Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral

Resumo

Demonstramos a fabricação, calibração e propriedades de dois tipos de microeletrodos seletivos de íons (de cano duplo e concêntricos) para medição de concentrações de íons no tecido cerebral. Estes são então usados na preparação da fatia do hipocampo de camundongos para mostrar que a atividade excitatória altera as concentrações extracelulares de potássio e sódio.

Resumo

A atividade elétrica no cérebro é acompanhada por fluxos iônicos significativos através das membranas, resultando em mudanças complexas na concentração extracelular de todos os íons principais. Como esses deslocamentos iônicos têm consequências funcionais significativas, sua determinação quantitativa é frequentemente necessária para entender a função e a disfunção das redes neurais em condições fisiológicas e fisiopatológicas. No presente estudo, demonstramos a fabricação e calibração de microeletrodos íon-seletivos de barril duplo, que provaram ser excelentes ferramentas para tais medidas no tecido cerebral. Além disso, os chamados microeletrodos seletivos de íons "concêntricos" também são descritos, que, com base em seu design diferente, oferecem uma resolução temporal muito melhor de mudanças rápidas de íons. Em seguida, mostramos como esses eletrodos podem ser empregados em preparações agudas de fatias cerebrais do hipocampo de camundongos. Usando microeletrodos seletivos de potássio de cano duplo, são demonstradas alterações na concentração extracelular de potássio ([K⁺]_o) em resposta à aplicação exógena de agonistas do receptor de glutamato ou durante a atividade epileptiforme. Além disso, ilustramos as características de resposta de eletrodos sensíveis ao sódio, de duplo cilindro e concêntricos e comparamos a detecção de alterações na concentração extracelular de sódio ([Na⁺]_o) evocadas pelo banho ou aplicação de pressão de drogas. Essas medições mostram que, embora as amplitudes de resposta sejam semelhantes, os microeletrodos concêntricos de sódio exibem uma relação sinal-ruído e tempo de resposta superiores em comparação com o design de cano duplo. Geralmente, os procedimentos demonstrados serão facilmente transferíveis para a medição de outras espécies de íons, incluindo pH ou cálcio, e também serão aplicáveis a outras preparações.

Introdução

A sinalização elétrica no cérebro é baseada no fluxo de íons através das membranas plasmáticas. Os principais movimentos iônicos de e para o espaço extracelular não são apenas mediados pela passagem por canais iônicos dependentes de voltagem, mas também por receptores ionotrópicos pós-sinápticos, bem como transportadores de íons. A atividade neuronal é, portanto, acompanhada por mudanças complexas na concentração extracelular de todos os íons principais ¹. Por exemplo, o influxo de sódio nos neurônios durante a atividade excitatória demonstrou resultar em uma diminuição na concentração extracelular de sódio ([Na⁺]_o) ². O mesmo vale para a concentração extracelular de cálcio porque os íons de cálcio entram rapidamente nas estruturas pré e pós-sinápticas ³. Ao mesmo tempo, o potássio se move na direção oposta e isso medeia um aumento na concentração extracelular de potássio ([K⁺]_o) na faixa de mM baixo ^4,5. A atividade sináptica também causa alterações no pH extracelular que são parcialmente mitigadas por fluxos concomitantes da membrana glial que alteram o pH intraglial ^6,7. Essas mudanças relacionadas à atividade nas concentrações de íons extracelulares têm consequências funcionais significativas. Por exemplo, mesmo pequenos aumentos em [K ⁺] _o despolarizam neurônios, bem como células gliais, alterando assim a excitabilidade neuronal, e existem vários mecanismos para remover o excesso de potássio ⁸. A falha destes pode resultar em atividade epileptiforme dos neurônios ou fenômenos como depressão disseminada ¹.

Devido à sua importância crítica, a determinação quantitativa das concentrações de íons extracelulares é frequentemente necessária e exigida para entender a função e a disfunção das redes neurais em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Durante décadas, microeletrodos seletivos de íons de barril duplo provaram ser excelentes ferramentas para tais medições no tecido cerebral ⁹. Para muitos íons, sensores altamente específicos com baixa reatividade cruzada para outros íons estão disponíveis. Além dos eletrodos clássicos de barril duplo, os chamados eletrodos concêntricos foram introduzidos recentemente. Estes últimos fornecem uma resolução de tempo superior, mas levam um pouco mais de tempo e esforço para construir ¹⁰.

A seguir, descreveremos a preparação e calibração desses dois tipos de microeletrodos seletivos de íons. Em seguida, mostramos como esses eletrodos podem ser empregados em preparações de fatias cerebrais para medição de mudanças em [K⁺]_o ou [Na⁺]_o induzidas por atividade excitatória seguindo diferentes paradigmas de estimulação, incluindo banho e aplicação de drogas sob pressão.

Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade Heinrich Heine de Düsseldorf, na Alemanha, bem como a Directiva da Comunidade Europeia do Conselho (86/609 / CEE). Todos os experimentos foram comunicadas e aprovadas pelo Escritório do Bem-Estar Animal da Facilidade Animal Care e Uso da Universidade Heinrich Heine de Düsseldorf, Alemanha (número ato institucional: O52 / 05). De acordo com o Animal Welfare Act Alemã (Tierschutzgesetz, os artigos 4 e 7), sem aprovação formal adicional para a remoção post-mortem do tecido cerebral era necessário.

1. Preparação de Microeletrodos íon-seletivo de cano duplo

1. Preparar dois capilares de vidro de borosilicato com filamento: um com um comprimento de 7,5 cm e um diâmetro exterior de 1,5 mm para ser utilizada para o tambor sensível aos iões, e um com um comprimento de 6,5 cm e um diâmetro exterior de 1,0 mm para o posterior barril de referência.
2. Limpe o capil laries em acetona durante 12 horas e, em seguida, lavar várias vezes com abs. etanol e deixe-os secar. Os eléctrodos podem agora ser armazenado num exsicador.
3. Use cola de dois componentes ou uma pequena tira de papel de alumínio para fixação de uma longa e uma curta capilar juntos em ambas as extremidades. Aquece-se a dupla capilar num forno a 60 ° C durante 1 h. Isto acelera o processo de cura. Armazenar os eléctrodos agora num exsicador.
4. Centralize o duplo capilar em um puxador vertical com um mandril revolvable. Aquece-se a bobina suavemente até que o vidro é macio o suficiente para permitir uma rotação horizontal do mandril revolvable por 180 °. Durante este passo, impedir o alongamento do tubo capilar com um calço sob o mandril.
5. Após arrefecimento, remover a quebra mecânica e aplicar um segundo protocolo de aquecimento para puxar para fora do capilar, resultando em dois capilares, dois canos afiados (Figura 1). O diâmetro da ponta de um duplo-capilar deve ser próximo a 1 um.

