Customizado aparelho de aquecimento à base de laser para lançamento acionado de cisplatina de termossensível lipossomas com Ressonância Magnética Orientação Imagem

Resumo

Aparelho de aquecimento de uma ressonância magnética compatível customizado à base de laser tem sido desenvolvido para proporcionar aquecimento local dos tumores subcutâneos, a fim de activar os agentes de libertação de lipossomas termossensíveis especificamente na região do tumor.

Resumo

Os lipossomas têm sido utilizados como sistemas de entrega de droga para atingir os tumores sólidos, através da exploração da permeabilidade aumentada e retenção (EPR) efeito resultando em reduções significativas na toxicidade sistémica. No entanto, a liberação insuficiente de medicamento encapsulado a partir de lipossomas tem limitado a sua eficácia clínica. Lipossomas sensíveis à temperatura foram manipuladas para proporcionar uma libertação específica de sítio do fármaco a fim de ultrapassar o problema de tumor limitada biodisponibilidade da droga. O nosso laboratório concebeu e desenvolveu uma formulação activado pelo calor termossensível lipossomas de cisplatina (CDDP), conhecido como HTLC, para proporcionar a libertação desencadeada de CDDP em tumores sólidos. Fornecimento activado por calor in vivo foi conseguido em modelos murinos utilizando um aparelho de aquecimento a laser integrado personalizado que fornece um padrão de aquecimento conformada no local do tumor, como confirmado por MR termometria (MRT). Um dispositivo de monitorização de temperatura de fibra óptica foi utilizado para medir a temperatura em tempo realdurante todo o período de aquecimento com ajustamento de entrega de calor on-line, alternando a potência do laser. Entrega da droga foi optimizado sob ressonância magnética (MR) imagem orientação por co-encapsulação de um agente de contraste para RM (ou seja, gadoteridol) juntamente com CDDP nos lipossomas termossensíveis, como um meio para validar o protocolo de aquecimento e para avaliar a acumulação tumoral. O protocolo de aquecimento consistiu de um período de pré-aquecimento de 5 minutos antes da administração de HTLC e 20 min de aquecimento pós-injecção. Este protocolo resultou em libertação aquecimento eficaz dos agentes encapsulados com o maior sinal MR mudança observada no tumor aquecido, em comparação com o tumor sem aquecimento e músculo. Este estudo demonstrou a aplicação bem sucedida do aparelho de aquecimento a laser para o desenvolvimento pré-clínico e lipossomas termossensível a importância da validação MR-guided do protocolo de aquecimento para a otimização de entrega da droga.

Introdução

A fisiopatologia de tumores sólidos resultados na permeabilidade aumentada e retenção (EPR) de sistemas em nano-escala. Isto levou ao desenvolvimento de muitos sistemas de distribuição de drogas que tiram proveito deste efeito para atingir o tecido de tumor ao mesmo tempo minimizando os efeitos secundários sistémicos ^1. Entrega tecnologias lipossomal têm sido amplamente investigadas por drogas ou de imagiologia sondas ^2. Embora os lipossomas reduziram significativamente a toxicidade sistémica comparado com a quimioterapia convencional, houve poucas melhorias em ^3,4 eficácia clínica. Estudos têm mostrado que a eficácia é limitada devido à falta de libertação do fármaco a partir do transportador ^4,5. Como resultado, o desenvolvimento de lipossomas que são activados para libertar o fármaco encapsulado em resposta a estímulos externos tem atraído uma atenção considerável. Hipertermia tem sido utilizada há décadas como uma modalidade de tratamento relativamente seguro para pacientes com câncer ^6. Por conseguinte, a desenvolvermento de lipossomas termossensíveis com calor como um gatilho externo tem sido uma combinação lógica com potencial significativo para a tradução clínica. De facto, a formulação de lipossoma contendo lisolípido termossensível da doxorrubicina, conhecido como LTSL-DOX, chegou agora a avaliação clínica ^7.

Dados clínicos recentes com LTSL-DOX mostrou que o protocolo de entrega de calor é um factor importante que pode influenciar fortemente os resultados dos pacientes ^8. Nos seres humanos, radiofreqüência, microondas, laser e ultra-som transdutores são usados ​​para aplicar hipertermia localmente nos locais de tumor ^9. Em estudos pré-clínicos que necessitam de aquecimento de tumores subcutâneos, cateteres de aquecimento ^10,11 e ^12,13 banhos de água são mais freqüentemente empregadas. Neste manuscrito, nós introduzimos um novo método para aquecimento de tumores subcutâneos usando uma configuração de aquecimento projetado baseado em laser, o que permite um aquecimento mais conformada do volume do tumor. Usando ma compatível MRteriais, a configuração é pequeno o suficiente para caber dentro do furo de um pequeno gerador de imagens MR animal, permitindo o monitoramento das mudanças na temperatura do tecido em tempo real durante o aquecimento a laser.

