A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

Summary

O uso de vários ângulos para cortar o cérebro do rato filhote, podemos melhorar em cima de uma fatia cerebral aguda anteriormente descrito que captura as conexões entre a maioria dos principais mesencéfalo e prosencéfalo estruturas auditivas.

Abstract

A capacidade do cérebro de processar informações sensoriais depende de conjuntos de projeções ascendentes e descendentes. Até recentemente, a única maneira de estudar esses dois sistemas e como eles interagem era com o uso de preparações in vivo. Grandes avanços foram feitos com fatias cerebrais agudas contendo as vias tálamo-corticais e córtico-talâmicas nos sistemas somatossensorial, visual e auditivo. Com refinamentos importantes em nossa recente modificação do corte tálamo-cortical auditivo¹, somos capazes de capturar de forma mais confiável as projeções entre a maioria das principais estruturas auditivas do mesencéfalo e do prosencéfalo: o colículo inferior (CI), o corpo geniculado medial (MGB), o núcleo reticular talâmico (TRN) e o córtex auditivo (AC). Com partes de todas essas conexões mantidas, somos capazes de responder a perguntas detalhadas que complementam as perguntas que podem ser respondidas com preparações in vivo. O uso de imagens de autofluorescência de flavoproteínas nos permite avaliar rapidamente a conectividade em qualquer fatia e orientar o experimento subsequente. Usando essa fatia em conjunto com técnicas de gravação e imagem, agora estamos mais bem equipados para entender como o processamento de informações ocorre em cada ponto do prosencéfalo auditivo à medida que a informação sobe para o córtex e o impacto da modulação cortical descendente. A impressão 3D para construir componentes da câmara da fatia permite perfusão frente e verso e amplo acesso a redes dentro da fatia e mantém as conexões generalizadas essenciais para a utilização total dessa preparação.

Introduction

No sistema auditivo, embora não haja processamento substancial de informação entre a periferia sensorial e colículo inferior, existe uma considerável processamento adicional antes que ela atinja o córtex auditivo. Sabemos muito pouco sobre como esse processamento é feito e, portanto, pouco sobre como essa transformação permite que o cérebro para interpretar informação sensorial recebida. Com a excepção do olfacto, cada um dos sentidos tem uma estrutura muito semelhante com sinais periféricos inicialmente ser retransmitido com alta fidelidade, que diminui à medida que o sinal sobe para o córtex. O córtex, em seguida, envia projecções para as estruturas inferiores para modular ainda mais a informação recebida. Este sistema complexo tem sido estudada numa variedade de maneiras in vivo, bem como em um número de preparações in vitro. No primeiro caso, todas as ligações estão intactas, permitindo que o pesquisador sondar qualquer conjunto de ligações, enquanto se controla a entrada sensorial e medindosaída em qualquer área. Com essa abordagem, há pouco ou nenhum controlo da grande variedade de outros factores de produção, incluindo outras entradas sensoriais, excitação e atenção, dando origem a uma produção intensamente complexo. In vitro, fatias de cérebro foram cortados para capturar um único set de projecções, ou duas áreas do cérebro ligadas, que permitem que pesquisadores para estimular e avaliar vários aferentes ou áreas do cérebro. Estes são muitas vezes fatias quer talamocorticais ou tectothalamic onde quer a entrada para o tálamo ou no tálamo e sua saída para o córtex são preservados ^2-5. Estas preparações permitem uma ampla variedade de manipulações farmacológicas, elétricas e optogenética. No entanto, com apenas duas regiões do cérebro, que avaliam principalmente à transferência de informações e falta a capacidade de avaliar a transformação de informação à medida que passa através do tálamo. Além disso, a projecção reticulo-tálamo, o que pode jogar um papel na modulação da atenção é ^6-9 PRESENT nesta fatia. Aqui demonstramos melhorias sobre nossa preparação anterior ^{1, que} permite o controle investigador de várias entradas para o tálamo para dar uma perspectiva única de como os portões tálamo e filtros de informação. Nós casal Esta preparação fatia romance com imagens flavoprotein autofluorescência para avaliar a conectividade fatia e análise de ativação de grande escala, a imagem latente de cálcio no tálamo para análise da população neuronal, e gravação de uma única célula para medir o impacto das várias entradas em um nível única célula.

