Artigo de método

Geração e Análise Quantitativa de Baixa Freqüência ultra-som pulsado determinar Sonic sensibilidade dos tratados e não tratados células neoplásicas

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DOI:

10.3791/53060

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22 de julho de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

Neste artigo

Resumo

O dano seletivo das células leucêmicas humanas pode ser alcançado por meio de uma nova abordagem de aplicação de ultrassom de baixa frequência com e sem pré-tratamento quimioterápico de células leucêmicas e hematopoiéticas normais.

Resumo

O ultrassom de baixa frequência na faixa de 20 a 60 kHz é uma nova modalidade física para induzir lise celular seletiva e morte em células neoplásicas. Além disso, esse método pode ser usado em combinação com agentes especializados conhecidos como sonossensibilizadores para aumentar a extensão do dano preferencial exercido pelo ultrassom contra células neoplásicas, uma abordagem conhecida como terapia sonodinâmica (SDT). A metodologia para gerar e aplicar ultrassom de baixa frequência em um ambiente pré-clínico in vitro é apresentada para demonstrar que a destruição celular reprodutível pode ser alcançada para examinar e comparar os efeitos da sonicação em células neoplásicas e normais. Isso oferece um meio pelo qual Além disso, os efeitos dos agentes depletores de colesterol e direcionados ao citoesqueleto na potencialização da sensibilidade ultrassônica em células neoplásicas são discutidos a fim de elaborar mecanismos de ação propícios a abordagens sonoquimioterápicas.

Introdução

O ultra-som refere-se a qualquer onda de pressão acústica com uma frequência de oscilação maior do que o limite superior das capacidades auditivas humanas (~ 20 kHz) 1. Ultra-som de baixa frequência na gama de 20-60 kHz foi utilizada no laboratório como um meio de produção de emulsões, preparando amostras celulares para a extracção de ácido nucleico, por rompimento do tecido, e para uma variedade de outros testes. O utilitário de ultra-som de baixa freqüência também foi estendido para o ambiente industrial para soldagem, limpeza diversos materiais, e no processamento de materiais. Comercialmente geradores de ultrassons disponíveis vêm em freqüências que variam 18-60 kHz, e em grande escala de potências 100-1,200 W.

Apesar do ultra-som tem sido muito utilizado na prática clínica para a imagiologia de diagnóstico, que tem sido aplicada como uma modalidade terapêutica apenas recentemente. Ultrasound ≥1 MHz é capaz de perturbar de forma segura cálculos urinários (pedras nos rins) e cálculos biliares (pedras em the vesícula biliar ou no fígado) em pacientes para reduzir os sintomas 2,3. Esta abordagem conhecida como litotripsia extracorpórea por ondas de choque (LECO) é hoje amplamente aplicada na clínica (mais de um milhão de pacientes são tratados anualmente com LECO nos Estados Unidos sozinho 4), e oferece uma modalidade pela qual a não-invasiva quebrar cálculos com danos colaterais mínimos, através da utilização de impulsos acústicos aplicados externamente, centrada, de alta intensidade 2-4.

Devido às forças directas originais de cisalhamento, bem como bolhas de cavitação ultra-sons gerados por alta intensidade, estas metodologias foram examinados em terapia do cancro para o tratamento de carcinoma da próstata resistente à castração e adenocarcinoma pancreático em uma abordagem conhecida como concentrado de alta intensidade ultra-som (HIFU ) 8/5. De um modo muito semelhante ao LECO, HIFU utiliza múltiplos feixes de ultra-som e concentra-los numa área focal seleccionada para gerar temperaturas de 60 ° C ou hig-a através da utilização de energia acústica, induzir necrose coagulativa no tecido alvo 5. Embora outras modalidades de ablação térmica existem atualmente (ablação por radiofreqüência e ablação por microondas), HIFU oferece uma vantagem distinta sobre esses métodos em que é a única modalidade hyperthermic não-invasivo 5. HIFU tem alcançado resultados mistos na clínica e está atualmente disponível apenas em ensaios clínicos 11/08. No entanto, o sucesso limitado que alcançou, eo muito promissor dados in vivo adquiridos a partir de modelos pré-clínicos de mamíferos têm demonstrado o potencial do ultra-som na terapia do cancro.

