda.

Este protocolo fornece as etapas necessárias para projetar um dispositivo de separação de microfluidos, e para fabricar chips de silício de vidro por uma profunda gravação iónica reactiva (DRIE, um processo plasma-etch disponível em muitas instalações de microfabricação, que usa ciclos de decapagem e passivação alternada para alcançar profunda características com paredes laterais verticais ^18). Em seguida, descreve-se a caracterização do dispositivo acoustofluidic para determinar os parâmetros de funcionamento óptimas para a separação, e, finalmente, o sistema de separação detalhe totalmente integrado e o procedimento para o processamento de amostras biológicas. Típicas resultados da caracterização dispositivo e processamento de dados de amostra são então apresentadas e discutidas, e as principais vantagens desta aproach são destacadas, incluindo modularidade, robustez, precisão e automação.

Protocol

1. Acoustophoretic projeto de dispositivos e fotomáscara Disposição

NOTA: Considerações gerais e orientações para desenho de processos de microfabricação e layout máscara pode ser encontrado em textos sobre microfabricação e tutoriais de desenho photomask ^19-21.

1. Lay out Máscara 1, a camada fluidificada (parte da frente), utilizando software CAD apropriado. Escolha uma geometria que permite a injeção da amostra e separação adequada para a aplicação desejada.
   1. Para acústica com foco, defina a largura do canal fluidic w para fornecer uma frequência de ressonância f _n superior a 1 MHz de acordo com a equação _f n = nc / 2W, em que c é a velocidade do som no fluido relevante e n é o número de nós de onda estacionária (por exemplo, para um canal de largura de 900 mm, a dois ressonância nó é esperado em ₂ f = 1,65 MHz).
      NOTA: Particles ocupando posições laterais distintas perto do fim do canal de separação deve sair de saídas distintas. Neste protocolo, as partículas são separadas por tamanho, de modo que as saídas são designados SPO e LPO, para pequenas partículas e de saída em grande partícula, respectivamente, como mostrado na Figura 1.
   2. Definir o comprimento do canal de fluido para controlar o comprimento de partículas de tempo são expostos ao campo de separação, a um caudal específico. Mais tempo on-chip tempo de residência para partículas de migrar devido a forças de separação devem ser negociados fora contra a pegada chip de maior necessária.
      NOTA: Em nossos dispositivos acústicos de focagem, o canal de fluxo faz três passes para baixo o chip para maior tempo de residência (Figura 2a). A uma taxa de fluxo total típico de 200? L / min, por meio de partículas que fluem a 300 x 200 um corte transversal, de 117 mm de comprimento do canal de separação passar em média 2,1 seg no campo acústico.
2. Incluir portos de fluido no layo máscaraut para conexões com tubos padrão organizados em uma grade padronizada (5 mm de altura). Inclua pontos de referência adequados para o alinhamento de máscaras para o outro durante a fabricação e corte em cubos de dispositivos individuais.
3. Lay out Máscara 2, a camada de Via (parte de trás), que inclui apenas portas fluídicos. Inclua pontos de referência para o alinhamento de máscara 1.

Figura 1. Dispositivo Acoustofluidic. Esboços esquemáticos da arquitetura dispositivo acoustophoretic. (A) Vista de cima, mostrando a configuração geral do H-filtro (não à escala). (B) esquemática da secção transversal do canal na posição marcada pela linha tracejada preta em (a), mostrando o campo de pressão (azul linhas pontilhadas), e o sentido das forças acústicas primárias de radiação (PRF) que impulsionam as partículas em direção planos nodais (setas vermelhas). A secção transversal do canalé de 900 × 200 um com uma parede de cerca de 10 um de espessura que separa o principal (300 um de largura) e canais de desvio. (C) a representação em 3D de separação de partículas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Cleanroom Fabricação de chips microfluídicos para Acoustophoresis

1. Padrão dos portos de fluido back-side usando máscara 2 em uma dupla face polida 0,5 mm de espessura, 100 mm de diâmetro <100> wafer de silício por fotolitografia positivo resistir-padrão. Etch esta geometria por gravação iónica reactivo profundo (DRIE) a uma profundidade de 350-400 uM.
2. Rodar a bolacha sobre, e a geometria do canal de fluido padrão do lado da frente da máscara utilizando um padrão positivo por-resistir fotolitografia para o outro lado do silício. Em seguida, montar o wafer do dispositivo para um segundo (silício em branco) wafer transportadora usando photoresist.
3. Etch os canais, também por DRIE, a uma profundidade de 200 um, através de decapagem-o silício nas localizações das portas (a bolacha transportador protege a superfície da ferramenta DRIE). De-montar o wafer do dispositivo em branco wafer Si por imersão em solução de resistir-stripping.
4. Limpar a bolacha e um dispositivo de traços característicos da bolacha de vidro de borossilicato 0,5 mm de espessura, utilizando uma solução Piranha (ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio numa proporção de 3: 1).
5. Selar os canais de fluido por anodicamente ligar as bolachas de silício e de vidro, utilizando os seguintes parâmetros: a pressão da câmara 3 mTorr, a pressão do êmbolo em 1,000 N, a temperatura a 350 ° C, e aplicam-se a 750 V até que a corrente cai abaixo de 0,2 mA.
6. Corte os chips individuais distante com uma lâmina de diamante em uma serra corte em cubos.

3. Dispositivo de Montagem Final

1. Piezo transdutor Anexo
   NOTA: O ultra-som é gerado no chip de microfluidos por um transdutor ligado ao lado piezocerâmico do silício.
   1. A partir de emwo-componente do kit de epóxi de baixa viscosidade, pesar a proporção recomendada de ambos os componentes e misturá-los completamente.
   2. Dispensar a mistura epoxi com uma pipeta e espalhar uniformemente através de um piezocerâmico titanato zirconato de chumbo (PZT), para criar uma camada fina e uniforme (aproximadamente 10 ul de mistura de epoxi para um piezo com dimensões de 37,5 x 10 x 0,5 mm).
   3. Usando um gabarito ou acessório adequado, alinhe o lado da epóxi da piezocerâmico com o chip microfluídico, proporcionando uma área pendendo de um lado para fixação fio subsequente (ver Figura 2a), e trazer os dois componentes em contato. Aperte o conjunto em um vício, tomando cuidado para não quebrar qualquer um dos componentes, e curar a temperatura e duração recomendada pelo fabricante do epóxi.
   4. Após o epóxi ter curado, prenda de calibre fino fio leva para cada lado da piezocerâmico, soldando com um ferro de solda de ponta fina, tornando o mais breve possível contacto com o piezo para evitar thermally de-polarizando ele. Em alternativa, utilizar um adesivo para colar os fios condutores do piezo.