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Figura 1. Arquitetura de microeletrodos de íon-seletivo. (A) A fotografia de um microeletrodo de cano duplo. Para fins de ilustração e uma melhor visibilidade, o líquido dentro do barril de referência foi tingida. (B) Fotografia de um microeletrodo concêntrico eo eletrodo de referência correspondente. A ponta de microeléctrodos concêntrica é mostrada ampliada na sua esquerda. Em (A) e (B), o espaço ocupado pelo sensor de iões nas pontas das pipetas é pós-colorido. No fundo, o arranjo ponta de ambos os tipos de eléctrodos está representado esquematicamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Se um puxador vertical com chuck revolvable não está disponível, prepare um íon-selec cano duplotiva de microeletrodos em um puxador horizontal usando teta de vidro.
   1. Para este fim, puxar teta de vidro (diâmetro externo de 1,5 mm, comprimento 7,5 cm) para resultar em dois eléctrodos com dois barris cada. Mark um deles servir como o cano referência futura. Silanizada outro semelhante com o procedimento descrito abaixo para servir como o barril selectivo de iões futuro.
      NOTA: Durante a preparação de eletrodos teta-de vidro duplo de cano é muito mais fácil do que a preparação de eletrodos de dois canos retorcidos, eles são mais propensos à ação cruzamento entre os dois canos como a parede de vidro que separa fina entre eles tende a ser porosa em o seu melhor ponta.
      Observação: Uma vez que o sensor de cocktail (ver abaixo) é hidrofóbico, a superfície interior do tambor sensível aos iões posterior deve ser tornada hidrofóbica bem como por um processo chamado de silanização. Para isso, hexametildissilazano (HMDS) é utilizado (Figura 2), tal como descrito no passo seguinte.

Figura 2. Silanização de pipetas. (A), hexametildisilazano (HMDS) reage com os grupos Si-OH da superfície de vidro interior e torna-o hidrofóbico. (B) A fotografia da esquerda mostra toda a unidade de silanização. Um frasco de boca larga contendo HMDS é colocado no topo de uma placa de aquecimento para 40 ° C. No topo da garrafa, um suporte (PH) que transporta os capilares (PAC) é montado. A fotografia mostra uma ampliação direito do suporte da pipeta (PH) que transporta os capilares (PAC). (C) vista lateral esquemática dos suportes de pipetas feitos sob medida (PH) para (direita) capilares de cano duplo (esquerda) ou concêntricos (PAC), montados em um frasco de boca larga. Por favor clique aqui para ver uma versão maior este valor.

7. Pouco antes de pueletrodos enchendo, encher aprox. 20 ml HMDS em um frasco de boca larga. Atenção: HMDS é para uso em apenas um exaustor, os vapores são perigosos para a saúde! Fechar o frasco e colocá-lo em uma placa de aquecimento, programada para 40 ° C. Pré-aqueça um forno, colocado sob o capô, bem como, de até 200 ° C.
8. Encher o barril de referência até a sua ponta com água destilada para impedir a sua silanização durante o procedimento a seguir.
9. Coloque capilar de dois canos, com a ponta para cima, um suporte especial feito por encomenda (Figura 2B, 2C). A extremidade aberta sem corte deve chegar livremente através do fundo do suporte (Figura 2C, esquerda). Depois, coloque o suporte para a garrafa de boca larga contendo os HMDS pré-aquecido por 70 min.
   NOTA: Certifique-se de que o vapor de HMDS pode fluir livremente através dos capilares. Durante um processo de silanização, 20 ml de HMDS não evaporar completamente, e a garrafa pode, assim, ser usado várias vezes.
10. Afterwards, transferir os capilares a um suporte de metal e para dentro do forno pré-aquecido por duas horas. Isto irá secar ambos os barris.
11. Depois de silanização, manter os capilares seco até o uso. Enquanto o primeiro procedimento requer cerca de 3,5 horas no total, os eléctrodos podem agora ser armazenado num exsicador durante várias semanas.
12. No dia da sua utilização experimental, preparar os eléctrodos selectivos de iões, preenchendo a ponta do tambor silanizada com 1-2 ul do sensor selectivo de iões (Figura 1A). Para microeléctrodos sensíveis ao potássio, utilizar a valinomicina transportador; e para microeletrodos sensíveis ao sódio, utilize ETH 157 como operadora.
13. Observa-se que o sensor selectivo de iões é bastante viscoso tornando difícil para a ponta de encher adequadamente.
14. Encher o barril de referência com solução salina tamponada com HEPES (ver abaixo).
    Nota: Durante a outra, mais simples salina iso-osmótica podem ser usados, assim, é preferível utilizar uma solução salina cuja composição é essencialmente similar aa solução salina de perfusão (ACSF, ver 3.6.), pois pode vazar e penetrar no tecido durante as experiências. Portanto, é também essencial que este salina não contém uma concentração mais elevada de ião de ser determinado que o ACSF utilizado.
15. Backfill o sensor com uma solução salina que contém uma alta concentração do ião a ser detectado. Assim, aterrar o sensor com solução salina NaCl 100 mM (para microeletrodos sensíveis ao sódio) ou KCl 100 mM (para microeletrodos sensíveis ao potássio). Certifique-se de não inserir bolhas de ar adicionais durante este procedimento.
16. Se a silanização foi bem sucedido e o sensor é preenchido correctamente, observar a superfície do sensor de formar uma superfície côncava claramente visível contra o aterro (Figura 1A). Caso contrário, o sensor pode ter retraído a partir da parede do capilar e a ponta não será preenchido. Tais eléctrodos não irá ser funcional.
17. Insira fios de prata clorados em ambos os barris (cuidado para não tocar no sensor) e selar cada barril com cera dental (Figura 1A).