Num esforço para melhorar HIFU, os investigadores tentaram combinar com agentes antineoplásicos de ultra-sons apropriadas para gerar uma forma de sonochemotherapy. Terapia Sonodynamic (SDT) é uma modalidade de tratamento novo promissor que tem demonstrado actividade antineoplásica em impressionante tanto in vitro como Estudos in vivo um. Tem sido demonstrado que o ultra-som preferencialmente danos células malignas baseados no diferencial de tamanho entre essas células e os da histologia normal 1,5. SDT incorpora agentes especializadas conhecidas como sonosensitizers para aumentar a extensão do dano preferencial exercida por ultra-sons contra células neoplásicas. Enquanto as aplicações terapêuticas da SDT foram previamente examinados, sistemas ultra-sônicos utilizados normalmente empregam mais elevado de ultra-som de frequência (≥1 MHz), e os efeitos do ultra-som de baixa frequência kHz ainda não foi totalmente explorado. Menores freqüências de ultra-som são muitas vezes mais eficientes na produção de cavitação inercial, um fenômeno que resulta na destruição das células devido ao rápido colapso de microbolhas, induzindo dano físico 12-14. Esta diferença na geração de cavitação inercial entre MHz baixo e ultra-som kHz tem sido atribuída ao facto de as frequências de onda inferiores permitir microbolhass mais tempo para crescer por difusão corrigida no meio ciclo de expansão, consequentemente, a produção de colapsos mais violentos durante o meio ciclo seguinte de compressão 12.

Nós já demonstrado que as células monocíticas humanas U937 de leucemia são sensíveis à ultra-som de baixa frequência (23,5 kHz), e que esta sensibilidade pode ser significativamente aumentada através da aplicação de agentes anti-neoplásicos que perturbam o citoesqueleto 15. Além disso, demonstrámos que as células são preferencialmente danificado com base no tamanho, com células maiores que apresentam uma sensibilidade mais elevada de ultra-sons. Além disso, as células normais humanas estaminais hematopoiéticas (hHSCs) e leucócitos em tamanhos de células comparáveis ​​são muito mais resistentes a sonicação do que os seus homólogos neoplásicas 15, que poderá sugerir que o ultra-som de baixa frequência pode ser utilizado para danificar as células malignas, preferencialmente, na presença de tecido normal.

Para examinar ainda mais a prop exclusivoerties de ultra-som de baixa frequência para o potencial uso terapêutico, desenvolvemos procedimentos de limpeza e estabilização para aumentar a eficácia ea confiabilidade de um de nossos sistemas de sonicação atuais, a 150 W Branson Modelo SLPE, 40 kHz Disrupter celular, equipado com um chifre de 20 milímetros equipada em um copo de 7,62 centímetros. Além disso, temos sido capazes de determinar precisos energias amostra de cavitação, bem como formas de ondas consistentes e amplitude dentro da faixa de 40 kHz usando um medidor de cavitação e osciloscópio com hidrofone. Refinando e sistematizar nossos protocolos, temos sido capazes de estabelecer uma coerência em nossos sonicações experimentais, o que nos permite comparar quantitativamente as sensibilidades sônicas de células neoplásicas e normais de diferentes linhagens de histogênese. Nosso protocolo para o sistema de 40 kHz é apresentado em grande pormenor, a fim de laboratórios interessados ​​para ser capaz de realizar experiências comparáveis, e para avaliar os resultados dos efeitos antineoplásicos eliciados porultra-som de baixa freqüência. Além disso, nós examinamos os efeitos dependentes de dose de metil-β-ciclodextrina (MeβCD; Figura 1), um agente de empobrecimento do colesterol, no aumento da sensibilidade de ultra-sons de células U937 e células THP1 de leucemia monocítica humana.

Protocolo

1. Limpeza celular Sonifier Sistema

  1. Limpe a união entre o chifre e conversor usando clorofórmio e um cotonete de algodão. Aplique um óleo leve ou óleo mineral para os fios do chifre e um conversor para remover ainda mais acúmulo de aparas de metal, ferrugem ou oxidação.
  2. Use clorofórmio para remover o óleo e outros contaminantes a partir da união depois de limpar as roscas com óleo.