Figura 2. Fluidic Breadboard, Chip de montagem, e World-a-Chip Interface. Fotos de (a) o chip microfluídico acústico (dimensões externas de 70 × 9 × 1 mm) com fios condutores do transdutor piezo em anexo, mostrando três passes da separação canal para baixo o chip, (b), as uniões roscadas costume fluidos e componentes de tubagem maquinadas para a interface de chip para mundo, (c) o chip montado no lado de baixo da placa de ensaio de fluidos usando placas de fixação, que abrange uma abertura na placa de ensaio para permitir resfriamento fã, (d) uma vista de cima da placa de ensaio com conexões de tubos ligados e ventilador de refrigeração, e (e) um esquema de corte transversal das fixações que a interface do tubing com o chip microfluídico montado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Dispositivo de montagem e World To-Chip Interface
   1. Fixar o chip para a "placa de ensaio fluídica" (uma placa com uma grelha regularmente espaçados de furos de passagem roscados) usando placas de fixação. Anexar um ventilador de refrigeração para a placa de ensaio para regular a temperatura durante as experiências acústicas (ver Figura 2).
      NOTA: Operar sem o ventilador de refrigeração em tensões de acionamento típicas eleva a temperatura do dispositivo para 70-80 ° C. Isso muda significativamente a frequência de ressonância devido à velocidade do som no fluido alterado, e podem afectar negativamente a viabilidade das eventuais partículas biológicas que estão a ser processados.
   2. Parafuso em conectores de chip-to-world, previamente descrita em outros lugares ^{22 e} mostrado na Figura 2. Junte-se a estes itubos nterface a tubulação adicional no entradas e saídas usando padrão ¼ "-28 sindicatos para 1/16" tubulação.

4. Caracterização dos Acústico desempenho de foco

NOTA: Os componentes do sistema necessárias para a caracterização acústica com foco são agrupados na Lista de Materiais. Passos 4.1 e 4.2 abaixo se aplicam a qualquer dispositivo de núcleo usado com esta plataforma, que as etapas seguintes descrevem operações específicas para o dispositivo acoustofluidic discutido aqui.