Para auxiliar na manutenção destas ligações generalizadas nós também têm desenvolvido uma série de modificações do âncora fatia normal (aka "harpa") para a realização da fatia do cérebro no lugar e uma ponte para elevar a fatia para maior perfusão. A harpa é projetado em forma de ferradura modificado para cercar a fatia e permitir a pontos de fixação personalizáveis ​​para as cordas da harpa. Três cordas sãoligado de tal modo que i) um encontra-se horizontalmente ao longo do bordo medial da fatia, ii) estende-se a partir da extremidade caudal do IC para a extremidade caudal do CA e iii) estende-se na diagonal a partir do bordo medial da fatia para uma área rostral à AC (ver Figura 1A). Pequenos recortes no quadro para colagem (com cola de cianoacrilato) de harpas cordas para permitir uma diminuição da quantidade de pressão sobre a fatia para ajudar a manter a integridade da fatia (ver Figura 1B). Ao usar a impressão tridimensional, somos capazes de harpas de design personalizado com as nossas especificações únicas, bem como pontes que permitem o fluxo ideal de artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) acima e abaixo do tecido. Isso também mantém grandes áreas para a luz para penetrar no tecido para patch-clamp eletrofisiologia.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade de Illinois. Todos os animais foram alojados em instalações de cuidados de animais aprovados pela Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care. Foi feito todos os esforços para minimizar o número de animais utilizados e reduzir o sofrimento em todas as fases do estudo.

1. Preparação e Remoção de cérebro de rato para Cortando

1. Prepare-se para perfusão e fatia de incubação.
   1. Cerca de 30 minutos antes de cortar, preparar alta solução de corte de sacarose e de baixo aCSF cálcio para a incubação da fatia antes da gravação ou imagem.
   2. Colocar para fora todas as ferramentas necessárias (grandes tesouras cegas finais, pequenas tesouras primavera, pinças anatômicas, grandes tesouras ou guilhotina, íris tesouras, joalheiros fórceps, seringa de 10 ml com agulha de 27G x 1/2 polegadas, pequeno pedaço de 1 cm x 2 cm de filtro papel, e uma pipeta Pasteur com ponta quebrada para sltransferência de gelo) para perfusão e corte, e preparar a bandeja de perfusão.
   3. Configurar câmara com oxigenado aCSF incubação num banho de água ³² o C e um prato de cultura preenchido com solução de corte.
2. Prepare corte palco para cortar.
   1. Corte um pequeno pedaço de agar a 3%, aproximadamente, 1 cm ³ para usar como um batente para o cérebro e 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm para uma colisão para ser utilizado para sustentar o IC.
   2. Cole o batente traseiro para o palco com adesivo de cianoacrilato, bem como a saliência no lado direito do batente de tal modo que eles formam um ângulo de ⁸⁰ °.
3. Remover o cérebro.
   1. Profundamente anestesiar a p12-p20 (idealmente p14-18) mouse com cetamina 100 mg / kg e xylaxine 3 mg / kg (ou procedimento aprovado comitê de ética comparáveis).
      Nota: Confirme nível anestesia adequada através de falta de resposta aos pés pitada. À medida que o animal é brevemente sob anestesia, pomada oftálmica é desnecessária.
   2. Usando sem cortetesoura acabar, expor a caixa torácica do apêndice xifóide até o pescoço.
      1. Encontre o apêndice xifóide, e faça um corte horizontal de aproximadamente 1,5 cm.
      2. Faça dois cortes verticais das extremidades do corte horizontal anterior para os ombros, aproximadamente 1,5 cm cada.
   3. Corte através do diafragma e as junções costocondrais para expor o coração.
   4. Com uma tesoura pequena mola, faça um pequeno, 2-5 mm cortar no átrio direito, a partir do ventral para dorsal lado do coração.
   5. Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 27G x 1/2 de polegada, injectar o ventrículo esquerdo e rapidamente perfundir o animal com elevado corte solução de sacarose.
   6. Quando o sangue corre claro, usar a tesoura maiores para remover a cabeça.
      Nota: Não temos sistematicamente avaliada a utilidade da perfusão. No entanto, em nossa experiência, a perfusão transcardíaca em ratinhos jovens este pode ser feito com quase 100% de sucesso, e tem a vantagem de eliminar bl vermelhoood células, o que pode interferir com fluorescência e imagem.
   7. Corte a pele para baixo da linha média para expor o crânio.
   8. Usando íris dobrados tesoura, corte o crânio entre os olhos, em seguida, começando a partir do corte entre os olhos, cuidadosamente cortadas de anterior para posterior ao longo da sutura mediana tomando cuidado para não danificar o cérebro por baixo.
      Nota: A dura geralmente sai com o crânio. Se necessário, retire a dura antes de retirar cuidadosamente o cérebro.
   9. Usando uma pinça joalheiro, forçar a abertura do crânio e remova cuidadosamente o cérebro, em seguida, colocar o cérebro em solução de corte. Tome cuidado para não danificar o córtex.