2. Remontagem do celular Sonifier e Configuração do Sistema

  1. Volte a colocar a buzina para o conversor. Ao torque adequadamente o sistema, remover o conversor montado e chifre do conjunto do copo, puxando o chifre fora da parte inferior do copo (Figura 2A). Inserir uma chave de fenda dentro de uma das três pequenos furos perto da parte superior do conversor (Figura 2B). Em seguida, posicione um torque-chave equipado com um pé-de-galinha ½ polegada por parte fenda da buzina (Figura 2B). Aperte em standard direcção dos ponteiros do relógio até que o medidor de binário lê N 54,23. M (Figura 2C), o binário recomendado pelo fabricante 16. Montar o conversor apertados e chifre de volta no copo, e montar o chifre e um conversor a um stand anel na posição vertical. Volte a colocar o conversor para a fonte de alimentação antes de definir o sistema de dosagem de pulso experimental.
  2. Defina o sistema de dosagem de pulso usando 1 seg de sonicação com 1 segundo entre os pulsos. Diferentes modelos de dosagem pode ser utilizado para outras condições experimentais. Muitas variáveis, tais como volume de água e diâmetro chifre seria potencialmente exigir alterações a esta dosagem. Utilizando os tipos acima mencionados da amostra de células, o volume e concentração, os dados de observação empírica e levaram à formulação deste regime de dosagem.
  3. Ajustar o sistema com a amplitude desejada. Neste protocolo, utilizar 33% e 50% da amplitude de evitar a destruição da célula completa, o que tornaria a eficácia de sonosensitizers difíceis ou impossíveis de avaliar.
    NOTA: Neste estudo as amplitudes são comparados.

3. avaliar a intensidade do sistema e Função

  1. Segurar o aparelho de cavitação de 1,5 cm, que é o nível de sonicação a amostra. Observe as leituras para avaliar se o sistema está funcionando em uma intensidade esperada. Usando os níveis do sistema de água e atuais, esperar entre 100-110 W / cm 2 para 33% da amplitude e 115-125 W / cm 2 para 50% da amplitude. Observe as leituras do medidor de cavitação do visor do medidor que representa a energia cavitação em W / cm2 diretamente. Aqui estas leituras na superfície da água, e garantir que não existem bolhas na face da sonda metros.
    NOTA: É importante notar que estes procedimentos são feitos sem a tampa de acesso acima da buzina. Eles não necessitam de ser repetidos depois de cada sonicação. Pelo contrário, devem ser realizados somente após a limpeza, voltar a montar, e configurar o sistema.
  2. Inserir o hidrofone em um frasco de amostra contendo 12,5 ml de água, a fim de imergir completamente o sensor do hidrofone. Suspender o hidrofone usando o suporte de anel.
  3. Fixar o hidrofone para a entrada do osciloscópio, de modo a avaliar as características de forma de onda. Examine o osciloscópio para uma onda senoidal clara, como ondas aberrantes pode alterar a freqüência do sistema a partir das especificações do fabricante. Tanto o medidor de cavitação e osciloscópio dar uma leitura de frequência, mas apenas o osciloscópio mostrará ondas aberrantes, que são indicativas de um sistema defeituoso ou montagem incorrecta.

4. Preparação de células e meio

  1. Prepara-se o meio usando 240 ml de Iscove Modified Meio de Dubecco (IMDM) e 50 ml de soro fetal de bovino. Não descongelar soro fetal bovino em um banho de água quente, como o rápido aumento de temperatura pode levar a um compromisso em termos de estabilidade no soro. Combinar 240 mL de gentamicina 50 mg / ml e 5 ml de penicilina/ Estreptomicina 100x num frasco de cultura padrão, e adicionar ao meio. Armazenar o meio a 4 ° C.
  2. As células U937 em Semente ~ 4 x 10 4 culas / ml num frasco de 25cm 2 usando o meio preparado. Avaliar células para concentração e viabilidade utilizando um contador de células TC 20 e de exclusão de azul de tripano, colocando 15-20 ul de células e 15-20 ul de tripano azul para um tubo de micro-centrifugadora e misturando o conteúdo. Pipette15-20 ul desta mistura numa lâmina de amostragem TC20, e iniciar a contagem, colocando a lâmina para o contador de células TC 20.
  3. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2, e vá para a viabilidade celular utilizando a exclusão de azul de tripano e o contador de células TC 20. Quando as células estão numa concentração apropriada e / ou foram tratados com sonosensitizers para um período de tempo apropriado, a transferência de 3 ml de células a partir do frasco de cultura para um frasco de cintilação de 20 ml de vidro. Neste protocolo, crescer células U937 durante 48 horas, e em seguida, tratar com 0,5, 1,MeβCD ou 5 mM durante 30 min a esgotar suficientemente o colesterol de células antes da sonicação.

