Estudos de desenvolvimento palato são motivadas pela incidência de fenda palatina, um defeito de nascença que impõe uma carga tremenda de saúde e pode deixar desfiguração duradoura. Nós demonstramos aqui uma técnica para prateleiras palatinas cultura que podem ser utilizados para estudar diferentes vias de sinalização envolvidos no desenvolvimento do palato e de fusão.
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Artigo de método
Método de Estudar Palatal Fusão usando estático Órgão Cultura
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fissura labiopalatina estão entre os mais comuns de todos os defeitos de nascimento. As formas palato secundário de prateleiras mesenquimais cobertas com epitélio que adere para formar a costura linha média epitelial (MES). As teorias sugerem que as células MES seguir um epitelial para mesenquimal (EMT), apoptose e migração, fazendo um paladar fundido 1. Desintegração completa dos MES é a fase essencial final de palatal confluência com áreas células mesenquimais. Nós fornecemos um método de cultura de órgãos paladar. O protocolo desenvolvido em vitro permite o estudo de processos biológicos e moleculares durante a fusão. As aplicações desta técnica são numerosos, incluindo avaliando respostas aos agentes químicos exógenos, efeitos de fatores de regulação e de crescimento e proteínas específicas. Palatal cultura de órgãos tem um número de vantagens, incluindo a manipulação em diferentes fases de desenvolvimento que não é possível, utilizando estudos in vivo.
Introdução
Fendas orofaciais são os defeitos de nascimento craniofaciais mais predominantes. Além disso, levando em consideração todos os possíveis defeitos craniofaciais, estes são a segunda anomalia nascimento mais comum em recém-nascidos 2. Fenda palatina ocorre em aproximadamente 1 em cada 700 nascimentos nos Estados Unidos (EUA) a cada ano, a incidência de fenda palatina é igual a 475 crianças nascidas com fissuras palatinas por mês ou 15 crianças com fissuras por dia 3. Cerca de 1% das crianças nasceram em todo o mundo a cada ano apresentam alguma forma de dysmorphology craniofacial.
Fendas do palato e lábio precisa de um procedimento muito caro e complicado, com implicações ao longo da vida para os pacientes que têm essa anomalia. O custo estimado para cada paciente com fissura oral é de aproximadamente $ 100,000 4. O tratamento de um paciente com fissura labiopalatina requer uma equipe de médicos, incluindo cirurgiões craniofaciais, otorrinolaringologistas, geneticistas, anestesiologistas,fonoaudiológicas patologistas, nutricionistas, ortodontistas, prosthodontists, psicólogos, neurocirurgiões e oftalmologistas.
Em palatogenesis, o palato secundário surge como conseqüências emparelhados, que inicialmente crescem verticalmente e se submetem a elevação prateleira palatal acima do dorso da língua. Após elevação, as lâminas palatinas emparelhados crescem em direcção da linha média (em E14.5 -E15 em ratinhos e em seres humanos semana 9). O epitélio borda medial (MEE), que cobre a ponta prateleira adere formar a costura linha média epitelial.
Isto é seguido por epitelial para mesenquimal e / ou apoptose para permitir mesenquimais confluência. Adesão de se opor MEE é um evento essencial cuja alteração provoca fissura palatina. No entanto, poucos estudos investigaram a adesão inicial de 5 palatais prateleiras. As formas do palato duro através da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos. O desenvolvimento anormal do paladar pode produzir cleft paladares com ou sem envolvimento de lábio.
As técnicas de cultura de órgãos paladar tinha sido amplamente utilizado para muitos laboratórios nos últimos 30 anos 6,7.
Neste protocolo, descrever em detalhes um método de dissecção palatal e cultura de órgão estático. A vantagem de uma cultura de órgãos imóvel é que ele permite que lâminas palatinas para fundir. Esta técnica tinha sido usada com sucesso em nosso laboratório para muitos de fusão e de sinalização experimentos 8,9. No entanto, o âmbito da técnica é muito grande e pode ser utilizado sempre que sistema de cultura de órgão estático é necessário, incluindo a avaliação de respostas a agentes químicos exógenos, os efeitos de factores de crescimento em diferentes vias reguladoras e proteínas específicas.
Figura 1. Rato Palatogenesis. Estágios de desenvolvimento do palato camundongos. (BF) ELE Digitalizaçãomicrografias ctron (SEM) do palato secundário, por vezes, de desenvolvimento representativas. As setas vermelhas: mostrar a parte inicial da adesão palatal e fusão. Setas amarelas: Ponto para o espaço entre os paladares primárias e secundárias que irão desaparecer após a fusão (reproduzido a partir de Kaufman 11 com a permissão de PLoS ONE).
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Protocolo
Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o local.