2. Preparação de Concentric íon-seletivo Microeletrodos

1. Para o cilindro exterior, utilizar capilares de vidro de paredes finas com filamentos (2.0 mm de diâmetro externo) e um comprimento de 7,5 cm. Para o cilindro interior, ter capilares de paredes finas com filamento, um diâmetro exterior de 1,2 mm e um comprimento de 10 cm.
2. Limpe os capilares em acetona durante 12 horas. e em seguida, lavar várias vezes com abs. etanol e deixe-os secar. Os eléctrodos podem agora ser armazenado num exsicador.
3. Encha aprox. 20 ml HMDS em um frasco de boca larga. CUIDADO! HMDS é para uso em apenas um exaustor, os vapores são perigosos para a saúde. Fechar o frasco e colocá-lo em uma placa de aquecimento, programada para 40 ° C. Pré-aqueça um forno, colocado sob o capô, bem como, de até 200 ° C.
4. Inserir o capilar 2,0 milímetros em um puxador horizontal e puxe-a para resultar em capilares com velas curtas e uma Diame pontaTer de ~ 4 uM (Figura 1B).
5. Coloque puxado para fora-2.0 mm capilar com a ponta para cima de um feito por encomenda, suporte especial (Figura 2B, Figura 2C), de modo que a sua extremidade romba se abre para a cavidade do frasco (Figura 2C, à direita). Depois coloque este suporte para a garrafa de boca larga contendo os HMDS pré-aquecido por 70 min. Certifique-se de que o vapor de HMDS pode fluir através de todos os capilares.
6. Em seguida, transferir os capilares a um suporte de metal e para dentro do forno pré-aquecido por duas horas.
7. Depois de silanização, manter os capilares seco até o uso. Enquanto o primeiro procedimento requer cerca de 3,5 horas no total, agora armazenar os eléctrodos num exsicador durante várias semanas.
8. Imediatamente antes da utilização, preencher uma pequena quantidade de sensor (0,2 ul) para o capilar silanizada (Figura 1B).
9. Para preparar o capilar interior, inserir um capilar de pequeno diâmetro para o extrator e puxe a resultar em doiscapilares com velas longas e afiadas pontas (Figura 1B). Encha com NaCl 100 mM (microeletrodos sensíveis ao sódio) ou KCl 100 mM (microeletrodos sensíveis ao potássio) solução salina.
10. Coloque o sensor e encheu-o capilar cheio de soro fisiológico directamente em linha com o outro em uma rolha de compilação personalizada feita a partir de lamelas. Inserir o capilar menor um curto caminho para o capilar maior.
11. Corrigir os capilares para outra lamela usando massa de modelar, a transferência para o palco de um microscópio e visualizar usando aumento de 100x. Com a ajuda de uma vareta de vidro que é montado em um micromanipulador e rodando o disco fino da fase do microscópio, avançar lentamente o exterior sobre o capilar capilar interna até que a distância entre as pontas fica a cerca de 5 uM (Figura 1B).
12. Fixar a extremidade aberta do capilar exterior para o interior capilar utilizando cera dental. Como alternativa, aplique uma pequena gota de cianoacrilato (Crazy Glue) instead de cera.
    NOTA: A adição de uma pequena gota de água irá polimerizar a cola e fixar os eletrodos no lugar. Insira um fio de prata clorada para o barril interior e selá-lo com cera dental (Figura 1B).
13. Para preparar o eletrodo de referência, tomar um 7,5 cm de comprimento capilar com filamento e um diâmetro exterior de 1,5 mm e retire com um puxador vertical. Certifique-se de que as pontas são relativamente longa, mas não muito acentuada (ponta diâmetro ~ 1 mm).
14. Descartar a pipeta superior, abra o mandril inferior e levante a pipeta inferior em cerca de 5 mm. Feche o chuck novamente e levante-o até que a ponta do eletrodo inferior é posicionado cerca de 5 mm acima da bobina de aquecimento. Aquece-se a bobina e utilizar uma pinça para dobrar a ponta de cerca de 45 ° para o lado. Lower pipeta cerca de 1-2 mm. Curvatura de novo por cerca de -45 ° para dirigir a ponta para trás em paralelo ao eixo principal (Figura 1B). Este procedimento é necessário para permitir que o próximo posicionamento da ponta do REFERÊnce eletrodo ao eletrodo concêntrico.
15. Encher o barril de referência com solução salina tamponada com HEPES (ver abaixo), inserir um fio de prata clorada e selar o barril com impressões dentárias (Figura 1B).

3. Salines

1. Prepare salina para aterramento de eletrodos sensíveis ao potássio (ver 1.15.) Compostas de KCl 100 mM. Salina para aterro de eléctrodos sensíveis sódio é composta por 100 mM de NaCl.
2. Preparar solução salina para aterro de barris de referência (. Solução salina tamponada com HEPES, ver 1,16) é composto por (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 2 _MgSO4, 1,25 NaH _{2 PO 4,} e 25 de HEPES, titulada com NaOH para se obter um pH de 7,4.
3. Preparar solução salina para a calibração de eléctrodos sensíveis ao potássio são compostas de HEPES 25 mM e um total de NaCl e KCl 150 mM, pH ajustado para 7,4 com NMDG-OH (N-metil-D-glucamina). Aqui, a calibração foi realizada com soluções salinas contendo 1, 2, 4 ou 10 mMKCl; ACSF continha KCl 2,5 mM (Figura 5).
4. Prepare salina para calibração de eletrodos sensíveis ao sódio da seguinte forma; (em mM) 25 de HEPES, 3 de KCl, com um total de 160 de NaCl e NMDG-Cl, pH ajustado para 7,4 com NMDG-OH. Execute a calibração com solução salina contendo (em mM) 70, 100, 130 ou 160 NaCl; ACSF continha NaCl 152 (Figura 6).
5. Para a determinação de reacção cruzada do sensor com outros iões, por exemplo., PH, preparar soluções salinas de calibração com concentrações de iões adicionais fixas, mas variando o pH.
   NOTA: Embora este procedimento não é demonstrado no presente estudo, por favor, deve referir-se ao trabalho anteriormente desenvolvido abordar esta questão (por exemplo, ^11,12).
6. Prepare fatias agudas do tecido do cérebro em solução salina composta por (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 _de CaCl2, 6 _de MgCl2, 1,25 NaH _{2 PO 4,} 26 _NaHCO3, e 20 de glucose, borbulhado com _95% de O2 e 5 % de CO _2, o que resulta num pH de7.4.
7. Realizar experiências em fatias de cérebro em fluido cerebroespinal artificial (ACSF) composto por (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 1,25 NaH _{2 PO 4,} 26 _NaHCO3, e 20 de glucose, borbulhar com 95 % de O ₂ e 5% de CO2, o que resulta num pH de 7,4.
8. Para a estimulação dos neurônios e células gliais, preparar soluções contendo 0,2, 0,3, 0,4 ou 0,5 mM de glutamato ou 10 mM L-aspartato dissolvido em ACSF. Para a aplicação de pressão, dissolver 10 mM de glutamato em solução salina tamponada com HEPES.
9. Prepare pipeta de aplicação para aplicação de pressão. Inserir capilares de vidro de paredes finas com filamentos (2.0 mm de diâmetro externo) e um comprimento de 7,5 cm na horizontal e extrator puxe para resultar em um diâmetro da ponta de ~ 1 uM.
10. Para a indução da atividade epileptiforme, preparar ACSF livre de magnésio contendo 10 mM bicuculina metiodeto.
11. Para inibir a geração de potenciais de ação, preparar um estoque solut 10 mMion de tetrodotoxina (TTX) em água destilada. Durante as experiências, a TTX é directamente adicionado ao ACSF para resultar numa concentração final de 0,5 uM.
12. Para evitar a activação de receptores de AMPA, preparar uma solução de estoque 50 mM de ciano-nitroquinoxalina-diona (CNQX) em sulfóxido de dimetilo (DMSO). Durante as experiências, este é adicionado directamente à ACSF para resultar numa concentração final de 100 uM.
13. Para bloquear a activação dos receptores do NMDA, preparar uma solução de estoque 50 mM de amino-fosfonopentanoato (APV) em 70 mM de _NaHCO3. Durante as experiências, este é adicionado directamente à ACSF para resultar numa concentração final de 100 uM.