5. celular Sonication

  1. Desgaseifica desionizada, água destilada usando um frasco de vácuo e de Buchner. Transferir a água para o copo de chifre, e enche-se a um nível de 15 mm acima da parte superior da trompa. O processo de ultra-sons provoca ainda mais a desgaseificação da água por um período de alguns minutos, e pode levar a inconsistências no decurso da experiência, se o sistema não é executado antes de experimentar sonicação. Portanto, executar o sistema para ~ 7 min antes de provar sonicação.
  2. Fixar o frasco de cintilação contendo as células para o dispositivo de retenção. Em seguida, fixar o dispositivo de suporte para o topo do copo de chifre e definida para uma altura de 15 mm a partir do topo da trompa (na superfície da água, utilizando o mecanismo de deslizamento).
  3. As células são tipicamente sonicada usando três pulsos de 1 seg de ultra-sons, com um segundo espaçamento entre cada um desses impulsos. Para issoprotocolo, sonicar as células em 33% e 50% da amplitude de pulso utilizando o doseamento acima referido.

6. Avaliação de Danos As células para Pós-sonicação

  1. Avaliar as células suspensas por danos e viabilidade utilizando azul de tripano e contador de células TC20. Além disso, analisar a amostra utilizando um contador de Z2. Para a análise contador Z2, pipetar uma suspensão de células de 100 ul em 20 ml de solução salina isotónica (200: 1 ratio). Antes da análise, lave a abertura do analisador de partículas Z2 pelo menos duas vezes, utilizando solução salina isotónica. Colocar a amostra no porta-Z2 balcão, e eleve a plataforma para a abertura antes de iniciar a contagem.
  2. Adquirir os dados provenientes dos contadores TC20 e Z2 usando o software fornecido pelo fabricante. Analisar esses dados para o dano celular, viabilidade, e a criação de debris celulares de ultra-sons.

7. XTT Ensaio para determinar a viabilidade celular e mitocondrial Atividade de U937 tratadas e THP1 Células

  1. Prior para os ensaios de XTT, crescer células U937 e células THP1 sob as mesmas condições. Pré-tratamento de células com o mesmo intervalo de concentração de MeβCD durante 30 min antes da sonicação. Use os mesmos parâmetros de ultra-sons como anteriormente, excepto que as células são agora sonicada usando um intervalo de 1-3 um pulsos sec espaçadas uma seg além de desenvolver um intervalo de danos para o kit XTT para avaliar.
    Nota: Muitas destas medidas são tomadas diretamente do manual do kit XTT e só são repetidos para a conveniência dos laboratórios interessados.
  2. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 10 min. Ressuspender o sedimento de células em meio de crescimento descrito anteriormente. Ressuspender as células em 1 x 10 ~ 5 células / mL. As células U937 de sementes em 100 ul por poço em uma placa de fundo plano microtitulação de 96 poços em triplicado e repita para THP1 células usando uma placa de 96 poços separado. Incluem três poços de controlo contendo 100 ul de meio de crescimento completo sozinho como em branco leituras de absorvância. Em seguida, incubar as placas inoculadas durante 24 hr.
  3. Descongelar duas alíquotas da reagente XTT e o reagente de activação a 37 ° C antes de usar. Alíquotas do redemoinho delicadamente até que são obtidas soluções claras. Adicionar 0,1 ml de reagente de activação e 5,0 ml de reagente XTT, o qual forma o suficiente solução de XTT activado por um ensaio de 96 poços de placas de microtitulação. Repetir o processo para a outra placa.
  4. Adicionar 50 ul da solução de XTT-activada a cada poço. E volta da placa de cultura de células para a incubadora de CO2 durante 2 horas. Agitar suavemente a placa a seguir ao período de incubação, para distribuir uniformemente a cor laranja nas cavidades positivas. Medir a absorvância dos poços de teste, contendo as células e os poços de controlo em branco no fundo de um comprimento de onda entre 450-500 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação.
  5. Ou zero o leitor de placas de microtitulação utilizando os poços de controlo em branco ou subtrair o seu valor médio a partir dos resultados específicos. Medir a absorvância de todos os poços de teste novamente a uma wavelength entre 630-690 nm e subtrair os valores dos 450-500 nm valores obtidos. Nota: Esta segunda determinação absorvância ajuda a eliminar as leituras não específicas a partir dos resultados do ensaio. O ensaio XTT foi repetido quatro vezes para ambas as linhas celulares.

