Os biossensores de microeletrodos enzimáticos permitem medições em tempo real da sinalização de células extracelulares em concentrações biologicamente relevantes. Os protocolos a seguir estendem as aplicações de biossensores para a detecção ex vivo e in vivo de ATP e H2O2 no rim.
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Artigo de método
Uso de biossensores para quantificar enzimática endógena ATP ou H
Neste artigo
Resumo
Resumo
Biossensores microeléctrodo enzimáticas têm sido amplamente utilizados para medir a sinalização extracelular em tempo real. A maioria da sua utilização tem sido limitada a fatias de cérebro e cultura de células neuronais. Recentemente, esta tecnologia tem sido aplicada aos órgãos inteiros. Avanços em design de sensor tornaram possível a medição de sinalização celular em em rins vivo perfusão de sangue. Listar os atuais protocolos os passos necessários para medir ATP e sinalização H 2 O 2 no interstício do rim do rato. Dois modelos de sensores separados são usados para o ex vivo e in vivo protocolos. Ambos os tipos de sensores são revestidos com uma fina biolayer enzimática no topo de uma camada de permeabilidade selectiva para dar resposta rápida, biossensores sensíveis e selectivos. A camada de permeabilidade selectiva protege o sinal a partir dos interferentes no tecido biológico, e a camada enzimática utiliza a reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e glicerol-3-fosphate-oxidase na presença de ATP para produzir H 2 O 2. O conjunto de sensores utilizados para os estudos ex vivo mais analito detectada por oxidação de H 2 O 2 em uma platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Os sensores para os estudos in vivo são, em vez baseado na redução de H 2 O 2 em um eléctrodo de ouro revestido mediador concebido para o tecido perfundido de sangue. Mudanças concentração final detectado por amperometria são em tempo real seguido de calibração de concentrações conhecidas de analito. Além disso, a especificidade do sinal amperométrico pode ser confirmada pela adição de enzimas como a catalase e apirase que quebram H 2 O 2 e ATP correspondentemente. Estes sensores também dependem fortemente de calibrações precisas antes e depois de cada experimento. Os dois protocolos seguintes estabelecer o estudo de detecção em tempo real de ATP e H 2O 2 em tecidos renais, e pode ser ainda modificado para prolongar o método descrito para o uso em outras preparações biológicas ou órgãos inteiros.
Introdução
Biossensores microeléctrodo enzimática (também referida como sensores no presente manuscrito) ter sido uma ferramenta valiosa para estudar processos dinâmicos de sinalização em células e tecidos vivos. Os sensores proporcionam uma maior resolução temporal e espacial das moléculas de sinalização celular nas concentrações biologicamente relevantes. Em vez de amostragem e análise de fluidos extracelulares tomadas em intervalos durante longos períodos de tempo, estes sensores responder tão rápido quanto suas enzimas reagem com o analito, produzindo, assim, as medições em tempo real de 1,2. Detecção rápida de concentrações intersticiais de factores autócrinos e....
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Protocolo
Os seguintes procedimentos com animais aderiram ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A aprovação prévia foi obtida de Cuidado e Uso Comitê Institucional Animal (IACUC).
NOTA: Revisão das instruções do fabricante do sensor deve ser feito durante o delineamento experimental e antes da sua utilização. Seguindo estas instruções irá produzir os melhores resultados ao usar os sensores.
Calibração do Sensor 1.
- Preparar soluções de fresco, antes do início da experiência.
- Criar Tampão A contendo tampão NaPi 10 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 1 mM, e 2 mM de glicerol. Ajustar o pH a 7,4 usan....
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Resultados
O design do biossensor microeléctrodo enzimático permite a detecção em tempo real dos analitos em rins inteiros. A concepção geral para qualquer experiência ex vivo ou estudos in vivo é ilustrado na figura 1 os sensores .Os utilizada e os procedimentos cirúrgicos diferentes, dependendo se o estudo é ex vivo ou in vivo.
Para obter resultados reprodutíveis, pré precisas e calibrações pós são críticas. A figura 6A mostra um traço repr.......
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Discussão
Os actuais protocolos foram desenvolvidos para proporcionar maior resolução temporal e espacial da sinalização de ATP e H 2 O 2 para rins perfundido de sangue ex vivo isolados, perfundidos e in vivo. As diferenças entre os protocolos e os sensores usados aqui fornecem aquisição de dados ideal tanto para agentes farmacológicos ou estudos fisiológicos. Os protocolos consistem de 1) a calibração do sensor, 2) procedimento cirúrgico, 3) de configuração de aquisição de dados, e 4) a análise dos.......
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Divulgações
Sensores para a gravação do vídeo deste manuscrito foram fornecidas pela Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Reino Unido).
Agradecimentos
Agradecemos Sarissa Biomedical por seu trabalho no desenvolvimento dos sensores usados no presente manuscrito. Esta pesquisa foi suportada pelo National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122662 (A. Staruschenko e A. Cowley), um projeto financiado pelo Medical College of Comitê de Assuntos de Pesquisa Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e Avançando um Programa de Pesquisa e Educação saudável Wisconsin # 9520217, eo Young Investigator Grant do National Kidney Foundation (O. Palygin).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Sensor | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | O kit inclui garrafa de armazenamento, câmara de reidratação, eletrodos e eletrodos de referência. Também incluído no kit está a escolha de sensores do usuário. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μ m | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | loja em 2-8 oC antes de usar |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μ m | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | armazenar em 2-8 oC antes de usar |
| Sensor nulo Sarissaprobe 125 μ m | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | loja a 2-8 oC antes de usar |
| Sensor nulo Sarissagold 50 μ m | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | loja em 2-8 oC antes de usar |
| Manual Sarissaprobe ATP Sarissa | Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Gaiola de Faraday | TMC | ||
| Potenciostato de canal duplo | Digi-Ivy | DY2021 | Tipo II Gaiola de Faraday |
| Programa de aquisição de dados | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Bomba de perfusão | Razel Scientific Instruments | Modelo R99E | |
| Iluminador de fibra óptica | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulador | Narishige | MM-3 | |
| suporte magnético para micromanipulador | Narishige | GJ-8 | |
| mesa de ar | TMC | 63-500 | |
| ventilador de isoflurano | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml placa de Petri | Fisher Scientific | S3358OA | |
| agulha | Santa Cruz | 26-30 | |
| pinos | Pinos de dissecção padrão | ||
| Tubo de polietileno (PE50) | |||
| cola de tecido de cateter | Sutura Vetbond | 1469SB | |
| Look | SP117 | ||
| elásticos | qualquer elástico de 2-4 mm de largura | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Ferramentas de Ciência Fina | 18052-03 | |
| de dissecação padrão | O kit deve incluir bisturi e sissors de dissecação | ||
| Copo | de rim de produtos químicos padrão de design próprio | ||
| Sigma-Aldrich | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solução |
| de peróxido de hidrogênio | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glicerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apirase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurano | Clipper | 10250 | |
| inactina | Sigma-Aldrich | T133 | |
| cetamina | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Solução salina balanceada | Gibco | 14025092 |
Referências
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for con....
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Reimpressões e permissões