4. A calibração de microeletrodos íon-seletivo

1. Calibrar microeléctrodo selectivo de iões directamente antes e após cada experiência.
2. Anexar eletrodos para micromanipuladores e inseri-los em uma câmara experimental perfusão-ACSF, colocada sob um microscópio estéreo (Figura 3 g>, 4). Colocar o eléctrodo de referência dentro da pré-câmara (Figura 4A, B). Ligar o banho de perfusão, assegurar que o fluxo é de cerca de 2 ml / min.

Figura 3. O espaço de trabalho experimental. O equipamento de gravação é composto por uma mesa de vibração amortecida-carregando a fase x / y-translacional com o banho experimental, os micromanipuladores, e um estereomicroscópio com elevada qualidade óptica. O microscópio estéreo também é equipado com uma câmera CCD para fins de documentação. Além disso, um dispositivo de aplicação de pressão para a aplicação da droga focal é utilizado. Os eletrodos de registro são acopladas através do estágio cabeça para um amplificador diferencial. Os dados digitalizados (conversor A / D) é registrado com um computador. O banho de perfusão é realizada por uma micro bomba peristáltica (não mostrada).> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Ligue o conversor A / D, o amplificador diferencial e o computador e iniciar o software de gravação (Figura 3, 4). Como a resistência dos barris sensíveis aos iões é muito elevado (10-20 GÊ; ver abaixo), usar um amplificador de especial electrómetro com alta impedância de entrada (R = 10 _em TΩ) e uma pequena corrente de polarização _(bias I = 50 FA - 1 pA).

Figura 4. eletrônicos e design espacial da montagem experimental. (A) Representação esquemática do arranjo gravação. As pontas de um microeléctrodo de cano duplo (azul) e um microeléctrodo concêntrico (vermelho) estarem dispostos num banho experimental cheio com solução salina. O eléctrodo de referência está indicado esquematicamente banho. O poten TiAl detectado pelos barris selectivos de iões (V ₁₎ é composto de potencial do campo eléctrico (V _ref) e o potencial de ião _(ião V), ao passo que os barris de referência (V ₂₎ detectam somente V _ref. Para isolar _ião V, V _{ref é} subtraído V _{1 por meio de} um amplificador diferencial (DA). (B) Topografia da fase experimental com uma microeletrodos concêntrica no lugar. O centro da fase experimental consiste no banho experimental contendo a preparação fatia. Para fundamentar o banho, o banho de eletrodo de referência é submerso na pré-câmara que também abriga a entrada de perfusão. O próprio palco é fundamentada por um conector de terra separado. O microeletrodos concêntrica e seu eléctrodo de referência são realizadas por detentores de pipeta separadas impulsionado por micromanipuladores. Microeletrodos e eletrodo de referência são acoplados eletronicamente para o palco principal do amplificador."target =" _ blank e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Conectar fios de prata clorada para as respectivas entradas do estágio cabeça do amplificador diferencial (Figura 4). Determinar as resistências dos eletrodos. Assegure-se que a resistência do tambor de referência situa-se entre 30-100 mohms e a resistência do tambor sensível aos iões situa-se entre 10-20 GÊ.
5. Ajuste sinais de tensão para zero e iniciar a gravação.
6. Note-se que o potencial detectada pelos barris selectivos de iões (V ₁₎ é composto pelo campo eléctrico potencial (V _ref) e o potencial de ião _(ião V), ao passo que os barris de referência (V ₂₎ detectam somente V _ref. Para isolar _ião V, V _{ref é} subtraído V _{1 por meio de} um amplificador diferencial (DA) (Figura 4A).
7. Após a obtenção de uma linha de base estável,interruptor para salines de calibração contendo concentrações definidas do ião a ser medido.
   NOTA: A Figura 5A mostra a calibração de um microeletrodo de cano duplo sensível ao potássio. Na Figura 6A, a calibração de tanto um cano duplo, bem como um microeléctrodo sensível a ^Na + concêntrica é mostrado. Enquanto nós não descrevem o procedimento aqui, note que as possíveis interferências com outros íons devem ser testados antes de usar um ionóforo específico (ver também 3.4.).

Figura 5. Calibração de microeléctrodos de cano duplo de potássio-selectiva. (A) Alteração na tensão do barril de referência _(Vref) e de ^K + -potential (V _{K +)} em resposta a alterações na concentração do banho ^de K + ( ^[K +] _b) como indicado. (B) Meio-logarithmic enredo de [K ^+] _{b versus} V _{K +.} A trama linear dos dados revela uma inclinação de cerca de 56 mV. Para fins de ilustração, os traços foram suavizadas com um filtro Sawitzky-Golay (largura 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Determinar a resposta de tensão do barril selectivo de iões, em resposta a uma alteração na concentração de iões conhecido. Os dados do gráfico em uma única parcela logarítmica (Figura 5B, 6B) e determinar a inclinação. Um sensor ideal segue uma relação descrita pela equação de Nernst (ver por exemplo ^13):

V: medido potencial do eléctrodo;
V _0: potencial de eléctrodo padrão, por exemplo, para um fio-AgCl a uma temperatura de 298,15 K e a uma pressão parcial de 101,325 kPa (absoluta)
R: constante dos gases (8,314 joules / grau Kelvin / mole)
T: temperatura absoluta (em Kelvin)
z: carga no íon (+ 1 para potássio e sódio)
F: constante de Faraday (96.500 coulombs)
C ': concentração do ião extracelular
C '': concentração de iões intracelular

Para fins práticos, e o logaritmo natural são convertidos para o declive s Nernst que é então válida para um determinado ião e temperatura:

NOTA: Para eléctrodos potássio e de sódio, uma resposta ideal do sensor de tensão, assim, apresenta uma inclinação linear de cerca de -58 mV a RT. Alguns deste desvio pode ser aceite (Figura 5B, 6B). É essencial, no entanto, que as características de resposta de um determinado eléctrodo não altere de forma significativa (mais de 10%, ver abaixo) antes e depois de uma experiência.