Resultados

A estabilidade do sistema é fundamental na obtenção de resultados reprodutíveis e confiáveis. A especificação torque adequado de 54,23 N. M alcançado acoplamento adequado do transdutor e sonotrodo 2, com a consistência da forma de onda a ser avaliada através da utilização de um osciloscópio e hidrofones (Figura 3A). A Figura 3B representa medições dentro do frasco de amostra, e Figura 3C avalia a estabilidade dentro do chifre copo. Como esperado, a amplitude foi ligeiramente reduzida devido a alguma energia seja absorvida pelo vidro. No entanto, a forma de onda não foi perturbado ou distorcido em qualquer painel B ou C, o que é necessário para a entrega fiável de energia sónica para a amostra. Uma forma de onda que não aparece como uma onda senoidal singular claro indica um transdutor defeituoso ou instalação inadequada. Isso está expresso na figura 3D que mostra várias ondas aberrantes, uma clara ausência de uma onda senoidal, e uma frequência de leitura nãot esperado com um bom funcionamento do sistema. O medidor de cavitação usado para medir a energia de cavitação gerado (Figura 4) encontrada a intensidade do som para ser 100-110 W / cm2 a 33% de amplitude, e 125-130 W / cm 2 a 50% de amplitude.

Uma vez que o sistema de 40 kHz foi adequadamente calibrado e montado na sua totalidade (Figura 5), a destruição de células de confiança foi prontamente alcançada, tal como determinado por ambas as contadores TC20 e Z2 (Figura 6). Tal como esperado, mais danos extensivos de células foi observada nas populações de células sonicadas em 50%, em vez de a 33% de amplitude. No entanto, 33% da amplitude é útil como um ponto de partida para detectar potenciais efeitos sónica sensibilizadores de agentes administrados, uma vez que produz os danos visíveis, mas deixa espaço para mais danos a ser detectado quando os agentes são aplicados para avaliar a sua potenciação da sensibilidade de ultra-sons. Isto é demonstrado na Figura 7A, em que oefeitos dependentes da dose de MeβCD na potenciação da sensibilidade de ultra-sons de células U937 são apresentados. Embora as células tratadas com MeβCD não sonicadas foram muito semelhantes na viabilidade de células não tratadas, sonicado, a viabilidade caiu acentuadamente após três pulsos de 1 segundo 40 kHz foi aplicado ultra-som. Além disso, a diminuição na viabilidade após sonicação parece ter sido dependente da dose, como MeβCD 5 mM produziu a maior queda na contagem de células, seguido de 1 mM e, em seguida, 0,5 MeβCD mM.

Efeitos semelhantes sobre a viabilidade celular e a actividade mitocondrial foram observados em ambas as células U937 e THP1 que foram tratados com concentrações variáveis ​​de MeβCD antes da sonicação, tal como determinado com o kit XTT (Figura 7B). Embora THP1 células parecem ser um pouco mais resistentes que as células U937 sónica, ambas as linhas de leucemia humana são danificadas de modo dependente da dose. Maiores concentrações de MeβCD e mais pulsos de ultra-som produced a menor redução de XTT a, um derivado solúvel de laranja intensamente colorido tanto para U937 e células THP1, que corresponde a diminuir a viabilidade celular e a actividade mitocondrial.

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Figura 1. Estrutura molecular de metil- β-ciclodextrina. (A) estrutura completa de metil-β-ciclodextrina (MeβCD). (B) MeβCD é um polímero de sete unidades de repetição com um grupo R de H ou CH3. Fórmula molecular: C 56 H 98 O 35. Peso Molecular = 1331,36.