1. Configuração de Sistema
   1. Monte o chip microfluídico usando conexões mundo-a-chip na placa de ensaio de fluidos, conforme descrito na Seção 3. Fazer as ligações utilizando tubagem (tal como 1/16 "de diâmetro fluoropolymer tubo exterior) a uma bomba de recolha de fluidos e frascos. Montar a placa de ensaio no palco de um microscópio capaz de imagens de fluorescência equipado com uma câmera CCD.
   2. Conecte-se comprimentos de pequeno diamete interiorR (ID) de tubagem (0,006 "é recomendado) imediatamente após o chip (ver Figura 4) para servir como limitadores de fluxo, que estabilizam o sistema e controlar o fluxo de divisão entre as saídas de chip. Use tubos ID maiores, como 0,01 "ou 0,03", para todas as outras conexões.
      1. Estimar a resistência ao escoamento hidrodinâmico de R _{h de} cada pedaço de tubo de comprimento L e D diâmetro interno utilizando a equação R = _h 128 uL / πD ^4, em que μ é a viscosidade dinâmica do fluido. A queda de pressão Δ P devido a cada comprimento de tubagem a uma dada taxa de fluxo Q é dado por P = Δ QR _h.
      2. Escolher um rácio de comprimentos de restritor para dividir o fluxo entre as aberturas, conforme apropriado para ser usado o método de separação. Separação óptima com os chips acústicos neste protocolo requer uma SPO: relação de fluxo de LPO de approximamadamente, 65: 35%.
      3. Escolher o comprimento dos restritores de fluxo de saída de tal modo que a sua resistência fluídica é pelo menos 3-4 vezes maior do que a resistência total do resto do sistema (somados apropriadamente em série ou em paralelo). Para o dispositivo acoustophoresis utilizada neste trabalho, comprimentos de tubos de 35 e 65 cm para o LPO e SPO são adequados.
         NOTA: A consideração cuidadosa deve ser dada a R _h de qualquer dispositivo microfluídico Núcleo. Para o nosso acústica com foco de chips neste trabalho, R _h é baixa devido às suas dimensões de canal relativamente grandes, então as resistências de tubos ligados ultrapassá-lo facilmente. Para dispositivos com dimensões menores do canal, a resistência do chip pode dominar o resto da tubulação do sistema, em que o design caso e controle de on-chip canal R _h é uma consideração adicional durante a Etapa 1 do presente protocolo. Princípios e diretrizes de design detalhadas estão disponíveis na literatura ^23,24.
2. Verificação do Sistema
   1. Verifique se há vazamentos para verificar se o dispositivo microfluídico não tem defeitos e todas as conexões de tubos são selados. Dispensar a água através dos tubos de entrada de ar, conforme necessário, com uma seringa e para monitorizar qualquer fuga de fluido no canal principal.
   2. Dispensar um volume conhecido através do chip, e medir as quantidades recolhidas a partir das saídas de garantir que a proporção de fluxo é, como esperado. Os desvios à relação do volume esperado pode indicar bloqueios em uma das saídas ou conexões vazando.
      1. Para manter a limpeza do sistema e evitar o entupimento resplendor todo o sistema (tubos fluídico e chip) com soluções de limpeza adequados (por exemplo, lixívia, etanol, água) antes e depois de executar quaisquer experiências.
      2. Em caso de obstruções ou bloqueios em um dos pontos de venda, lave o sistema ao conectar a saída clara para eliminar o bloqueio. Se não for bem sucedido, inverter o sentido do fluxo durante a lavagem,opcionalmente aplicação de pulsos rápidos de fluxo reverso (usando uma seringa manualmente acionado). Finalmente, se o bloqueio ainda não pode ser removido, substituir o tubo ou chip, conforme necessário.
3. Configuração de digitalização de frequência para Acústica Focando
   1. Encher o canal de desvio (ver Figura 1) com um fluido, tal como água desionizada, etanol, ou tampão fosfato salino (PBS) por injecção manual com uma seringa. Note-se que este líquido não entra em contacto com a amostra a ser processada. Os detalhes de ajustar a posição do nó utilizando diferentes fluidos de bypass são descritos em outros lugares ^16,17. Em resumo, se o nó deve ser mais perto da parede divisória, utilizar um desvio de fluido de baixa densidade, tais como etanol; para a colocação de nó mais próximo do fluxo de amostra de entrada, escolher um fluido mais denso, tal como uma solução de glicerol.
   2. Adicione uma solução do grânulo de cerca de 0,01% (w / v) de 5-8 uM pérolas de polímero fluorescentes suspenso num tampão tal como PBS com0,05% de Tween-20 e encher a seringa de entrada da amostra com a solução do grânulo. Encher a seringa de entrada tampão com o mesmo tampão (este não necessita de ser o mesmo fluido como no canal de desvio). Note-se que, em geral, o buffer é escolhido para atender o pedido (ver Passo 5.1).
   3. Com a placa de ensaio de fluidos na platina do microscópio, o foco aproximadamente a meio caminho dentro da profundidade do canal a uma região canal recto pouco antes da saída com ambos os canais (de separação e de bypass) no campo de visão. Uma fonte de luz externa oblíquo-ângulo adicional pode ser necessária para fazer as paredes do canal visível, para o sucesso pós-processamento dos dados da imagem.
4. Frequência de digitalização automatizada e Captura de Imagem
   1. Faça as conexões elétricas usando cabos blindados (por exemplo, RG-58 equipados com conectores BNC) para um gerador de função com frequência de rádio (RF) amplificador para entregar o sinal de excitação ao transdutor piezo. Opcionalmente, conecte um osciloscópio paraa saída do gerador de função para o controlo da tensão real aplicada ao transdutor.
   2. Ligue o ventilador de arrefecimento, e definir o gerador de função de tal modo que a saída do amplificador de RF para o transdutor piezoeléctrico é na gama de 12-25 volts de pico-a-pico (V _pp).
   3. Definir ambas as seringas para a mesma taxa de fluxo entre 50 e 200 ul / min. Utilizando uma única bomba de seringa para conduzir ambas as seringas com o mesmo motor é recomendado para minimizar perturbações no fluxo.
   4. Executar um procedimento de varredura de freqüência, especificando as freqüências de início e fim, o tamanho do passo entre os valores de frequência e tensão do piezo unidade usando um kit de ferramentas de automação de laboratório como o LabVIEW da National Instruments.
   5. Em cada passo de frequência, aplicar a tensão durante 15 segundos para permitir que o sistema atinja o equilíbrio, em seguida, capturar imagens 10 dos grânulos que fluem através do chip para análise subsequente (tempos de exposição entre 10 e 100 mseg são recomendadas).
   6. Entre each aplicado passo de freqüência, desligue a tensão para aproximadamente 20 segundos para deixar as contas redistribuir uniformemente em todo o canal e remover preconceito em se concentrar a partir do passo de freqüência anteriormente aplicado.
5. Análise de Imagem para determinar a freqüência de ressonância e Focando Posição
   1. Executar um script de análise de imagem (como o script AF_freqScanPlotter.m MATLAB fornecido com este Protocol) e insira as informações necessárias nos prompts: selecione a lista de arquivos de imagem gerados no Passo 4.4, digite o início de digitalização e parar de frequências e tamanho do passo, a toda a largura do canal, a localização da parede, e finalmente seleccionar a região de imagem a analisar, incluindo tanto a separação e canais de desvio.
   2. Observar a média roteiro de análise o conjunto de imagens capturadas em cada escalão de frequência, e em média os valores de intensidade ao longo da direção do fluxo. Isso resulta em uma secção transversal linha de varredura da intensidade de fluorescência.
      NOTA: A freqüência correspondente à highe intensidade r é definido como a frequência de ressonância (Figura 3, linha do meio), e a posição no canal onde ocorre a maior intensidade é a posição de focagem (Figura 3, linha inferior).

Figura 3. Representante de digitalização Frequência. Exemplo de dados de varredura de freqüência para bem acoplada (A) e mal acoplado (B) piezo e chips. Linha superior: intensidade de fluorescência de contas (vermelho representa alto, e azul representa baixa intensidade). Linha do meio: intensidade máxima em cada frequência. Linha inferior: localização da intensidade máxima, onde a linha tracejada vermelha indica previu posição de focagem, e diamantes vermelhos indicam freqüência de ressonância conforme determinado pela intensidade máxima.g "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Separação Automatizada

NOTA: A experiência de separação automatizada é executada para separar as partículas grandes das partículas pequenas, devido às forças de focagem acústicos dependentes de tamanho aplicados no chip de microfluidos. Os componentes do sistema necessários são agrupados na Lista de Materiais.

1. Configuração do Sistema e Preparação de Amostras
   1. Ligue o chip de microfluidos para a bomba de seringa, as válvulas de selecção de múltiplas portas controladas por computador, medidores de fluxo em interface-PC, e os tubos, como mostrado na Figura 4. Esta configuração permite que o processamento de amostras automatizado através do chip separação de microfluidos, bem como automatizado limpeza passos entre os experimentos para remover a contaminação cruzada e amostra carry-over.
   2. Usar um tampão de amostra adequado para as células ou partículas a serem separadas, ou como requerido pelo ensaio para análiseser utilizado após separação. Tal como no passo 4.3.2, o buffer de recuperação (mas não necessariamente o fluido de bypass) deve coincidir com o fluido de amostra.
      NOTA: Quaisquer tampões aquosos tipicamente utilizados com amostras biológicas (por exemplo, PBS) têm propriedades acústicas semelhantes a água e não irão alterar apreciavelmente o desempenho do dispositivo acústico. A utilização de fluidos de amostra com a densidade e viscosidade significativamente diferente da água é possível, mas apenas recomendados para operadores com experiência significativa acoustophoresis.