2. Preparação do cérebro por Cortando

1. Preparando cérebro para montagem em vibratome palco.
   1. Usando uma lâmina marcada com duas linhas ^a 90 o e uma linha diagonal em ¹⁷ o da parte superior esquerda para a direita inferior, interseção onde as duas linhas se encontram, coloque o lado do cérebro dorsal para cima, utilizandouma lâmina de barbear, de 2-4 mm de remover o cérebro extremidade rostral criando uma superfície plana.
   2. Coloque cérebro lado do caudal sobre a superfície plana recentemente criado, e alinhar a superfície dorsal do cérebro com a horizontal e da linha média do cérebro com a linha vertical.
   3. Alinhe a lâmina de barbear com a linha ¹⁷ o, incline a lâmina em um ângulo de ³⁰ ° e retire cerca de 3 mm do córtex direito em um corte diagonal duplo ⁽¹⁷ o do plano horizontal e ⁶⁰ o do coronal).
2. Montagem cérebro em vibratome palco.
   1. Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro de 1 cm x 2 cm sobre o lado ventral do cérebro, de forma que a dimensão do comprimento é perpendicular à linha mediana.
   2. Cuidadosamente aplicar uma pequena quantidade de adesivo de cianoacrilato para a área em frente do batente traseiro (e para a esquerda da colisão).
   3. Coloque o cérebro diagonalmente duplo corte para a cola de modo a que a parte caudal do cérebro e do encéfalo posterior são prOP sobre a colisão eo lado direito do cérebro é contra o anti-retorno.
   4. Delicadamente pressionar para baixo sobre o cérebro, assegurando que toda a superfície está em contacto com a câmara de corte.

3. A obtenção da Colliculo-tálamo-cortical Slice

1. Assumir rapidamente o estágio de corte e coloque no vibratome, encher o palco com uma solução de corte.
2. Alinhar a lâmina com a parte superior (lado ventral) no cérebro.
3. Remover 1-1,5 mm a partir do topo do cérebro, remova 300-500 uM fatias e avaliar profundidade após a remoção.
   Nota: Quando o IC, o MGB, eo núcleo geniculado lateral (LGN) são visíveis, eo giro dentado forma uma forma 'C' levar de um a dois 600 um fatias. Ver a Figura 3A.
4. Coloque as fatias em câmara quente (32 ^{° C),} segurando.

4. Criação de Imagens do Slice

1. Preparação para a imagem latente flavoprotein autofluorescência.
   1. Preparar aCSF pela perfusão da fatia numa câmara de registo electrofisiológico padrão, bolha aCSF com _95% de O2 / 5% de CO _2.
   2. Puxe eletrodo de vidro para a estimulação. Observe que vários eletrodos estimulantes diferentes e configurações (vidro, tungsténio, fibra de carbono, monopolar, bipolar) todo o trabalho muito bem em conjunto com imagiologia flavoprotein autofluorescência.
   3. Ligue computador, câmera, micromanipulador, fonte de luz, estimulação software, software de captura de imagem.
   4. Perfundir a câmara de gravação com oxigenado aCSF, coloque ponte personalizado (projeto disponível em Materiais Complementares) para elevar a fatia na câmara.
      Nota: taxa de perfusão pode variar de acordo com qualquer indivíduo configurar; 5-15 mL / min é usada aqui.
   5. Coloque fatia na câmara, diminuir o nível de líquido na câmara para evitar que a fatia de levantar fora da ponte ao colocar harpa especialmente construído sobre fatia, tendo o cuidado de evitar a colocação de cordas da harpa sobre as vias de cooperação interEst (Figura 1A). Aumentar o nível de líquido para cerca de 1-2 mm acima da fatia para manter o fluxo aCSF acima e abaixo da fatia.
      Nota: Se o reposicionamento é necessário, use o fim Pasteur pipeta quebrado ou permitir que o nível aCSF a subir e utilize uma pinça com extremo cuidado.
   6. Inserir eletrodos de cloreto de prata em eletrodo de vidro cheio de aCSF, insira o eletrodo de vidro em micromanipulador e conectar-se ao estímulo isolador, e coloque cuidadosamente eletrodo de vidro no IC / substância branca levando a tálamo (ver Figura 1A).
2. Flavoproteína aquisição de imagem autofluorescência.
   1. Coletar imagens em 4 Hz (usando uma macro 2X objetivo corrigido ao infinito (NA 0,13)) e uma câmera para 105 seg enquanto estimular eletricamente (cada estímulo consiste de 1 seg de 40 Hz 2 ms pulsos tecido em 0,05 Hz cinco vezes), enquanto iluminando o tecido com luz azul 470-490 nm e 515 nm capturar acima. Certifique-se de que a imagem não é nem aVeja o escuro, nem apagado Figura 3 coluna esquerda para referência.
      Nota: Coleção tempo, frequência de recolha, e freqüência de estimulação pode ser alterado para se adequar ao experimento, o programa personalizado incluído no materiais complementares podem ser modificados como tal.
   2. Exportar imagens para Matlab, e utilizando o programa de escrita feito sob encomenda disponível em materiais complementares, para análise espectral de potência das imagens em 0,05 Hz. A imagem resultante mostrará vias conectados.
      Nota: O programa personalizado usa uma transformação Fourier rápida dos valores de pixel da série histórica para produzir a imagem.
3. Preparação para a imagiologia de cálcio.
   1. Prepare pequena câmara de incubação utilizando um prato de cultura de 3 cm e membrana cultura levantada para permitir aCSF para alcançar a parte superior e inferior da fatia, e lugar numa almofada de aquecimento para manter a temperatura a cerca de 32 ^{o C.}
   2. Preencha pequena câmara de incubação com aCSF morna e lentamente bolha com 95% O_2/5% de CO _2.
   3. Misturar 2 ul de Pluronic F-127 de ácido e 50 ug de Fura-02:00 dissolvido em 48 ul de DMSO.
   4. Lugar em fatia pequena câmara de incubação na membrana levantou e cuidadosamente usando uma micropipeta adicione a mistura de coloração diretamente acima do MGB (ou outra estrutura de interesse).
   5. Cubra fatias para prevenir o branqueamento antes da imagiologia, e permitem fatias a incubar durante 45 minutos - 1 hora.
   6. Retire as fatias a câmara de retenção aquecida para 10-15 minutos para lavar o excesso de material.
   7. Siga os passos 4.1.1 a 4.1.6 para preparação de estimular e imagem da fatia colliculo-tálamo-cortical.
4. Aquisição de imagem de cálcio.
   1. Coletar imagens em 10 Hz (utilizando uma objectiva de imersão 20X de água) por 25 segundos enquanto estimular eletricamente (cada estímulo consiste de um pulso de 2 ms) tecido a 0,2 Hz cinco vezes enquanto iluminando o tecido com 365 nm de luz e capturando fluorescência acima de 510 nm.
   2. Exportar imagens para Matlab e usar o programa escrito costume disponíveis em materiais complementares, para análise espectral de potência das imagens em 0.2 Hz. A imagem resultante mostrará células activas.