Figura 6. Calibração de microeletrodos de sódio seletivo e comparação de dois canos com eletrodos concêntricos (A) traça Top:. Mudança na tensão dos barris de referência _(ref V) de um eletrodo de cano duplo (traço preto pontilhado) e uma eléctrodo concêntrico (cinzento traços) em resposta a alterações na concentração do banho ^de Na + ^([Na +] _b) como indicado. Note-se que as respostas de tensão de ambos os eléctrodos são virtualmente idênticas. Traços inferiores: Alterações na tensão ^da Na + -potential (V _{Na +)} de um eléctrodo de cano duplo (traço preto) e um eléctrodo concêntrico (cinzento traços) em resposta a alterações na ^[Na +] _b. (B) parcelas Half-logarítmicas de ^[Na +] _b versus o V _{Na +} de ambos os eletrodos. Parcelas lineares dos dados revelam uma inclinação de cerca de 48 mV para ambos os eléctrodos.(C) Resposta da V _{Na +} de uma (traço preto) de cano duplo e um eletrodo concêntrico (cinza trace) para uma rápida mudança na [Na ^+] _b de 152 mm para 70 mm. Note-se que o tempo de resposta do eléctrodo concêntrica é significativamente mais rápido. Para fins de ilustração, os traços foram suavizadas com um filtro Sawitzky-Golay (largura 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Determine o tempo de resposta dos eléctrodos, o que depende do diâmetro da ponta, a forma da ponta, bem como da espessura da fase do sensor na ponta do eléctrodo.
   NOTA: microeletrodos sensíveis ao sódio Neste experimental configurar e empregando uma mudança rápida entre diferentes salinas de perfusão (câmbio concluídas na ponta do eletrodo dentro de 500 ms), de cano duplo alcançou um potencial estável dentro de 9,7 ± 4,5 segundos quandocomutação de 152 mM a 70 mM de ^[Na +] (n = 6). Dentro da mesma configuração, microeletrodos de sódio sensíveis concêntricos chegou a um potencial estável dentro de apenas 0,8 ± 0,3 seg (n = 6) (Figura 6C). Isto realça a resolução de tempo superior concêntrico em relação ao micro-eléctrodos de cano duplo.

5. Dissecção da Tissue

1. Para a geração de fatias aguda, anestesiar ratos de dias pós-natais 16-20 com CO ₂ e rapidamente decapitado (seguindo a recomendação da Comissão Europeia, publicado em: A eutanásia de animais experimentais, Luxemburgo: Serviço das Publicações Oficiais das Comunidades Europeias, de 1997; ISBN 92-827-9694-9).
2. Preparar fatias de hipocampo de tecido (espessura de 250 um), seguindo um procedimento padrão (ver por exemplo ^14).

6. Procedimentos Experimentais

1. Transferir uma fatia na câmara experimental e corrigi-lo com umagrade.
2. Diminuir o microeléctrodo selectivo de iões calibrada na superfície da fatia e empalar o stratum radiatum da região CA1 a uma profundidade de cerca de 50 um com o eléctrodo.
   NOTA: Tocando a superfície fatia com a microeletrodos leva a oscilações características no barril sensível-ion. Além disso, o dano às células durante empalação do tecido provoca flutuações bem. Aguarde até que linha de base tenha se estabilizado.
3. Por aplicação de pressão de agonistas do transmissor, preenchem uma pipeta de aplicação com o composto (por exemplo, glutamato 0,5 mM). Fixe a pipeta para um micromanipulador e acoplá-lo a um dispositivo de aplicação de pressão.
4. Baixa pipeta de aplicação para o tecido e coloque-o cuidadosamente na proximidade da ponta do microeléctrodo selectivo de iões (~ 20-40 mm). Comece aplicação de pressão (por exemplo, 10 seg, 40 mbar) e variações de tensão registro como monitorados pelo microeletrodos íon-seletivo.
5. Para a aplicação do banho de drogas, interruptorcoceira entre os diferentes salinas de perfusão por um período definido.
6. Para encerrar o experimento, retirar cuidadosamente o microeletrodos íon-seletivo do tecido e gravar qualquer desvio em potencial do valor original zero que pode ter ocorrido durante períodos de gravação prolongados.
7. Remover preparação fatia do banho e executar uma segunda calibração do microeléctrodo selectivo de iões.
   NOTA: Isso é necessário porque a ponta do eletrodo pode ficar obstruído durante o seu movimento através do tecido. Assim, é essencial para assegurar que o eléctrodo ainda responde adequadamente a alterações nas concentrações de iões. As experiências deve ser rejeitado se a resposta do eléctrodo para uma mudança de dez vezes na concentração de ião caiu por mais de 10%. Bem-eléctrodos de trabalho pode, em princípio, ser re-utilizado em diversas experiências. Isto é especialmente verdadeiro para os eléctrodos concêntricos, que pode até durar vários dias. É essencial, no entanto, que os procedimentos de calibragem são revem ser repetidas antes e depois de cada experiência única para garantir o bom funcionamento dos eletrodos.

Análise 7. Dados

1. Para converter a tensão de resposta do eléctrodo selectivo de iões a alterações na concentração do ião extracelular, primeiramente converter equação 2 para determinar a mudança no potencial _{de iões} AV (mV) como se segue (aqui demonstrado para K ⁺ sensível a eléctrodos, procedimento análogo para aplica ^Na + sensível a eléctrodos):

V _{K +:} mudanças no potencial do barril valinomicina (mV)

s: Inclinação Nernst

^K +] _B: concentração de linha de base de potássio (no nosso caso 2,5 mM ^K +)

K ^+] _o: mudanças na [K _^+] o durante a experiência

2. Calcular a média aritmética das pistas derivadas das parcelas individuais logarítmicas of a calibração antes e depois da experiência (ver Figura 5B, 6B; ver ponto 4.8) para recuperar "s".
3. Para calcular mudanças que o [K ^+] _{o (Δ} [K ^+] _o, em mM), reorganizar a equação 3 a:

Resultados

Para monitorar [K ^{_+] o} e modificações das mesmas, em resposta a actividade excitatória, um microeléctrodo de cano duplo de potássio-selectivo foi inserido no estrato radiante de CA1 área. Poucos minutos depois empalação, o barril selectivo de iões do eléctrodo alcançado uma linha de base estável (Figura 7A), que corresponde a uma [K ^{_+] o} de cerca de 2,8 mm, um valor perto da ^[K +] do ACSF utilizado ( 2,5 mM). Aplicação do banho de glutamato 0,5 mM durante 10 seg induziu um aumento reversível na [K ^{_+] o} por cerca de 4 mm, seguida por uma subestimativa abaixo da linha de base no valor de ~ 0,7 mM (Figura 7A). A redução da concentração de glutamato a 0,4, 0,3, e 0,2 mM provocou uma redução correspondente na amplitude de ambos o aumento transitório e a subestimativa em [K ^{_+] o} (Figura 7A).