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Figura 2. Adequadamente torqueing o sistema de ultra-som de 40 kHz. (A) A antena e o conversor são removidos do copo priou para torqueing. (B) Posicione a chave de fenda e chave de torque em suas respectivas posições. (C) Aplicar 54,23 N. M de torque no sentido horário antes de recolocar o chifre e um conversor para a taça.

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Figura 3. Utilização de um osciloscópio para caracterizar a forma de onda do sistema de ultra-sons. (A) um osciloscópio com hidrofones pode ser utilizado para avaliar a consistência de amplitude e forma de onda. (B) Uma gravação feita com o copo directamente por cima da corneta a 1,5 cm e é ajustado a 33% de amplitude. (C) A forma de onda representada aqui é adquirida a partir de uma leitura quando o hidrofone for colocado dentro do frasco de cintilação de 20 ml de vidro. O frasco é posicionado a 1,5 cm acima do chifre e de novo fixado em 33% da amplitude. (D) Um osciloscópio tela osistema fa com freqüências aberrantes como seria de esperar com um sistema defeituoso ou acoplamento da união imprópria conversor chifre. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. O uso de um medidor de cavitação para caracterizar a intensidade do som do sistema de ultra-sons. O medidor de cavitação visto aqui é usado para representar a energia de cavitação em W / cm2. Este é um instrumento muito importante para avaliar a consistência de energia em relação à amostra.

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Figura 5. Os principais componentes do sistema de ultra-som de 40 kHz. O sistema de ultra-sons é mostrada completa com copo de chifre ( A), o aparelho de aquecimento (B), o conversor (C), e um mecanismo de posicionamento da amostra (D). Este design permite uma fácil posicionamento da amostra (E), o corno (F).

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Figura 6. Efeitos de diferentes níveis de amplitude de ultra-sons sobre a lise de células U937, utilizando os contadores TC20 e Z2. As células foram sonicadas com a célula Dismembrator 40 kHz a 33% amplitude (100-110 W / cm2) ou 50% da amplitude (125-130 W / cm 2) usando três pulsos de 1 seg de ultra-sons, com um segundo espaçamento entre cada desses impulsos. (A) Uma imagem do software do contador Z2 demonstra o efeito de ultra-sons em células U937. (B) Os dados do contador de TC20 foram compilados em um gráfico para demonstrar a reprodutibilidade do resultados. Estes dados incluem as contagens totais e de células vivas, bem como o azul de tripano avaliada a viabilidade celular. Bares refletir o erro padrão da média (SEM) para 4 populações de células independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7. Efeitos da metil- β-ciclodextrina na potenciação da sensibilidade de ultra-sons de células U937 e células THP1. (A) As células U937 foram tratadas com várias concentrações de MeβCD durante 30 min antes de ser submetida a ultrassons com ultra-som de 40 kHz (105 W / cm 2 ) usando três pulsos de 1 seg espaçadas 1 segundo de intervalo. Populações de células foram agrupadas em ≥12 ≥17 um e um. (B) U937 ou células THP1 foram novamente tratados com concent variandorações de MeβCD durante 30 min antes de ser submetida a ultrassons com o sistema de 40 kHz utilizando 1-3 pulsos de 1 s 1 s de ultra-sons espaçados separados. A viabilidade celular e atividade mitocondrial foram avaliados com o kit XTT. 100 uL de células foram semeadas por poço numa placa de 96 poços de microtitulação de fundo plano. A placa foi incubada durante 24 h antes da adição de solução de XTT. As células foram então incubadas durante mais 2 horas antes de o comprimento de onda foi lido. Bares refletir SEM por 4 populações de células independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Para alcançar melhores resultados, deve-se tomar cuidado especial para posicionar cuidadosamente a amostra e limpar a união conversor de-chifre. A colocação da amostra no corno é importante para se obter a destruição de células consistentes, como a mudança da distância do chifre irá alterar os focos acústico, e, por conseguinte, alterar a energia a amostra está exposta. A energia acústica dentro do chifre copo pode ser mapeada usando o medidor de cavitação para encontrar a posição de máxima cavitação. Além disso, o medidor de cavitação, junto com o osciloscópio são vitais para a determinação da intensidade sonora as células estão a ser expostos, assim como a homogeneidade da forma de onda. Portanto, estes instrumentos devem ser utilizados para detectar problemas com o sistema, e ajudar a determinar a resolução de problemas que podem ser necessárias para corrigir a instabilidade do sistema.