1. Preparação de Instrumentos dissecação e Meios de Cultura
- Pré-lavagem todos os instrumentos a serem usados na dissecção com 3% de peróxido de hidrogénio e, em seguida, em autoclave a 121 ° C durante 20 min. Filtrar meios BGJb com solução de antibiótico e antimicótico usando um filtro de 0,22 um do tamanho de poros com sucção de vácuo em uma capa.
2. Preparação de Equipamentos Cultura
- Corte filtros de membrana de policarbonato que irá apoiar os órgãos palatais em pequenos triângulos, spray com 70% de álcool e deixe secar. Prepare prato Centro de Bem-Organ Culture (60x15 mm), colocando uma grade limpos e esterilizados de forma triangular equilátero fio (20 mm) sobre a placa de cultura de órgãos. Em seguida, encher o poço com 1 ml de BGJB meios de cultura de mídia. NOTA: A mídia deve ser suficiente para atingir o nível da rede sem submergir os paladares. Colocar os filtros de membrana, o lado brilhante para baixo, em cima da grelha (3-4 membranas por grade) .Depending na experiência, o tratamento (proteínas, anticorpos ou inibidores) podem ser adicionados aos meios
3. mouse Embryo Recolha e Preparação para a Cultura
- Para obter embriões tipo selvagem do rato, uso cronometrado 13,5 grávida CD-1 camundongo fundo genético tensão. Limpe a área de dissecção com etanol 70%.
NOTA: Outras estirpes de ratos pode ser usada. Nós preferimos ratinhos CD-1 por causa do maior número de maca. - Euthanize camundongos grávidas em E13.5 DPC (dias pós-coito) com 5% de isoflurano seguido por deslocamento cervical para segurar a morte usando protocolos aprovados.
- Spray de etanol a 70% sobre a superfície abdominal ventral para evitar que o pau de cabelo abdominal para os instrumentos. Em seguida, abra a cavidade abdominal ventralusando um forte franco-tesoura operacionais e micro-dissecando fórceps para localizar o útero. Usando fórceps, levantar todo o útero e separá-lo do corpo através do corte no corpo do útero e nas pontas dos cornos uterinos com uma luz de uma tesoura de funcionamento.
- Coloque o útero sobre uma toalha de papel sobre o gelo (De acordo com o guia de protocolo para o cuidado e uso de animais de laboratório). Cubra o útero com outra toalha de papel limpo para evitar a contaminação. Esterilizar os instrumentos, utilizando 70% spray de etanol antes de usar ainda mais. O útero e os embriões podem ser transportadas para o laboratório em gelo.
- Em uma câmara de fluxo laminar aberto, cuidadosamente fazer uma pequena abertura no saco vitelino com uma tesoura afiada-operacionais sem corte e micro-dissecando fórceps. Faça a maior abertura e, em seguida, empurre-o suavemente para exteriorizar o embrião a partir do saco vitelino.
- Transferir os embriões imediatamente para uma placa de Petri com frio salino tamponado com fosfato 1X (PBS) pH 7,4. Para garantir o palco adequado, examina O embrião sob um microscópio de dissecação para o corpo, o tamanho da cabeça e membro morfologia.
NOTA: Os embriões que não são na fase certa do desenvolvimento não são utilizados para o experimento.
Figura 2. Limb Bud Morfologia. O dianteiro e membros traseiros são verificados para o grau de recuo membrana entre os dígitos. No E13.5, todas as condensações dígitos são proeminentes, com o cinto e recortes distal entre os dígitos que aparece muito distinta. Os dígitos traseiras estão por trás por um meio-dia 12 de fileira superior:. Forelimb, fila inferior: pata traseira.
4. Palate Dissection
- Coloque um embrião de cada vez numa caixa de Petri com PBS sob o microscópio de dissecação. Usando as tesouras de dissecção pequenas pinças e separar a cabeça do corpo dos embriões.
- Segurando cuidadosamente o crânio do mouse acima do nível do olho com uma pinça (evitandoo processo maxilar) fazer duas incisões em ambos os lados da linha dos lábios. Em seguida, retire a mandíbula e língua. Isolar a região processo maxilar, fazendo um corte ao nível dos olhos e remova o cérebro, olhos, septo nasal e tecido adjacente.
Figura 3. Palate tecido coletado de 13,5 embriões, quando as prateleiras palato tinha elevados, mas não fez contato. As lâminas palatinas foram colocados em cultura de órgão em um filtro na interface mídia de ar durante 72 horas no modelo estático. (A) Nível de dissecação em E13.5 embrião. (B) Blue estrelas demarcar áreas para segurar o tecido com uma pinça durante a dissecção. (C) Vista de lâminas palatinas dissecados colocados em uma membrana de filtro trapezoidal. (D) Vista lateral do prato de cultura após a colocação do paladares dissecados e adição de meio de cultura.
- Coloque o lado bucal palatal e remover o septo nasal eo tecido em torno dele, mantendo o palato primário anexado para ajudar a orientar no sentido antero-posterior. Use uma colher espátula e transfira com muito cuidado as lâminas palatinas (lado nasal para baixo) para os filtros preparados nas grades nas placas de cultura. NOTA: Ajustar o volume de mídia para permitir a adequada interface de mídia de ar.
- Sob o microscópio estéreo, dissecar o palato primário e utilizar uma pinça para colocar as lâminas palatinas próximos uns dos outros. As lâminas palatinas não vai fundir se não forem colocados em contato. Cortar o filtro de membrana triangular em que a parte anterior do palato é localizado. A forma trapezoidal ajudará na localização da porção anterior do palato.
- Cultura das lâminas palatinas individualmente ou com dois ou três na mesma placa de cultura de órgãos utilizando meios de cultura BGJb.
5. A cultura Prateleiras Rato Palatinas
- Incubar a tissues a 37 ° C numa mistura de gás humidificada (5% de CO 2 e 95% de ar) durante 72 horas e mudança do meio cada 24 horas.
6. Palate Processing para análise histológica
- Corrigir os paladares após 72 horas em cultura com 4% de formaldeído / tampão fosfato salina O / N a 4 ° C C. Em seguida, suavemente com uma pipeta de transferência para a lavagem do tecido na placa de cultura com PBS. Enrole os paladares em um pedaço de toalhetes de laboratório e lugar na incorporação de cassetes.
NOTA: Envolvendo os paladares em toalhetes de laboratório evitar a sua perda durante o processo de desidratação. - Desidratar o tecido a seguir 70%, 80% e até 100% lavagens de etanol durante 1 hora, seguido pelo procedimento de parafina normal. Para a incorporação, coloque a parte anterior do palato de frente para a bandeja.
- Corte de série 6 mm seções na orientação coronal de anterior para posterior. Um palato seção completa vai render 350-450 seçons. Corar as secções com hematoxilina e eosina (H & E). 10 Pontuação cada 20 th seção usando o escore médio de fusão anteriormente descrito (MFS) escala (Tabela 1). 8
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Resultados
A técnica pode ser aplicada a diferentes tipos de experiments.The seguinte estudo foi concebido para testar o efeito teratogénico de nicotina in vitro em fusão palatino. Duas estirpes de ratos foram utilizados para esta experiência, CD1 e tecido C57.Palatal foi tratada com 0,06 e 6 mM concentrações de hemissulfato de nicotina. Observou-se que os padrões de fusão palatal e tempo foram diferentes nas duas estirpes diferentes. Em ratinhos CD1, lâminas palatinas do grupo controle continuou fusão no tempo maneira de...
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Discussão
O protocolo neste artigo fornece um método de dissecação lâminas palatinas a partir de embriões no dia embrionário 13,5. Lâminas palatinas a partir de embriões de ratinho foram cultivadas num meio de cultura isento de soro, numa atmosfera de 95% de O2 5% de CO2 a 37 ° C. Dissecção palatino bem sucedido é criticamente dependente de vários factores, em cada passo durante o processo a partir do momento embrionário dos ratinhos sacrificados para a realização da cultura. Um dos factores mais importantes...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores não têm nenhum agradecimento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicilina/Estreptomicina | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Placas de Petri | VWR | 25384-088 | 100 x15 mm |
| Placa de cultura de órgão de poço central | Falcon | #353037 | |
| Grade triangular de arame de | Feito sob medida com malha de arame de aço inoxidável para se ajustar bem ao prato de cultura de órgãos. | ||
| Filtro de policarbonato | GE & Water and Process Technologies | K04BP04700 | Microscópio estéreo preto de 0,4 mícron, 47 mm |
| ZEISS Capuz de cultura Stemi SR | |||
| NUAIRE Pinça | |||
| Dumont Medical | #5 | ||
| Tesoura de microdissecação | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Tesoura, reta, 8 cm de comprimento, pontas de 0,1 mm, lâminas de 5 mm, fabricada na Alemanha |
| Tesoura de microdissecação | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Tesoura, reta, 8,5 cm de comprimento, pontas de 0,025 mm x 0,015 mm, lâminas de 7 mm |
| Tesoura de microdissecação | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Tesoura de mola curva curva, 10,5 cm de comprimento, lâminas de 8 mm, de fabricação alemã |
| Currete cirúrgica (espátula de colher) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Capuz de laboratório protetor | Labconco | ||
| Incubadora | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 incubadora | |||
| CO2 | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fibra óptica Fonte | de luz Fibra leve de incorporação Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Toalhetes Statlab | EC301 | ||
| Kim VWR | 470173-504 |
Referências
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653(2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358(2011).
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Reimpressões e permissões