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Figura 7. transientes extracelular de potássio em resposta a actividade excitatória. (A) [K ^{_+] o} transientes, que consiste em um aumento seguido por uma subestimativa abaixo da linha de base, induzida por aplicação de banho de diferentes concentrações de glutamato durante 10 seg, como indicado. (B) Influência de uma perfusão com bloqueadores de receptores de glutamato (100 ^ M, CNQX; APV, 100 uM) e tetrodotoxina (TTX; 0,5 uM) em [K ^{_+] o} transientes induzida por aplicação de banho de glutamato 0,5 mM, durante 10 seg. (C) espontânea [K ^{_+] o} transientes na presença de 0mg ²⁺ / BIC. Experimentos mostrados na AC foram realizadas utilizando eletrodos de dois canos. Para fins de ilustração, os traços foram suavizadas com um filtro Sawitzky-Golay (largura 20). Por favor, click aqui para ver uma versão maior desta figura.

Experiências anteriores mostraram que tais [K ^+] sinais _{de o} induzida por glutamato não são alterados de forma significativa durante a aplicação da TTX, e são, portanto, em grande parte independente sobre a abertura de canais de sódio voltagem-dependentes e ação neuronal potencial de geração de ^15,16. Para estudar os mecanismos subjacentes às observadas [K ^{_+] o} mudanças em resposta ao glutamato, aplicou-se bloqueadores de receptores de glutamato, ou seja, CNQX (100 uM; bloqueador de receptores AMPA) e APV (100 uM; bloqueador de receptores de NMDA) na presença de TTX (0,5 ^ M). Após a perfusão de banho com esses bloqueadores, induzida por glutamato [K _^+] o mudanças foram praticamente abolidas, confirmando a sua dependência em relação à abertura de canais de receptores de glutamato ionotrópicos como relatado anteriormente (por exemplo, ^17; Figura 7B).

Para demonstrar ainda mais o tele relevância glutamatérgica de excitação para a geração de matriz extracelular ^[K +] sinais, fatias foram perfundidos com solução salina nominalmente ^Mg2 + -livre contendo 10 uM metiodeto de bicuculina ⁽²⁺ 0mg / BIC). Isto alivia a tensão dependente de ^Mg2 + de receptores NMDA -bloco e atenua a inibição bloqueando os receptores de _GABA A, fazendo com que a actividade epileptiforme recorrente espontânea na rede (por exemplo, ^18,19). Como esperado ^20, espontâneo, recorrente [K _^+] o transientes, no valor de cerca de 1,5 mM foram detectados em 0mg ²⁺ / salina BIC (Figura 7C). Entre essas respostas, menor [K ^{_+] o} transientes com uma amplitude média de cerca de 0,2 mM ocorreu (Figura 7C).

Em um segundo conjunto de experimentos, usamos ^[Na +] microeletrodos sensíveis ao determinar ^[Na +] _{• mudanças} evocadas pela aplicação deagonistas de glutamato. Aqui, nós também comparou as características de resposta de microeletrodos de cano duplo e concêntricas que empregam dois paradigmas de aplicação diferentes. ^[Na +] microeléctrodos sensíveis ao foram posicionados no stratum radiatum, a uma profundidade de cerca de 50 uM. Depois de uma linha de base estável foi alcançado, o agonista de glutamato L-aspartato foi aplicado por perfusão de banho (10 mM, 120 sec, banho de perfusão a 2,5 ml / min). Como observado anteriormente ^21, a aplicação de aspartato causou uma diminuição lenta na [Na _^+] o por cerca de 15 mM, que durou cerca de 5 minutos e, em seguida, começou a se recuperar de volta à linha de base (Figura 8A). Nomeadamente, enquanto as amplitudes de pico e a cinética dos sinais de [Na ^{_+] o} determinado por ambos os eléctrodos eram virtualmente idênticos sob estas condições, os eléctrodos concêntricos exibiu uma linha de base mais estável e um nível de ruído mais baixo (Figura 8A).

Para testar o r esposta características dos diferentes eléctrodos sob um paradigma aplicação mais rápida, que o glutamato-pressão aplicada por meio de uma pipeta de vidro fina posicionada no estrato radiante a uma distância de 20-40 uM a partir da ponta do microeléctrodo selectivo de iões. Como esperado ^21, a aplicação de glutamato (10 mM) durante 200 ms causou uma queda no ^[Na +] _{o (Figura} 8B). As amplitudes de pico de ^[Na +] _O decréscimo estavam no mesmo intervalo para ambos os tipos de eléctrodos (cano duplo: 4,5 - 13,5 mM, n = 14; concêntrica: 2,0 - 19,1 mm, n = 15). No entanto, em contraste com os resultados obtidos com a perfusão de banho lento (ver acima), não só a relação de sinal-para-ruído, mas também do curso de tempo dos sinais de [Na ^{_+] o} detectados pelos dois tipos de eléctrodos diferiram significativamente. O tempo médio de pico foi de 3,5 seg para a apenas 1,3 seg de cano duplo e para os micro-eléctrodos concêntricos.

homólogos ve_content "> Assim, estes resultados demonstram e confirmam a cinética de resposta mais rápidos de Na ⁺ microeléctrodos selectivos duplos de cano concêntricos vs, (cf. Figura 6C e 8B), como também foi observado por ^Ca2 + e pH selectivos ¹⁰ . Em contraste com o estudo anterior, em que a estimulação sináptica curto-burst foi realizada para evocar transientes de iões rápido induzidas-sinapticamente, houve apenas uma tendência, mas não houve diferença significativa em amplitudes de pico médias entre eléctrodos concêntricos e dois canos com a nossa aplicação paradigma. Isto foi provavelmente devido ao facto de a distância da pipeta de aplicação a partir da ponta do microeléctrodo selectivo de iões variou por um factor de dois (20-40 uM), e, consequentemente, que a concentração máxima de glutamato na região alvo não foi a mesma em diferentes experiências, obstruindo qualquer diferença existente em amplitudes de pico.

(A) Top traça: Mudança na voltaGE dos barris de referência _(VREF) de um eléctrodo de cano duplo (traço pontilhado preto) e um eléctrodo concêntrico (cinzento traços) em resposta a alterações na concentração do banho ^de Na + ^([Na +] _b) como indicado. Note-se que as respostas de tensão de ambos os eléctrodos são virtualmente idênticas. Traços inferiores: Alterações na tensão ^da Na + -potential (V _{Na +)} de um eléctrodo de cano duplo (traço preto) e um eléctrodo concêntrico (cinzento traços) em resposta a alterações na ^[Na +] _b. (B) parcelas Half-logarítmicas de ^[Na +] _b versus o V _{Na +} de ambos os eletrodos. Parcelas lineares dos dados revelam uma inclinação de cerca de 48 mV para ambos os eléctrodos. (C) Resposta da V _{Na +} de uma (traço preto) de cano duplo e um eletrodo concêntrico (cinza trace) para uma rápida mudança na [Na ^+] _b de 152 mm para 70 mm. Note-se que o tempo de resposta do eléctrodo concêntrica é significativamente FASter. Para fins de ilustração, os traços foram suavizadas com um filtro Sawitzky-Golay (largura 20).

Figura 8: transientes de sódio extracelulares como detectado por eletrodos de cano duplo e concêntricos.
(A) alterações transitórias da V _ref e [Na ^_+] o induzida por perfusão banho com 10 mM aspartato, durante 120 segundos, como indicado pelo bar. Os traços superiores mostram uma gravação executada com um eléctrodo de cano duplo, os traços inferiores foram registados utilizando um eléctrodo concêntrica. (B) as alterações transitórias em V _{ref e} ^[Na +] _O induzidas por aplicação local de pressão com glutamato 10 mM durante 0,2 segundos, tal como indicado pela seta. Os traços superiores mostram uma gravação executada com um eléctrodo de cano duplo, os traços inferiores foram registados utilizando um eléctrodo concêntrica.Linhas vermelhas pontilhadas representam ajustes lineares de o período entre o início do sinal para o seu máximo. Note-se que o tempo de resposta do eléctrodo concêntrica é significativamente mais rápido sob esta condição. Para fins de ilustração, os traços foram suavizadas com um filtro Sawitzky-Golay (largura 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Líquido à base de transportadora, eletrodos íon-seletivo têm sido empregados com sucesso por décadas e por muitos íons, sensores altamente específicas estão disponíveis ^22-26. Quando usado no espaço extracelular (ECS) de preparações de cérebro de vertebrados, deve-se ter em mente, no entanto, que esta é uma técnica bastante invasivos: enquanto a largura da ECS é apenas cerca de 20-50 nm, o diâmetro de íon-seletivo microeletrodos é cerca de 1 um (eletrodos dois canos) ou maiores (eletrodos concêntricos). As pontas de microeletrodos íon-seletivo, assim, não só irá danificar o tecido durante o seu empalamento do tecido, mas também ampliar o ECS, favorecendo uma subestimação dos transientes de íon. Apesar dessas armadilhas, transientes de iões extracelulares em resposta à atividade neuronal são notavelmente consistentes entre os diferentes laboratórios de ^7,8, que atestam a confiabilidade desse método.

O desempenho e adequação dos eletrodos íon-seletivoé dependente da sua sensibilidade e selectividade, que é definida pelo sensor de cocktail ('ionóforo membrana líquida') utilizado. Sensor cocktails conter uma molécula transportadora especial, por exemplo, valinomicina ^para K + microeléctrodos selectivos que apresenta uma elevada selectividade para a ²⁷ potássio. Não obstante, a reactividade cruzada com outros iões podem ocorrer e deve ser testado. Valinomicina apresenta uma reactividade cruzada significativa nas pesquisas de amónio, que tem que ser considerado na interpretação dos resultados (por exemplo, ^11,12). Além disso, porque a resposta de tensão dos ionóforos segue um comportamento Nernstiana (cf. equação 1), a relação sinal-ruído e limiar de detecção dependem da concentração do ião a ser medido. Assim, enquanto os pequenos [K _^+] o transientes evocar grandes variações de tensão contra a baixo da linha de base [K ^+] _o, pequeno [Na _^+] o transientes são muito mais difíceis de detectar contra o oiGH basal ^[Na +] _{o (cf.} Figura 5 e 6).

O desempenho dos eléctrodos selectivos de iões também é determinada pela resolução temporal, o que é fortemente regulado por a sua constante de tempo eléctrica. O último é principalmente determinada pela resistência axial do sensor, e pela capacitância distribuída ao longo do comprimento da pipeta, entre as suas soluções internas e o fluido externo. Na configuração de cano duplo, a resistência é alta, devido à longa coluna de sensor de ião de enchimento. Para um dado dieléctrica isolante (neste caso, vidro de borosilicato), a capacitância é governada pela espessura dieléctrica. Em eléctrodos de dois canos, o dieléctrico largura eleva-se a parede de vidro da pipeta. Como o vidro thins perto da ponta, a largura dielétrico cai, e a capacitância aumenta. Esses fatores se combinam para produzir eletrodos com tempos de resposta que variam de várias centenas de milissegundos a váriossegundos, uma vez que estes factores são variados.

Uma grande vantagem da concepção concêntrica é que tanto a resistência axial e a capacitância para o banho são grandemente diminuídos. As derivações de pipeta concêntricos maioria da resistência do permutador de iões utilizados no enchimento, deixando apenas um remanescente nos últimos poucos micrómetros antes da ponta. Além disso, a solução de enchimento no interior da pipeta concêntrica é fisicamente afastado do banho, separadas por a espessura de duas paredes de vidro, reduzindo grandemente a capacitância. ¹⁰ Como mostrado anteriormente, o efeito combinado da reduzida resistência e capacitância é uma melhoria na resolução temporal de duas ordens de grandeza. No caso de concêntricos ^de Ca2 + e do pH micro-eléctrodos, os tempos de resposta de 90% foram tão baixas como ¹⁰ 10-20 ms. Uma vantagem relacionada com o desenho do concêntrico é o nível de ruído mais baixo (ver Figura 8). Devido à resistência muito reduzida, transitórios de tensão a partir de qualquer ambient de ruído são minimizados. Além disso, a recuperação a partir de tais transientes é rápida, devido à constante de tempo rápido. Tais artefatos são, portanto, pequeno e rápido, e têm um efeito menos prejudicial em gravações fisiológicas (cf. Figura 8).

Existem também desvantagens da técnica concêntrica. Em primeiro lugar, a sua montagem é mais complexo e demorado. Uma segunda desvantagem é a necessidade de colocar um microeléctrodo de referência separado, com a sua ponta, o que implica a utilização de qualquer um micromanipulador separado ou uma dupla manipulador especializado. Finalmente, microeléctrodos duplos de cano pode ser estendido para um design triplo de cano, permitindo a detecção de duas espécies diferentes de iões, ao mesmo tempo ^28, o que não é possível para os eléctrodos concêntricos.