Figura 4. acústica Configuração do Sistema para experiências de separação automatizada. As linhas azuis rastrear o caminho do fluxo principal através do sistema. Todas as linhas verdes e pretas são 0,03 "diâmetro interno (ID) tubulação, e todas as linhas azuis e cor-de-cinza são 0,01" tubulação ID, com o eXception das bobinas que prendem, que são 0,03 "ID, e os limitadores de fluxo, que são 0.006" ID. As seringas são preenchidos com tampão, e as bobinas de exploração têm volume suficiente (550 mL) para evitar a absorção de quaisquer amostras ou reagentes de limpeza para as seringas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Processo de Separação
   1. Estado pré-run. Antes de executar a separação, assegurar que os reservatórios de reagente de limpeza (água sanitária, etanol, buffer) tem fluido suficiente, os reservatórios de resíduos não estão cheios, e as linhas fluidas são preparadas (ou seja, preenchido com solução). Se esta última condição é incerta, ou se o sistema está a ser executado pela primeira vez depois de marcha lenta (por exemplo, pela primeira vez num dado dia), executar um procedimento de limpeza automático (ver Passo 5.3). Definir válvulas 3 e 4 nas saídas de chips a fluir para o lixo reservoirs inicialmente.
   2. Ligue o ventilador de refrigeração, e definir o gerador de função na frequência de ressonância acústica para o chip a ser utilizado, conforme determinado na etapa 4.5. Ajuste o ponto de ajuste de tensão no gerador de função para que as saídas do amplificador RF entre 12 e 25 V _pp, conforme apropriado para a separação desejada.
   3. Conecte a entrada Amostra Vial, buffer de entrada Vial, e frascos de recolha adequados para o sistema. Pouco antes de fixar o Vial entrada de exemplo para sua tubulação de captação, vortex brevemente frasco para voltar a suspender as partículas que podem se instalaram. Em seguida, conecte o frasco e iniciar a rotina de separação sem demora.
      CUIDADO: Se a amostra a ser processada contém agentes potencialmente infecciosos, os frascos devem ser de um tipo com tampa de rosca, para manter um sistema selado e prevenir a amostra de dispersão em aerossol. Além disso, quando se trabalha com materiais de risco biológico, lidar com todos os frascos e tubos enquanto usava o equipamento de proteção necessário e usar o reqcontroles de perigos uired e procedimentos para a Biological Risk Group e Biossegurança nível adequado ao material. Consulte as políticas e protocolos institucionais em caso de qualquer incerteza.
   4. Use um programa em um kit de ferramentas de automação de laboratório para controlar as válvulas, sensores de fluxo e bomba para realizar a rotina de separação totalmente automático.
      NOTA: A rotina muda as válvulas, aciona retirada bomba de seringa e infusão, monitores e sensores de fluxo de dados para cronometrar corretamente a coleta de frações de amostra. As principais etapas são resumidas a seguir no 5.2.4.1 através 5.2.4.3, como se realizado manualmente.
      1. Primeiro o tubo de coleta. Retirar cerca de 15 ul a partir da entrada frasco de amostra para encher completamente o tubo ligando-o a válvula 1. Simultaneamente, o primeiro tubo de ligação do frasco depósito de entrada para a válvula 2. De um modo semelhante, prima da entrada de ar da válvula 1 para garantir que ele não contém fluido. Finalmente, mudar Válvulas 1 e 2 para expulsar a perdero excesso de fluido ou o ar que entrou na bobina de carregamento.
      2. Carregar a bobina de amostra, como mostrado na Figura 5a. Uma sequência de carregamento típico para o processamento de uma amostra de 250 ul é retirar 25 mL de ar a 50 l / min, em seguida 250 ul de amostra a 200 ul / min, seguido de 35 ul de levando tampão a 200 ul / min, e finalmente mais 25 ul de ar a 50 ul / min.
         Nota: Todos os volumes e caudais são selecionáveis ​​pelo usuário. Note-se que esta sequência de carregamento é na ordem inversa de como as fichas de fluido irá fluir através do dispositivo de separação.
      3. Comece a infusão da amostra. Definir as bombas de seringa para infundir os tampões de fluidos carregados à taxa desejada (tipicamente de 100 ul / min). Monitorizar as taxas de fluxo na SPO e LPO com sensores de fluxo para garantir que o fluxo é constante e na proporção determinada no passo 4.1, e de que não ocorreu entupimento.
      4. Recolha fracções separadas. Quando os sensores de fluxo de detectar um aumento na taxa de fluxo, indicando passage do primeiro intervalo de ar, desligue a válvula de saída correspondente a partir de resíduos (onde começou no Passo 5.2.1) para um frasco de coleta de amostras.
      5. Após a passagem da amostra a partir do chip, observar o sensor de fluxo de detectar o segundo entreferro. Neste ponto, mudar as válvulas de saída de volta para o lixo. Depois de o volume total carregado a partir do Passo 5.2.4.2 é dispensado, parar a bomba de infusão de seringa e terminar a rotina de automação quando a vazão chega a zero.
   5. Após a experiência de separação estiver concluída, desligue a SPO e LPO frascos de coleta de amostra e armazená-los de forma adequada para análise posterior.
3. Automated limpeza e descontaminação
   NOTA: Antes de processar cada amostra, lavar e descontaminar todo o sistema fluídico com a seguinte rotina automatizada.
   1. Fixe a SPO e LPO tubos de coleta de frascos, bem como o tubo de amostra recolhida em frascos vazios para recolher soluções de limpeza em excesso que será liberado through os tubos.
   2. Inicie a rotina de limpeza sistema automatizado. Tal como acontece com o procedimento de separação automatizada no Passo 5.2, o programa deve controlar as válvulas e bomba de seringa a sequencialmente carregar a bobina de retenção com reagentes de limpeza, e lavá-los através do sistema.
   3. Realize a seguinte rotina de limpeza: Lave com água sanitária a 10%, em seguida, com 70% de etanol, e terminam com água ou uma solução salina tampão apropriado (por exemplo, 1x PBS ou tampão usado para o processamento da amostra). Utilize os seguintes volumes de descarga: 450 ul de água sanitária e etanol, e 1.000 ul para água / tampão.
   4. Durante as etapas de rubor, lave cada reagente para a SPO enquanto a válvula de saída LPO está definido para uma porta que está bloqueada, então vice-versa, para remover as obstruções potenciais nos limitadores de fluxo de saída. Manter as taxas de abstinência e de fluxo de infusão de 300-500 mL / min para minimizar a geração de bolhas na tubulação e contrapressão acúmulo quando quer o SPO ou o LPO está bloqueado.
   5. DISCArd as soluções de lavagem em excesso e os frascos em que eles recolhidos seguindo os procedimentos adequados para a gestão dos resíduos biológicos ou químicos.

Results

As principais características do projeto do dispositivo acústico-microfluídica estão em destaque na Figura 1, e descreveu completamente em outro lugar. ¹⁵ Em breve, side-by-side fluxo de duas correntes de fluido em um canal de separação, separado de um canal de desvio paralelo por uma parede de silicone fino. Uma vez que o módulo da força de radiação primária escalas com o volume de partículas, as partículas grandes migrar para fora do fluxo de entrada mista-amostra para o nó de pressão acústica localizados na corrente de fluido de recuperação adjacente, enquanto que as partículas pequenas permanecem na corrente original (Figura 1B, C). A arquitetura de dois canais subdividido melhora a separação de partículas ^{17 e} permite o ajuste da posição de nó utilizando diferentes fluidos do canal de derivação. ¹⁶ A placa de ensaio de fluidos e acessórios fornece uma plataforma robusta para o mundo de chip conexões, eo design modular permite a mudança rápida entre chips fluídicos (Figura 2). Este cONFIGURAÇÃO igualmente permite conexões de fluidos reversíveis, que vedam até 1.000 psi, a ser feita com rapidez e confiabilidade (Figura 2B, E).

Os ressonantes frequência f _res de um chip pode ser estimada utilizando cálculos analíticos 1D simples (Passo 1.1.1). A partir de um modelo de elementos finitos 2D mais completa da nossa secção transversal do dispositivo, a posição de focagem ¹⁶ esperado para a ressonância 2-nó é de 225 uM a partir da parede e a frequência esperada é 1,68 MHz. No entanto, f _res de dispositivos reais podem variar em ± 100 kHz, dependendo da temperatura de funcionamento e de ressonâncias de acoplamento longitudinal e lateral. Por conseguinte, após a montagem do dispositivo, _res de f deve ser verificado empiricamente a taxas de fluxo obtidas, assim como as tensões de accionamento piezoeléctrico, tal como descrito no Passo 4 do protocolo. A Figura 3 mostra as verificações frequência representativa tomadas a 200 ul / min, com água nos canais principais e de bypass, e 20 V _pp fornecido ao piezo. Quando o acoplamento entre o dispositivo de microfluidos piezo e é bom, as partículas irão concentrar firmemente na frequência de ressonância, o que resulta em um pico evidente na intensidade fluorescente e migração para a posição de focagem esperado (Figura 3A). Em contraste, quando não é pobre de acoplamento, as partículas não se concentrar bem e os resultados da análise de frequência será semelhante ao da Figura 3B. Em tais dispositivos, o transdutor piezo podem precisar de ser re-montado, se um adesivo reversível foi usado; caso contrário, este dispositivo não é adequado quando de alta qualidade de focagem ou de fluxo rápido são críticas para a aplicação desejada. Os dados da Figura 3 informar a escolha de frequência de operação para experiências posteriores, ea tensão e fluxo intervalo de taxa eficiente disponível para separação de partículas.

files / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
Figura 5. automatizado de processamento da amostra. (A) Esquema de amostra carregada na bobina amostra. (B) perfil de fluxo Representante de uma experiência de separação bem-sucedida. (C) Fluxo perfil a partir de uma separação executado durante o qual a tomada SPO obstruído em cerca de 220 ​​seg. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a identificação de fichas que são separadores eficazes, eles são incorporados no sistema ilustrado na Figura 4. Sistema de cilindrada total é minimizada por meio de um tubo com 0,01 "de diâmetro interior ao longo do caminho de fluxo principal (linhas azul). A Figura 5A ilustra a maquilhagem de um tampão de amostra típica infundido através do sistema. Uma pequena quantidade de "tampão líder" (~ 35 ul) é necessário para precede a amostra no fluxo para eliminar as flutuações de fluxo, enquanto a amostra se move através do chip separação. A Figura 5B mostra dados de fluxo resultantes a partir de uma experiência de separação acústica automatizado bem sucedido. As principais características de uma temporada de sucesso incluem: (1) um aumento transitório da taxa de fluxo, tanto no LPO e SPO como a pressão aumenta e líquido começa a fluir através do sistema, (2) um aumento acentuado indicando a passagem de uma bolha de ar (o inserção mostra um perfil expandido de uma única bolha), que devem ser recebidas pela SPO antes de LPO, devido ao fluxo desigual das duas saídas, (3) o fluxo estável através de ambas as saídas de entre as duas bolhas de ar medida que a amostra se move através do sistema, e (4) um decréscimo gradual na velocidade de fluxo em ambas as saídas depois o volume da amostra completa é fornecido ao sistema. Runs problemáticos são imediatamente aparentes a partir de perfis de fluxo semelhante ao da Figura 5C, onde parece que a SPO ficaram obstruídos depois de cerca de 220 ​​segundos. Em thi s caso, um procedimento de limpeza semelhante ao descrito no Passo 5.3 deve ser executado para desobstruir o canal.

Figura 6. Dispositivo tunability: dimensão das partículas e Efeitos de tensão. Percentagem de microesferas de poliestireno extraídos no POT depende do tamanho de partícula e a voltagem fornecida ao piezocerâmica. Cada linha corresponde a uma tensão de operação diferente na frequência de ressonância, determinada como descrito no Passo 4. caudal total através do aparelho é de 200 ul / min, com frequências de accionamento aplicados entre 1,62 e 1,64 MHz. As barras de erro representam o desvio padrão de pelo menos três experiências separadas. Reproduzido e modificado com permissão da The Royal Society of Chemistry de http://pubs.rsc.org / en / Content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 6 mostra compilados resultados de separação usando vários tamanhos de partículas de poliestireno e piezo condução tensões que demonstram os parâmetros operacionais necessárias para a separação eficiente. Em geral, as tensões mais elevadas (isto é, forças acústicas superiores) são necessárias para extrair as partículas menores, conforme o esperado. Tensões unidade não pode ser indefinidamente aumentada, no entanto, devido a maior dissipação de calor e os efeitos crescentes de transmissão acústica. ¹³ O enredo serve como um guia geral para tamanhos de partículas separação de partículas que mostram recuperação significativamente diferente a uma tensão unidade específica (por exemplo, 10 e partículas de 2 mícrons de 8,8 V _PP) vai separar bem. Em geral, as populações de partículas com uma grande diferença de tamanho, tais como os vírus (~ 100 nm) e as células (10 ~ ^ M) pode ser separado rápida e eficientemente, como podem as células de different tamanhos (por exemplo, 6-8 uM discoidais eritrócitos e leucócitos 8-15 uM). As condições específicas necessárias para trabalhar com outros tipos de células deve ser determinada empiricamente, tal como a forma da célula, a densidade e a compressibilidade afectar o seu contraste acústico, para além do tamanho das células. Para este fim, os procedimentos do Passo 4 são úteis para determinar as condições de separação utilizáveis ​​para qualquer nova célula ou tipo de partículas, e não apenas para avaliar a qualidade de um dispositivo acoustophoresis particular.

Figura 7. eficiência de separação de Cell-Virus amostras enriquecidas. Resultados de separação de (a) células Raji incrementadas com o vírus da dengue (DENV) e (B) células Raji e células de rim Boa enriquecida com Golden Gate Virus (GGV). Percentagens recolhidos são definidas como a fracção de vírus ou células que saem de uma determinadatomada em relação à quantidade total que sai do chip. As barras de erro para (A) são o desvio padrão de 3 ensaios, ao passo que as amostras em (B), apenas foram processadas uma vez que, devido às pequenas quantidades disponíveis. 1x PBS foi utilizado como o tampão de amostra de fluido e de recuperação, com água no canal de desvio para todas as experiências. Freqüências de operação de chips variou entre 1,60 e 1,64 MHz, com tensões de acionamento entre 16 e 20 V _pp. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para demonstrar a utilidade desta plataforma para a separação de partículas biológicas, que primeiro usou para processar amostras biológicas bem caracterizados: células Raji humanas (10 ⁵ células / ml, diâmetro médio de 8-10 mm ²⁵⁾ enriquecida com vírus da dengue (DENV, 10 ⁵ pfu / ml, diâmetro aproximado de 50 nm, ^26). Figura 7A mostra a percentagem de células Raji e DENV recolhidos tanto na SPO e LPO (definido como a fracção de cada tipo de partículas recolhidas a partir de cada ponto de comparação com a quantidade total de cada uma das partículas recolhidas a partir do chip). A experiência foi repetida em triplicado, e as células Raji foram quantificados utilizando um contador Coulter, enquanto DENV foi quantificada utilizando uma polimerase de transcrição reversa-reacção em cadeia quantitativa (qPCR-RT).

Em seguida, o desempenho do sistema foi testado num cenário que é mais realista para o processamento de amostras clínicas, em que as características físicas exactas das partículas podem ser desconhecidos, e as quantidades de amostra disponíveis são mais baixos. Aqui, nós avaliamos a separação do vírus golden gate-identificados recentemente (GGV), uma cobra patógeno infectando células de rim boa constrictor. ²⁷ O tamanho da partícula do vírus GGV ainda não foi medido, mas desde GGV pertence à família Arenaviridae, ele é susceptível de umtamanho semelhante, entre 100 e 150 nm. ²⁸ Nós processadas amostras com GGV cravado (10 ⁴ ufc / ml) em células Raji humanos (e não um alvo infecção para o vírus), e células boa renais (alvo infecção por GGV, tamanho aproximado 10 ²⁷ uM), com ambos os tipos de células em 10 ⁴ células / ml. Como estas amostras estavam disponíveis em pequenas quantidades, a separação resulte apenas uma corrida experimental são relatados neste trabalho. A Figura 7B mostra a percentagem de células Raji, células Boa, e GGV coletadas a partir do SPO e LPO. As células foram quantificados nestes experimentos por contagem num hemacitómetro e vírus foram quantificados por RT-qPCR.

Discussion

Este protocolo apresenta a integração em nível de sistema de dispositivos microfluídicos para equipamentos macroescala para executar o processamento automatizado amostra biológica. A modularidade desta plataforma permite que ele seja adaptável a qualquer dispositivo de fluxo contínuo, e, como um exemplo, o protocolo apresentado incide sobre a caracterização e optimização do desempenho de um dispositivo de separação de partículas acoustofluidic. Três grandes vantagens deste protocolo se destacam: (i) a modularidade e chip-to-world interface, (ii) caracterização robusta do desempenho do dispositivo, e (iii) tratamento automatizado de volumes de amostra precisamente calibrada para a separação de partículas.

Eu. Modularidade e chip-to-world interface

Como mostrado na Figura 2, o chip de microfluidos é montado sobre uma placa de ensaio personalizado para se adaptar facilmente para um estágio de microscópio de observação directa. A placa de ensaio contém # 6-40 UNF furos rosqueados em uma grade de 5 mm de passo, enabling do chip a ser protegido, e ligações de fluido a ser feita. As ligações de fluido são tubos PEEK com extremidades maquinadas, os quais vedam contra o chip fluídica com uma junta de vedação de borracha rosto e um colar de aço inoxidável. Este esquema interface torna fácil para a substituição chip e rápido redesenho dispositivo, exigindo poucas ou nenhumas alterações em outros componentes do sistema, pegadas de chips fornecidos estão de acordo com o formato da grade. Por exemplo, temos usado essa plataforma com chips microfluídicos para eletroforese de fluxo contínuo, a lise celular térmica, ²⁹ rápido mistura de reagentes para a síntese química, e captura de uma única célula e interrogatório.

II. Caracterização robusto de desempenho do dispositivo

A fim de optimizar o rendimento de qualquer dispositivo de separação de microfluidos, o seu funcionamento deve primeiro ser completamente caracterizado. O sistema descrito aqui apoia o desenvolvimento de protocolos rápidos e automatizados para fazer isso. Para o examp específicale de dispositivos acústicos, focando a qualidade focando, freqüência de operação e posição das partículas focados no canal microfluídico devem ser medidos para cada dispositivo individual. Estas medições exigem que varre através de uma gama de frequências de accionamento piezocerâmico, tensões e as taxas de fluxo, para identificar as combinações de parâmetros óptimos para a separação de alta qualidade. O protocolo apresentado varia automaticamente esses parâmetros ajustáveis ​​e captura o relevante de dados ou seja, imagens fluorescentes de partículas fluindo no canal que são pós-processados ​​para gerar as medições necessárias de partícula com foco qualidade, frequência e posição (Figura 3).