O agente de contraste MR, gadoteridol (Gd-HP-DO3A), foi co-encapsulados com CDDP em uma formulação lipossomal termossensível de CDDP (HTLC), conhecido como Gd-HTLC, monitoramento e avaliação de calor em tempo real guiadas imagem MR liberação da droga -activated e validação do protocolo de aquecimento. Os nossos resultados demonstram que o aparelho de aquecimento a laser activada eficazmente a libertação de agentes encapsulados a partir da formulação de Gd-HTLC enquanto está a ser monitorizado através de ressonância magnética.

Protocolo

1. Preparação de Lipossomas

1. Dissolve-se os lípidos 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-estearoil-2-hidroxi- sn-glicero-3-fosfatidilcolina (MSPC ou S-liso-PC) e N - (carbonil- methoxypolyethyleneglycol 2000) -1,2-distearoyl--sn-glicero-3-fosfoetanolamina (mPEG ₂₀₀₀ -DSPE) em clorofórmio. Por exemplo, para a preparação de 10 ml de HTLC, pesam-se 314,4 mg de DPPC, 39,4 mg MSPC, e 83,9 mg de mPEG ₂₀₀₀ -DSPE em um frasco de vidro âmbar. Em seguida, dissolve-se os lípidos em 2 ml de clorofórmio e aquece-se o frasco durante 30 segundos num banho de água a 60 C °.
2. Remover o clorofórmio utilizando um evaporador rotativo. Coloque a película de lípido resultante sob a alta pressão de vácuo S / N.
3. Para 10 ml de HTLC, hidratar o filme de lípidos com 5 ml de tampão Tris 0,1 N (pH 7,4) durante 1 h. Ao mesmo tempo, pesam-se 162,4 mg de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG) lípido em pó e 100 mg de CDDP e hidrato Wom 5 ml de tampão Tris a 0,1 N contendo 30% de etanol (pH 7,4) durante 1 h.
4. Para a formulação de Gd-HTLC, pesam-se a mesma quantidade de lípido DPPG e 10 mg de CDDP em pó, em seguida hidratado com 2,5 ml de solução de Gd-HP-DO3A (279,3 mg / ml) com 2,5 ml de tampão Tris a 0,1 N contendo 30% de etanol ( pH 7,4) durante 1 h. Durante a hidratação, as misturas devem ser mantidos em frascos âmbar e colocado numa placa de aquecimento a 70 ° C com agitação constante e vórtex a cada 10 min.
5. Combinar a mistura de lípidos e a mistura de lípidos de drogas, e novamente hidratar durante 1 h. Vortex cada 15-20 min.
6. Montar a extrusora de 10 ml com duas pilhas de 200 nm filtros de policarbonato. Ligue o Thermobarrel do extrusor a um banho de circulação de água a 70 ° C, e ligar o extrusor a um tanque de azoto comprimido.
7. Imediatamente após a hidratação, transferir a mistura para dentro da câmara do extrusor. Abra o fluxo de azoto (para ajustar a pressão de 200 psi) para fazer a extrusão dos lipossomas através das membranas. Recolher o Liposomes em um tubo de 50 ml. Manter o tubo num banho de água quente (70 ° C) em todos os momentos durante o processo de extrusão. Repita este processo 5 vezes.
8. Desmonte a extrusora e mudar para duas pilhas de 100 nm filtros de policarbonato. Remontar o extrusora e ajustar a pressão de 400 psi. Repita a Etapa 5, excepto expulsar os lipossomas 10 vezes. Recolha da amostra a partir da extrusão final para um tubo de 15 ml.
9. Arrefecer os lipossomas até à TA, e centrifugar a 1000 xg durante 3 minutos para precipitar a CDDP insolúvel.
10. Dialisar os lipossomas S / N com 0,9% de soro fisiológico em tubagem de diálise com um corte de peso molecular de 15000 (MWCO) sob condições estéreis.
11. Dilui-se 10 ul de lipossomas em 990 ul de água destilada. Use dispersão dinâmica da luz para medir a distribuição do tamanho de HTLC e Gd-HTLC. Faça 3 medições com 10 corridas cada.
12. Dilui-se 40 ul de lipossomas em 3.960 mL de água destilada. Faça 5-6 soluções-padrão de platina e gadolíniona gama de concentrações de 0,1 a 20 ug / ml. Medem-se as concentrações de platina e gadolínio usando indutivamente acoplado espectrómetro de emissão atómica de plasma (ICP-AES) em 3 diferentes comprimentos de onda. Faça 3 medições em cada comprimento de onda para o resultado da média.
13. Determinar o gel até à temperatura líquida de fase cristalina de transição _(Tm) da formulação de lipossomas HTLC utilizando um calorímetro de varrimento diferencial (DSC). Carga de 5-10 mg de HTLC numa panela de DSC e utilizar um recipiente vazio como uma referência. Usar uma velocidade de varrimento de 5 ° C / min a rampa até a temperatura de 0 ° C a 60 ° C.
14. Enrole os lipossomas em papel de alumínio para evitar a exposição à luz e armazenar a 4 ° C.