Armadilhas mais comuns

Silanização ineficiente.

O passo mais importante, e obstáculo principal a fabricação de qualquer líquido-sensou microeletrodos íon-seletivo com base é o procedimento silanização. Quando eléctrodos não conseguem responder a alterações na concentração de ião específico ou responder com uma resposta sub-Nernstiana (ou seja, bem inferior a 58 mV por diferença de concentração de dez vezes), fraca eficácia de silanização é tipicamente a causa. Em nossa experiência, isso pode ocorrer se a humidade atmosférica é muito alto ou muito baixo, típico de condições no auge do verão, ou inverno, respectivamente. Se for viável a exercer algum controlo sobre a humidade ambiente, estes problemas podem ser superados.

Resistência do eléctrodo é demasiado elevada.

Se necessário, a resistência do tambor sensível aos iões pode ser reduzida por biselamento. Para este fim, expor a sua dica para um forte jato de um abrasivo em suspensão na água por um par de segundos. Isto fará com que a sua ponta ao máximo para quebrar e diminuir a resistência ao valor desejado.

Pontes de sal.

Salpontes entre os barris de iões e os eléctrodos de referência resultar em mal ou-nada, portanto, responder e pode também confunde bastante o seu desempenho na calibração. Como mencionado acima (ver ponto 1.6.), Este é principalmente um problema quando o vidro teta de cano duplo é escolhido, mas é uma ocorrência rara quando se usa o deslocamento, a técnica de cano retorcido descrito aqui.

Com facilidade de fabricação em mente, o design de cano duplo original da Lux ^{29 pode} muitas vezes ser utilizado de forma lucrativa. Este método utiliza a pré-enchimento dos barris de iões e de referência com soluções salinas, uma rápida exposição a uma solução de silano por sua aspiração e expulsão a partir da ponta, a seguir, por incorporação de permutador de iões, também através da ponta (ver ^30,31) . Estes eléctrodos podem ser fabricada em cerca de 10 minutos, mas o tamanho da ponta é, tipicamente, 4 mm ou mais e que são mais propensos a falhar durante um experimento. Em contraste, os métodos de silanização que envolvem a exposição ao vapor e calor silanoing pode produzir eletrodos com dicas menores que duram dias, e às vezes semanas.

Tomados em conjunto, existem vários protocolos e aproxima-se sobre a forma de preparar micro-eléctrodos selectivos de iões. Aqui, descrevemos dois procedimentos principais para a fabricação de microeletrodos dois canos, bem como concêntricos torcidos que funcionam bem e de forma confiável em nossos laboratórios, com uma taxa de sucesso global de perto de 100%. Importante, estas técnicas podem ser transferidas para a medição de outras espécies, incluindo iões de cálcio ou de pH, e será igualmente aplicável a outras preparações do que o cérebro, incluindo cavidades cheias de líquido ou líquidos em geral. Por último, mas não menos importante, microeletrodos íon-seletivo permitir a determinação da concentração de íons no interior das células. Devido ao seu tamanho relativamente grande ponta (~ 1 mm), isto, no entanto, ser possível somente em células com um corpo de grandes células, por exemplo, tal como se encontra nas preparações de invertebrados ^28,32.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Abrasivo	MicroPolish	Buehler GmbH	Dissolvido em capilares
de vidro borossilicato	1405059	Hilgenberg	Aplicação pipeta; 75 mm x 2 mm, espessura de parede 0,3 mm
Capilares de vidro borossilicato com filamento	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Aparelho Harvard	Para o sensor de microeletrodos de cano duplo
Capilares de vidro borossilicato com filamento	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	Para referência de microeletrodos de cano duplo
Capilares de vidro borossilicato com filamento	GB-200TF-15	Produtos científicos	Concêntrico, canal externo. O.D. 2.0 mm
Capilares de vidro borossilicato com filamento	GB-120TF-10	Science Products	Canal interno concêntrico. O.D. 1.2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Amplificador de eletrômetro com headstage		Feito sob medida	Rin = 10 TΩ e Ibias=50 fA-1pA (alternativas disponíveis comercialmente: e.g. Dagan IX2-700, com headstage (resistor de feedback de 10 Gig) ou EPMS-07, NPI, Tamm, Alemanha)
Câmara		Feita sob medida	Disponível comercialmente em e.g.   Warner Instruments, EUA;   Scientifica, Reino Unido
Forno		Heraeus	Deve permanecer constante em 200 ° C
Cera pegajosa dura / cera dental	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Placa		Feita sob medida	Deve permanecer constante em 40 & C
Suporte de microeletrodos feito de plexiglas		Feito sob medida	Duplo-barril: O.D.   capilares de 1,5 mm, concêntricos: O.D.  capilares 2 mm
Micromanipulador		Leitz
Micromanipulador	MD4R	Leica
Microscópio Estéreo	M205C	Plano Objetivo Leica
	0.8xLWD	Leica
Extrator de Pipetas	Modelo PP-830	Narishige	Microeletrodos concêntricos
Extrator de pipetas	Modelo P-97	Sutter Instruments	Sensor de microeletrodos concêntricos
Sistema pneumático de ejeção de drogas	Picospritzter Tipo II	Válvula Geral TM Corporation
Estágio de cauda de andorinha de viagem	DT 25/M	Thorlabs
Cola de dois componentes	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	Pode-se também usar uma pequena faixa de papel alumínio para colar os capilares juntos
Silverwire	99,9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Extrator vertical Axon Instruments
	Tipo PE-2	Narishige Scientific Instruments	Com um mandril revolvável para  microeletrodos de cano duplo
x/y estágio		Feito sob
1(S),9(R)-(−)-Metiodeto de bicuculina	Sigma aldrich	14343	Antagonista competitivo dos receptores GABAA (sensível à luz); CUIDADO tóxico
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/antagonista do receptor de cainato; CUIDADO:
tóxico Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	antagonista do receptor NMDA; CUIDADO
tóxico Hexametildisilazane (HMDS)	Sigma aldrich	440191	CUIDADO: Inflamável, toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) e corrosivo para metais e pele
Ácido L-aspártico	Sigma aldrich	A9256	Ativa NMDA e não-NMDA e EAATs
Ácido L-glutâmico sal monossódico hidratado	Sigma aldrich	G1626	Ativa NMDA-R, AMPA-R, QA-R e KA-R),  mGluRs e EAATs
Ionóforo de potássio I - coquetel B	Fluka	60403	À base de valinomicina; CUIDADO tóxico
Ionóforo de sódio II - coquetel A	Fluka	71178	Baseado em ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inibidor de canais de Na+ dependentes de tensão; CUIDADO tóxico
Água, ultra puro	Sigma aldrich	W3500