Caracterização completa do desempenho do dispositivo acústico exige repetir os passos 4.4 e 4.5, conforme necessário sob diferentes condições experimentais. Por exemplo, a posição de focagem absoluta de um chip é encontrado através da execução do varrimento de frequências com taxas relativamente baixas de fluxo e de alta tensãos para assegurar a migração completa para o local do nó. Além disso, essas varreduras de frequência podem avaliar a qualidade da montagem do dispositivo (quando executado com esferas de poliestireno de tamanho conhecido), ou para determinar como um tipo de partícula anteriormente desconhecido vai se comportar no sistema (após um chip tem sido caracterizada com contas). Um chip com boa transferência de energia do piezocerâmico ao canal microfluídico irá resultar em apertado concentrando a taxas de fluxo elevadas (> 1 mL / min) e as tensões baixas (12-15 V _pp), enquanto aqueles com baixa transferência de energia não incidirá mesmo a caudais baixos (<100 ul / min) e altas voltagens (> 20 V _PP). Verificou-se que o contacto íntimo entre o chip de microfluidos e o piezocerâmico é crítica para a transferência eficiente de energia para o fluido. Outras investigações do melhor método de ligação do chip microfluídico eo piezocerâmico vai permitir a produção confiável de dispositivos de alto desempenho.

Finalmente, uma completaimagem de operação de um dispositivo de acoustophoretic pode ser obtido através da combinação das medições de varrimento de frequências com base em imagens do passo 4 (e na Figura 3) com a contagem de partículas recolhidas a partir da SPO e LPO como funções dos parâmetros de funcionamento relevantes, a partir de experiências de separação realizadas com microesferas , tal como descrito no Passo 5. Como mostrado na Figura 6, uma tal série de experiências automatizados pode caracterizar-se rapidamente e tunability desempenho de um dispositivo individual, informando o utilizador do espaço de parâmetros óptima para operar o dispositivo para a separação das partículas.

iii. Processamento de pequena amostra automatizado de separação de partículas

Para o processamento da amostra baseada no chip microfluídico bem sucedida e precisa, é fundamental de forma confiável e com precisão do medidor, de carga, entregar e recolher os volumes de fluido à medida que passam. Esta precisão é especialmente importante quando o volume da amostra é pequeno(~ 0,1-1 ml), que é comum em ambientes laboratoriais clínicos ou de investigação. ³⁰ manuseamento da amostra é preciso um desafio, em experiências de microfluidos tradicionais que empregam retirada manual da amostra dentro de uma seringa e a perfusão num dispositivo sem realimentação de quando a amostra tem sido separados e quando ele deve ser recolhido. O protocolo apresentado emprega automatizado amostra bobina de carga e distribuição juntamente com feedback em tempo real a partir de sensores de fluxo para permitir separações reprodutíveis de pequenos volumes de amostras.

A Figura 5 mostra os perfis de fluxo medidos no SPO e LPO a partir de uma experiência típica de separação. Em primeiro lugar, levando tampão de pelo menos 35 uL é carregado para assegurar um fluxo estável antes de a amostra atinge o chip acústico. Os volumes de amostra inferiores a 100 uL não são recomendados para esta configuração do sistema, porque a diluição da amostra em função do tampão levando se torna excessiva. Um bujão de ar é utilizada no início do the o tampão de injecção antes levando a separar o bloco de amostras de fluido a partir do que se segue, impedindo a mistura e diluição da amostra e servindo como um indicador para os sensores de fluxo. Depois de um transiente inicial como fluido começa a se mover através do sistema, os sinais de aumento acentuado em ambos os outlets indicar a passagem da primeira bolha de ar. Estes transientes são seguidos por um longo período de fluxo estável como a amostra flui através do sistema, em seguida, um outro ponto quando a segunda bolha de ar passa, e, finalmente, uma eventual redução na taxa de fluxo para zero após a paragem da bomba de seringa.

A passagem dos plugues de ar através dos sensores de fluxo é usado como pontos de gatilho para alternar as válvulas para iniciar e parar a coleta de amostras, minimizando, assim, amostra perdida e diluição por volumes de fluido não-amostrais. Medição de circuito fechado de volumes de amostra transformados elimina a necessidade de re-programar estes valores antes do início da experiência, cada vez que a amostra de entrada é alterada. Esse recurso éparticularmente importante quando o volume de amostra é limitado, por exemplo, no caso de muitas amostras clínicas. Monitoração do caudal em tempo real também auxilia na solução de problemas; um funcionamento pobre (por exemplo, formando uma obstrução num dos pontos de venda) é imediatamente evidente a partir dos perfis de fluxo resultantes, como na Figura 5b.

Para demonstrar a flexibilidade e eficácia da separação acoustofluidic usando a arquitetura do sistema apresentado, DENV purificado e os lotes de vírus GGV foram incrementadas em ações celulares e separados por transformação através do chip microfluídico. Figura 7a mostra que as células Raji foram bem-separada do vírus, como 97 % de células Raji que saem do chip foram consideradas no POT, deixando assim uma amostra altamente enriquecida de DENV na SPO. Em comparação, a eficiência de separação foi DENV inferior, com 70% de DENV sair do chip encontrado na SPO. Isto pode ser atribuído a uma ligeira mistura convectiva induzida por as espiras do separatino canal, mas é mais provável que algumas partículas DENV migram juntamente com as células de Raji na LPO. As células que migram através de linhas de corrente arrastar lateralmente algum fluido com eles, mesmo a baixo número de Reynolds. Por este mecanismo, assim como a superfície de adsorção não específica, de partículas virais pode transferir para a LPO. No entanto, a amostra altamente enriquecida de DENV na SPO é um benefício significativo, por exemplo, quando de novo a sequenciação é utilizado para detectar e identificar vírus.

A Figura 7b mostra que, em um ensaio experimental, apenas cerca de 70% de células Boa que saem do chip foram encontrados no POT, em comparação com cerca de 100% de eficiência de separação de células Raji. A diferença de desempenho separação entre os dois tipos de células pode ser atribuível a uma dimensão média menor ou uma menor densidade de células Boa em comparação com células de Raji, por conseguinte, resultando em forças acústicas menores. Para confirmar ou refutar essas suposições, o tamanho, a densidade e morfologia de BoaAs células em suspensão (que normalmente crescem aderentes) das células Boa devem ser medidos com exactidão, num esforço para uma investigação mais aprofundada. Nas mesmas experiências, de modo semelhante às experiências com DENV, a maior parte do GGV recuperado saiu da SPO, indicando um enriquecimento da fracção viral.

Os dados apresentados destacam os desafios inerentes de engenharia plataformas amplamente aplicável para o processamento de uma variedade de amostras biológicas. Importante, as interações biológicas pode começar a desempenhar um papel tão grande como os efeitos físicos e mecânicos. No entanto, esses experimentos preliminares também demonstram o poder ea promessa de usar esta arquitetura de sistema para o processamento da amostra em aplicações clínicas e de pesquisa. Como um sistema robusto, bem caracterizada engenharia, esta plataforma oferece a capacidade de procurar respostas para novas perguntas científicas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiais necessários para as etapas 1-3: Projeto, fabricação e montagem do dispositivo
Wafer de silício polido de dupla face	Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, EUA	100 mm < 100>  wafer principal	1-20 ohm-cm, 495 ± 25  µ m Wafer de vidro polido de dupla face
	Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, EUA	100 mmx0,5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518	MicroChemicals GmbH, Ulm, Alemanha	AZ 1518	Photoresist usado para aderir wafer a wafer em branco para gravação DRIE
Photoresist, AZ 4620	MicroChemicals GmbH, Ulm, Alemanha	AZ 4620	PhotoResist para definir padrões fluídicos e por meio de máscara
DRIE plasma etcher	STPS, Newport, NP, Reino Unido		ICP Multiplex Advance Oxide Etch (AOE)
Wafer Bonder	Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Áustria	EVG 501
Serra de corte em cubos	Kulicke & Soffa Industries, Cingapura	K & Kit de epóxi S 982
	Tecnologia epóxi, Billerica, MA, EUA	EPO-TEK 301	Epóxi usado para acoplar chip piezo e microfluídico
PZT piezocerâmico	Piezo Systems, Woburn, MA, USA	PSI-5A4E	37.5 &vezes; 10 &vezes; 0.5 mm
28 AWG Fio sólido isolado com Kynar	Squires Electronics, Cornelius, OR, USA	UL1422
2-partes epóxi prateado	MG Chemicals, Surrey, BC, Canadá	8331	Adesivo condutor para fixação de fios condutores a PZT
L-edit	Tanner EDA, Monrovia, CA, EUA	Ledit v15.1 Software CAD de 64 bits	para layout de máscara
Materiais necessários para a Etapa 4: Caracterização do Desempenho de Foco Acústico
Bomba Dupla	, Holliston, MA, EUA	PHD ULTRA Series, 703007
5  ml seringas	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA	309646
Adaptador de porta Luer para Rosca	IDEX, Oak Harbor, WA, USA	P-659	Conecta seringa a tubulação
Union	IDEX, Oak Harbor, WA, EUA	P-623	Conecta conexões mundiais a chips a tubulação de fluoropolímero.  Também pode usar webbed
Virola 1/4-28 fundo plano	IDEX, Oak Harbor, WA, EUA	P-200	Usado com porca para fazer conexões entre tubulação e seringa, sensores de fluxo e hardware de mundo para chip
Porca  1/4-28 fundo plano	IDEX, Oak Harbor, WA, USA	P-202	Usado com ferrule para fazer conexões entre tubulação e seringa, sesnsores de fluxo e hardware de mundo para chip
Tubulação de fluoropolímero OD de 1/16"	IDEX, Oak Harbor, WA, EUA	1912L	Tubulação para conectar bombas de seringa ao mundo para conexões de chips.  O tamanho da tubulação não é crítico durante as etapas de classificação (.01-.03" ID normalmente usado, outros números de peça adequados: 1907L, 1902L).
Tubulação de fluoropolímero de pequeno diâmetro interno	IDEX, Oak Harbor, WA, EUA	1476-20	Usado para restritores de fluxo: 0,006" ID, 1/16" OD FEP
Tubulação			Conecta-se do chip à tubulação de fluoropolímero.
Ventilador de resfriamento	Multicomp, Leeds, Inglaterra	Gerador de funções MC19663
	Agilent, Santa Clara, CA, EUA	33220A
Amplificador de RF	ENI, Rochester, NY	325	LA Deve ser capaz de amplificar sinais de < 1  V no intervalo de 1-2  MHz para 25  Vpp ao piezo.
Câmera Fotométrica CCD	, Tucscon, AZ, EUA	CoolSnap HQ
	Zeiss, Oberkochen, Alemanha	Axiovert S100
FITC	Chroma Tech, VT, EUA	SP101
Objective, 10X	Zeiss, Oberkochen, Alemanha	Osciloscópio ACHROPLAN
Tektronix, Beaverton, OR, EUA		TDS3014B	Para monitorar a saída de tensão pelo amplificador de RF
MatLab	Mathworks, Natick, MA, EUA	R2014a
Software de interface de driver para integrar a câmera Photometrics com o software LabVIEW	R Cubed, Lawrenceville, NJ, EUA	SITK
Tween 20	Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, EUA	P9416
Dragon Green Fluorescente 5.76 ou 7.32  µ m Beads	Bangs Laboratory, IN, EUA	FS06F
Materiais adicionais necessários para a Etapa 5: Separação Automatizada
Válvulas multiportas	VICI, Houston, TX, EUA	C25Z-3180EUHA	Na configuração atual, são necessárias 4 válvulas
Sensores de Fluxo	Sensirion, Westlake Village, CA, EUA	SLI-1000
Tubo de fluoropolímero, .01 e .03" ID	IDEX, Carvalho Porca	preferida PFA de alta pureza	1902L e 1912L
	VICI, Houston, TX, EUA	ZN1PK-10	Usado com ponteira para fazer conexões entre tubos e válvulas. Números de peça alternativos: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule	VICI, Houston, TX, USA	ZGF1PK-10	Usado com porca para fazer conexões entre tubulação e válvulas.
LabVIEW	National Instruments, Austin, TX, EUA	Sistema de desenvolvimento profissional LabVIEW	Software de automação de laboratório
PBS	Teknova, Hollister, CA, EUA	P0200
Raji Cells	ATTC, Manassas, VA, USA	CCL86
Boa Cells			Gentilmente fornecido pelo DeRisi Laboratory na UCSF
GGV			Gentilmente cedido pelo Laboratório DeRisi da UCSF
DENV			Gentilmente cedido por Jose Pena em LLNL
Coulter Counter Z2	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Z2
	Fisher Scientific, Waltman, MA, EUA	0267151B