2. Em lançamento vitro a partir de lipossomas

1. Prepare colunas de giro.
   1. Incubar 50 g de grânulos de filtração em gel em 400 ml de 0,9% de soro fisiológico à temperatura ambiente durante 3-4 h. Role-se um pedaço de lã de vidro, molhados com solução salina 0,9% e colocá-lo na ponta de uma seringa de 1 ml. Pressionar a lã de vidro para encher aproximadamente 0,05-0,1 mL da seringa. Usar uma pipeta de vidro para adicionar gradualmente cerca de 1 ml de meio de filtração em gel para a seringa.
   2. Colocar a seringa para um tubo de 15 ml e centrifugar a 1000 xg durante 3 min. Remova a coluna giro e colocá-lo em um tubo de 15 ml.
2. Amostra 400 uL de HTLC ou Gd-HTLC em 8 1-dram frascos de vidro e incubar em banho de água de temperatura controlada a 37 ° C quer a 42 ° C ou. Retire um frasco em cada ponto de tempo (isto é, 5, 15, 30 e 60 min) e colocá-la imediatamente em gelo.
3. Adicionar 100 ul de solução salina a 0,9% para a coluna de centrifugação preparado, em seguida, adicionar 100 ul de HTLC ou Gd-HTLC antes da incubação (controlo) ou após a incubação em banho de água para dentro da coluna de spin. Centrifugar a 1.000 xg durante 3 min. Remover a seringa do tubo e diluir a solução no tubo para a análise ICP-AES.

3. Implantação de subcutânea Xenoenxerto do colo do úteroTumor

1. Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com protocolos de uso de animais aprovados pelo Comité de Animal Care da University Health Network (UHN).
2. Executar todas estudos com animais em uma cabine de segurança biológica (BSC). Autoclave todas as ferramentas cirúrgicas antes de qualquer cirurgia. Depois de cada cirurgia, limpe as ferramentas cirúrgicas com 70% de etanol e esterilizar novamente usando um esterilizador talão quente.
3. Por eutanásia, colocar o animal em uma CO ₂ câmara de isolamento, em seguida, executar deslocamento cervical.
4. Para anestesia geral, utilizando 100% de oxigênio, utilizar 5% de isofluorano para indução e 2% para a manutenção. Para assegurar a profundidade da anestesia, aplicar pressão com uma pinça para a superfície palmar da pata observar resposta animal. Aplique lubrificante ocular para evitar a secura sob anestesia.
5. Para um animal que foi submetido a cirurgia, colocar o animal em uma gaiola limpa sem a companhia de outros animais. Monitore até que a consciência é suficiente recuperou.
6. CulturaO Me-180 células em meio essencial mínimo alfa-(α-MEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) e antibióticos.
7. Colher as células e manter as células em meio completo antes da inoculação. Contar as células usando um hemocitômetro.
8. Inocular cada camundongo doador de suportar uma intramuscular (im) ME-180 (células de câncer cervical humano) do tumor.
   Nota: Crescimento no local im foi selecionado a fim de garantir o desenvolvimento de tumores vascularizados bem. Compra SCID fêmea (com idade de 6-8 semanas, aproximadamente 20 g) a partir de uma instalação de criação de animais in-house.
   1. Anestesiar um rato SCID fêmea e injectar 1 x 10 ^{6 Me-180} em células do músculo do gastrocnémio de membro posterior utilizando uma agulha de 27 G.
   2. Medir o tamanho do tumor utilizando um calibrador até os tumores atingiram 9-12 mm na sua maior dimensão. Terminar o estudo, se o tumor ultrapassou 12 mm, ou se a massa do tumor compromete a ingestão normal de comportamento, deambulação, comida e água.
9. Peças tumorais implante de murganhos dadores em ratinhos receptores.
   1. Anestesiar um rato doador usando 5% de isofluorano. Euthanize o mouse usando deslocamento cervical sob anestesia. Remover o tumor a partir do doador rato dador. Cortar o tumor em fragmentos cúbicos de 2-3 mm ^3.
   2. Anestesiar um rato destinatário usando 5% de isofluorano. Injectar 100 ul de 0,5 mg / mL de meloxicam subcutaneamente antes da cirurgia. Aplicar a solução de iodo cirúrgico esfrega, em seguida etanol a 70%, solução de iodo e, por último, a pele raspada. Raspar o membro posterior esquerdo do mouse destinatário. Faça uma incisão no nível da pele. Insira um doador pedaço do tumor por via subcutânea através da incisão. Feche a incisão utilizando 1-2 clipe (s) ferida.
   3. Remover os clipes de 3-5 dias após a implantação. Tumor subcutâneo é necessário para usar o aquecimento com base na configuração de laser.
   4. Permitir que os tumores crescer durante 2-3 semanas antes do tratamento de aquecimento.

4. Concepção, AssemCalibração bly e de uma entrega Iluminador Laser para Conformal In Vivo Aquecimento

1. Atingir o aquecimento dos tecidos utilizando um laser de diodo 763 nm acoplado a um iluminador conformada utilizando uma fibra óptica.
   1. O iluminador fornece iluminação a laser superficial uniforme do tumor xenoenxerto. É composto por um milímetro bloco de material altamente reflectora contendo três luz adjacente integrando esferas câmara com uma câmara no meio (16 mm de diâmetro) e 2 pequenas câmaras de ambos os lados (16 mm de comprimento e 5 mm, 30 x 20 x 17 de diâmetro) (Figura 1).
   2. Para que a passagem de luz a partir de uma câmara para a outra, com dois pequenos furos de 5 mm de diâmetro foram cortadas entre as pequenas câmaras exterior e o compartimento central maior. A luz é entregue a partir do laser para as câmaras exteriores 400 um usando uma fibra cortada-extremidade ligada ao laser, que é passada para dentro da câmara através de um orifício de 600 um de diâmetro.
   3. Devido à natureza da luz interaction com as paredes da câmara, de luz entregue a uma das câmaras pequenas espacialmente é homogeneizado em seguida, passa através das portas de interior para dentro da câmara maior onde é adicionalmente homogeneizada espacialmente. Luz em seguida, sai da porta de 10 mm de diâmetro na câmara intermédia.
2. Calibrar a entrega luz do iluminador com relação ao ajuste de potência do laser usando um NIST calibrado 50 milímetros esfera de integração para medir a potência fornecida.
   1. Calcula-se a distribuição da luz no tumor utilizando simulações de Monte Carlo com base em uma geometria simplificada do tumor. Gerar o código Monte Carlo em um algoritmo personalizado escrito com um pacote de software computacional comercial e de base sobre o código padrão de modelagem de Monte Carlo de transporte de luz em tecidos com múltiplas camadas de Jacques et al. ^14.
   2. Modelo do tumor como um hemisfério encontra-se na pele uma linha plana com um diâmetro correspondente à dimensão do tumor média de 7 mm na superfície da pele e um eleight de 5 mm. Iluminação homogênea modelo da superfície, lançando aleatoriamente fótons em todo o hemisfério expostos e directa, ao centro da esfera.
   3. Use propriedades ópticas incluindo a absorção, u _{a =} 0,025 milímetros ^-1, dispersão, μ _s = 10 ^{milímetros-1,} fator de anisotropia, g = 0,9 e índice de refração, n = 1,4. Use um milhão de fótons no cálculo.
   4. Execute estas medidas antes de quaisquer experimentos de aquecimento in vivo sem modificações adicionais após a calibração inicial.

5. Conformal Aquecimento de Tumor usando Custom-projetado Setup Câmara Laser

1. Conectar uma extremidade de uma fibra do laser para o dispositivo laser e a outra extremidade para o iluminador.
2. Anestesiar o animal utilizando 5% de isofluorano. Inserir um cateter de 27 G injecção na veia lateral da cauda do rato. Inserir um cateter de 22 G para o centro do tumor. Coloque uma temperatura pr fibra ópticaobe no cateter oco para monitorar a mudança de temperatura.
3. Cobrem todo o tumor com o iluminador (Figura 2). Primeiro defina o poder de 0,8-1 W. Ligue o laser e esperar que a temperatura subir. Manter a temperatura do tumor a 42 ° C, ajustando manualmente a potência do laser entre 0,1-0,8 W.

6. Temperatura Distribuição avaliada através de termometria RM (MRT)

1. Medir a distribuição da temperatura do tumor aquecido usando a configuração de aquecimento à base de laser através de deslocamento de frequência de ressonância do protão (FRP-shift) MRT em um sistema de ressonância magnética pré 7 Tesla ^{15 em} conjunto com as medições de temperatura da sonda de fibra óptica.
2. Adquirir imagens de termometria em intervalos de 10 segundos, utilizando uma sequência de impulsos 2D-FLASH (tempo de eco 4,5 ms, tempo de repetição 156,25 ms) com 312 x 312 ^ M no plano resolução e 2 mm de espessura de corte numa única fatia ao nível da fibra óptica temperatura proser.

7. MR Monitoramento de agente de liberação

1. Execute _T 1 imagens ponderadas antes e 20 min após a administração de Gd-HTLC.
2. Dois tumores implante, um em cada um dos membros posteriores, de um ratinho SCID fêmea usando o método descrito acima na Secção 3 para a implantação. Pré-aqueça o tumor no membro posterior esquerdo durante 5 min a 42 ° C antes da injecção de Gd-HTLC a uma dose de 66,3 mg / kg de Gd-HP-DO3A e 1,4 mg / kg de CDDP, em seguida, aquecer o tumor por um adicional de 20 min pós-injecção. Realizar injecção durante o tratamento de aquecimento. Utilizar o tumor na pata traseira direita como um controlo não aquecida.
3. Adquirir imagens de RM dinâmicas (36 x 20 mm campo de visão, 200 x 200 mm no plano de resolução, espessura de corte 2 milímetros; protocolo seqüência MR) para monitorar liberação Gd-HP-DO3A em intervalos de 12 seg para toda a 20 min administração cargo de Gd-HTLC, começando 30 segundos antes da injeção.
4. Contorno do tumor (aquecida e não aquecida) e volumes musculares.Calcula-se a média do sinal MR de todos os voxels dentro de cada volume com contornos.

Resultados

Os lipossomas são fabricados HTLC utilizando métodos comuns, incluindo a formação do filme de lípidos, hidratação, extrusão e diálise. Durante as etapas que envolvem a CDDP, deve ser tomado cuidado para não expor a CDDP para qualquer material de alumínio, como a CDDP irá ser desactivado através da formação de um depósito de preto. Uma ilustração de HTLC é mostrado na Figura 3. As propriedades físico-químicas de HTLC foram resumidos num manuscrito, recentemente publicado no Jour...

Discussão

Os lipossomas foram desenvolvidos na década de 1960 como veículos de distribuição de drogas que transportam drogas hidrofílicas em seu volume aquoso interno e fármacos hidrofóbicos dentro de sua bicamada lipídica ^2. Além disso a utilização em aplicações terapêuticas, os lipossomas têm sido exploradas para aplicações de diagnóstico quando marcados com radionuclidos ou carregado com agentes de contraste de imagem ^17. Nos últimos anos, theranostics e pares terapêuticos-diagnóstico têm sido buscadas pa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Evaporador rotativo	Heidolph Instruments GmbH & Co.KG	Laborota 4000
Extrusora de alta pressão	Northern Lipids Inc.	T.001	Termosquetato de 10 ml
VWR	International LLC.	11305	Conectado à extrusora
Filtro de membrana de policarbonato	Whatman	110605;
Calorímetro de varredura diferencial (DSC)	TA Instruments	Q100
Espectrômetro de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-AES)	PerkinElmer	Optima 7300DV
Zetasizer	Malvern Instruments Ltd.	Incubadora de células Nano-ZS
	NuAire Inc.	NU-5800
Aplicador de clipe de ferida Autoclip	Becton Dickinson	427630
Removedor de clipe de ferida Autoclip	Becton Dickinson	427637
Clipes de ferida	Becton Dickinson	427631	9 mm
763 nm Dispositivo a laser	Biolitec	Ceralas CD 403 Laser
Sonda a laser	Thorlabs Inc.	FT400EMT	Com SMA e conectores de clivagem plana
Spectralon (iluminador)	Labsphere Inc.	FAST-SL-5CMX5CM
		CSTM-SL-5CMX5CM
Sistema de imagem de ressonância magnética (MR) pré-linear de 7 Tesla	Bruker Corporation	Biospec 70/30
Sensor de temperatura de fibra óptica	LumaSense Technologies Inc.		de laboratório Luxtron FOT
Esfera de integração	Newport Corporation	819C
Medidor de potência óptica	Newport Corporation	1830-R