Como mencionado anteriormente, o sistema de baixa frequência pode actuar para mais desgaseificar a água ao longo da experiência não se correr paravários minutos antes da amostra sonicação. Este prazo inicial deve ser realizada para produzir um meio de ultra-sons relativamente desgaseificado e resultados assim consistentes durante as experiências. Além disso, as células não devem ser sonicada a ou perto da amplitude máxima quando se avalia a eficácia das sonosensitizers, como a verdadeira medida da sensibilização seria difícil de avaliar. Usando 33% amplitude no sistema kHz 40 é um cenário ideal, uma vez que produz danos notáveis, mas fornece sonosensitizers amplo espaço para demonstrar a sua eficácia, como ficou demonstrado com MeβCD contra U937 e células THP1 (Figura 7). Estes dados também confirmam que sensibiliza MeβCD várias linhas de leucemia a partir de ultra-sons de frequência de um modo dependente da dose.

Tem havido um grande número de experiências feitas com maior frequência na gama de 0,75 MHz a 8 MHz mostrando evidência de bolhas de cavitação intramembranar ser gerado através de ultra-sons 17-19. No entanto, questioNS ainda permanecem no que diz respeito ao mecanismo exato de induzida por ultra-som lise celular 18. Nós têm mostrado uma ligação entre o citoesqueleto fluidificação e aumento da sensibilidade sonora usando o ultra-som de baixa freqüência de 15, um fenômeno demonstrado por outros laboratórios 20, 21. Além disso, verificou-se que os agentes de perturbação microfilamentosas como citocalasina B potenciar a sensibilidade ultra-som na leucemia múltiplo linhas, mas não hHSCs ou leucócitos 22, sugerindo que a inibição da polimerização da actina podem ser um mecanismo de sonosensitizing de particular interesse. Observamos, também, que a vincristina, um agente de interrupção dos microtúbulos, que inibe a polimerização da tubulina de 23, 24, aumenta significativamente a sensibilidade de ultra-sons de diferentes tipos de leucemia in vitro, incluindo a leucemia mieloide aguda, leucemia mielóide crónica e leucemia linfóide aguda. Por contraste, agentes dirigida ao citoesqueleto que estabilizam os componentes do citoesqueleto (paclitaxel umd jasplaquinolida) parecem tornar as células resistentes a ultra-sons, refletida por baixas taxas de lise celular 22. Tomados em conjunto, estes dados suportam a hipótese de que os componentes do citoesqueleto de fluidização de células neoplásicas é de facto um factor importante para aumentar a eficácia do SDT 25. O presente estudo também demonstra que a depleção de colesterol pode ser um outro método que permite potenciar ainda mais a sensibilidade de ultra-sons de células neoplásicas, tal como células U937 tratadas com MeβCD são marcadamente sensibilizados a 40 kHz de ultra-som.

Enquanto os nossos protocolos de sonicação têm demonstrado actividade antineoplásica significativa in vitro, a metodologia corrente é limitada para trabalhar em modelos de cultura de vertebrados e pequena, que são capazes de encaixar nos frascos utilizados para a sonicação. Mostrámos que peixe-zebra pode ser ultra-sons pulsada com segurança usando ultra-som de baixa frequência (20 kHz), e que a tolerância aos agentes quimioterapêuticos é quantitativamente comparáveis ​​aosDoses toleradas por modelos murinos 26, sugerindo que a peixe-zebra que possui o tumor pode ser usado em investigações preliminares para avaliar a actividade anti-neoplásica in vivo destes protocolos. No entanto, a administração de agentes quimioterapêuticos antes da sonicação de modelos de mamíferos tem sido relatado na gama de 1 MHz, e tais protocolos pode provavelmente ser estendido para incorporar baixa frequência do ultra-som, bem como o colesterol de empobrecimento e agentes dirigida ao citoesqueleto.

Potenciais aplicações clínicas desta forma de SDT pode envolver sonicação sangue extracorporal em que os agentes antineoplásicos são administrados por via intravenosa (iv) antes de o sangue a ser removido por ultra-sons 25. Esse método remove barreiras de som potenciais colocados pela anatomia humana, e pode ser uma maneira eficaz para danificar blastos leucêmicos, assim como metástases de tumores sólidos. É também possível que o colesterol de empobrecimento e agentes dirigida-citoesqueleto poderiaser utilizado em protocolos de HIFU que já estão a ser examinadas na clínica, numa tentativa de melhorar a eficácia deste tipo de tratamento.

Os métodos descritos no presente estudo são capazes de avaliar o valor de potenciais sonosensitizers e aperfeiçoamento do sistema pode melhorar este utilitário. No entanto, há muitas variáveis ​​a serem consideradas ao usar esses legados de ultra-som, incluindo a qualidade da fonte de alimentação, focos acústico, e variação individual entre os conversores. Portanto, futuras pesquisas incidirá sobre visualizando as ondas sonoras e entender sua influência nos resultados. SDT tem mostrado melhorar a lise celular in vitro, e podem vir a ser clinicamente viável se mais dados in vivo em modelos de mamíferos são adquiridas. Experiências examinando outras características de potencial risco de células malignas, bem como várias modalidades combinadas envolvendo múltiplos agentes de ultra-sons e continuar no nosso laboratório.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à equipe do workshop do Departamento de Física da Universidade de Syracuse por sua assistência inovadora em questões relacionadas ao nosso projeto de sistema.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio Dulbecco's Modificado de Iscove com NaHCO3 e Hepes de 25mM Life Technologies12440079
Solução de Anfotericina B Sigma-AldrichA2942 
Solução de Penicilina/Estreptomicina 100x Life Technologies10378-016
Soro Fetal BovinoSigma-Aldrich12105
Branson SLPe 40kHz Disruptor de Células com 3" (25mm) CuphornUltrasonics101-063-726dispositivo de sonicação
Brisk Heat SDC Benchtop Digital Controlador de temperatura com Aquecedor de Copo de 1000 mlBrisk HeatSDCJF1A-GBH1000-1usado para controle de temperatura
Medidor de Células Z2 da Beckman-Coulter com AccuComp® SoftwareBeckman-Coulter6605700
Bio-Rad TC20 Contador de Células AutomatizadoBio-Rad145-0102
Gentamicina 50 mg/mlSigma-AldrichG1397 
Solução Azul de TripanoSigma-AldrichT8154
Falcon 50 ml e 25 ml Frascos de Cultura VentiladosFisher Scientific353082
Lonza L-Glutamina 200 mM 0,85% NaClLonza17-605C 
Tubos de Microcentrífuga Seal-Rite 1.5 mlUSA Scientific1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Frascos e tampasBeckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet BrandTech Scientific26330
USA Scientific 10 ml Pipetas Sorológicas DescartáveisUSA Scientific1071-0810
Tip One 100 μ l e 1.000 μ l Dicas de FiltroUSA Scientific1120-1840, 1126-7810
100 μ l Micropipeta Wheaton851164
1.000 μ l MicropipetaWheaton851168
BioRad Lâminas de Contagem de Câmara DuplaBio-Rad145-0015
Forma Scientific Incubadora de câmara dupla com camisa de águaForma Scientific3131
Tektronix  DPO 2002B Osciloscópio de Fósforo DigitalTektronixDPO2002Busado para medir a forma de onda ultrassônica
PPB MegaSonics Modelo PB-500 Medidor de Energia UltrassônicoPPB MegasonicsPB-500 utilizada para avaliar a intensidade sonora em W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 HidrofoneTeledyneTC4013-1 conecta-se ao osciloscópio 
Frascos Wheaton de 250 mlSigma-AldrichZ364827
Frascos de Cintilação de Vidro de 20 ml Sigma-AldrichZ190527
Beckman-Coulter Beckman-CoulterN/Adiluente para contador Z2
Clorofórmio 99%Sigma-AldrichC2432
Etanol 200 Prova Anidro Sigma-Aldrich459836
Óleo MineralN/A
XTT Kit de Ensaio de Proliferação CelularATCC30-1011K
Leitor de Microplacas de 96 PoçosCole-Palmer  EW-13055-54
U937 Células de Leucemia Monocítica HumanaATCCCRL­ 1593,2
células monocíticas humanas ATCCTIB-202
Aquecedor Solução salina isotônica da leucemia THP1

Referências

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