Results

Um exemplo de fatia de cérebro de ratinho colliculo-talamocortical obtido em P15 rato é mostrada na Figura 2. A fatia ideal irá conter os quatro principais estruturas auditivas do mesencéfalo e do prosencéfalo IC, MGB, TRN, e AC, que são activados quando o IC é estimulada (Figura 2A). Usando a análise de Fourier, o poder espectral é medido na frequência de estimulação elétrica, com regiões do cérebro ligadas mostrando atividade que é periódica e arrastado na freqüência ...

Discussion

Este protocolo descreve melhorias em relação a uma fatia cerebral colículo-tálamo-cortical descrita anteriormente em camundongos p12-20 para estudar o fluxo de informações no sistema auditivo¹. Este método tem uma série de vantagens sobre outras preparações semelhantes de fatias cerebrais, mantendo conexões entre mais áreas cerebrais em uma única fatia, o que dá aos investigadores novas ferramentas para entender a interação e interação entre os núcleos auditivos no prosencéfalo. Houve algumas modificações impo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		de corte com alto teor de sacarose	em mM: 206 sacarose, 10,0 MgCl2, 11,0 glicose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0,5 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
Baixo teor de cálcio aCSF			em mM: 126 NaCl, 3,0 MgCl2, 10,0 glicose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
aCSF			em mM: 126 NaCl, 2,0 MgCl2, 10,0 glicose, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
Isolador de estímulo	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lote: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lote: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lote: 1499369
Prato de cultura grande	Fisherbrand	08-757-13	Prato de cultura pequeno de 100 x 15 mm
Prato de cultura	Falcon	353001	35 x10 mm
Membrana de cultura elevada	Millicell	PICMORG50	Usado para manter a perfusão de fluido oxigenado em ambos os lados da fatia.
Cubo de fluorescência de imagem de flavoproteína	Olympus	UMNIB	470– 490 nm de excitação, 505 nm dicróico, 515 nm de emissão de longa duração.  Descobrimos que praticamente qualquer cubo de filtro de proteína de fluorescência verde funcionará aqui.
Cubo de fluorescência de imagem de cálcio	Omega Optical	BX-18	XF1005 saída de 365 nm, XF2001 400 nm dicróico, XF3080 510 nm de emissão
Ágar para bloqueio do cérebro			3% em peso na água
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems