Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino

Resumo

As células Caco-2 podem servir como um modelo in vitro para estudar o transporte de lipídios por enterócitos e drogas/vitaminas lipossolúveis. O sistema de membrana permeável separa o compartimento apical do basolateral, enquanto o sistema de expressão de lentivírus oferece um método eficaz de superexpressão gênica. O isolamento das lipoproteínas é confirmado por TEM.

Resumo

Estudos de absorção de gordura na dieta são geralmente conduzidos usando um modelo animal equipado com uma cânula linfática. Embora esse modelo animal seja amplamente aceito como o modelo in vivo de absorção de gordura na dieta, as técnicas cirúrgicas envolvidas são desafiadoras e caras. A manipulação genética do modelo animal também é cara e demorada. O modelo alternativo in vitro é indiscutivelmente mais acessível, economiza tempo e é menos desafiador. É importante ressaltar que o modelo in vitro permite que os investigadores examinem os enterócitos como um sistema isolado, reduzindo a complexidade inerente ao modelo de todo o organismo. Este artigo descreve como as células de carcinoma de cólon humano (Caco-2) podem servir como um modelo in vitro para estudar o transporte de lipídios por enterócitos e medicamentos e vitaminas lipossolúveis. Explica a manutenção adequada das células Caco-2 e a preparação de sua mistura lipídica; e discute ainda a valiosa opção de usar o sistema de membrana permeável. Como as células Caco-2 diferenciadas são polarizadas, a principal vantagem de usar o sistema de membrana permeável é que ele separa o compartimento apical do basolateral. Consequentemente, a mistura lipídica pode ser adicionada ao compartimento apical, enquanto as lipoproteínas podem ser coletadas do compartimento basolateral. Além disso, a eficácia do sistema de expressão de lentivírus na regulação positiva da expressão gênica em células Caco-2 é discutida. Por fim, este artigo descreve como confirmar o isolamento bem-sucedido de lipoproteínas intestinais por microscopia eletrônica de transmissão (MET).

Introdução

Estudos de absorção intestinal de gordura da dieta, e drogas e vitaminas solúveis em lípidos pode ser realizada in vivo usando um modelo de fistula linfática ^1-4. No entanto, as técnicas cirúrgicas envolvidas não são apenas um desafio, mas também caro. Embora abordagens in vivo com base na análise fecal podem ser utilizados, eles são utilizados principalmente para determinar a percentagem de absorção pelo tracto gastrointestinal ^2,5. O modelo in vitro descrito neste trabalho é mais rentável, e as técnicas envolvidas são, indiscutivelmente, menos desafiador. Estudos de modificação genética são também mais económico e me....

Protocolo

1. A manutenção das células Caco-2

1. Usando regulares pratos de cultura de tecidos
   1. Descongelar as células Caco-2 a partir de um frasco congelado colocando o frasco num banho de água a 37 C °, e adicioná-los imediatamente para uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio de crescimento (15% de soro bovino fetal pré-aquecido (FBS ) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM)).
      1. Quando as células Caco-2 atingiram 50-70% de confluência, dividi-los 1: 6 por incubação das células com 3 ml de 0,05% de tripsina / 0,53 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 ° C até que eles são destacados (15 min) . Para evitar aglomeração ....

Resultados

Figura 1 apresenta normais de 13 dias pós-confluentes células Caco-2. O aparecimento de estruturas em forma de cúpula e gotículas lipídicas intracelulares são características diferenciadas de células Caco-2. Quando as células Caco-2 não são dispersos igualmente durante a sementeira, eles vão aglutinar-se e crescer demais em certas áreas do prato; e haverá algumas áreas no prato sem quaisquer células. Roda e colocando o prato numa superfície inclinada deve ser evitada. Também é importante notar que o pós.......

Discussão

Neste artigo, os dois sistemas que podem ser utilizados para manter células Caco-2 são descritos, a saber, o prato de cultura de tecidos normal e a membrana permeável. Os benefícios de usar o sistema de membrana permeável incluem a separação do apical e basolateral os compartimentos, e a capacidade de incubar a mistura de lípidos e recolher a secreção de lipoproteínas simultaneamente. No entanto, as pastilhas de membranas permeáveis ​​são caros, e a sua membrana de policarbonato não permite uma boa visibilidade celular........

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	VWR	16750-112	Pré-aqueça o meio de crescimento em uma placa de cultura de tecidos individual antes de adicionar células
FBS	Fisher	3600511	Não inativamos nosso soro
Tripsina	VWR	45000-660	As células podem ser lavadas com PBS antes do tratamento com tripsina
Sistema de membrana permeável	Fisher	7200173	placa de 10 cm, tamanho de poro de 3 mm, membrana de policarbonato
placa de 10 cm	Fisher	08-772-E	Placa de cultura de tecidos
Placa de 15 cm	Fisher	08-772-24	Placa de cultura de tecidos
Placa de 24 poços	Fisher	12565163	Placa
de cultura de tecidos Reagente de transfecção à base de lipídios	Fisher	PRE2691	Pode ser substituído por outro reagente de transfecção
Meio de soro reduzido	Invitrogen	11058021	Para transfecção
pLL3.7 eGFP	Addgene	11795	https://www.addgene.org/11795/
Filtro de topo de garrafa	Fisher	9761120	poro de 0,45 mm
Polybrene	Fisher	NC9840454	10 mg/ml
Ácido oleico	Sigma	01383-5G	Previne o ciclo de congelamento e descongelamento
Lecitina	Lecitina de ovo	Fisher	IC10214625
Taurocolato de sódio	Fisher	NC9620276	Produto descontinuado; número de catálogo alternativo: 50-121-7956
Comprimido de coquetel inibidor de protease (sem EDTA)	Fisher	5892791001	Usado principalmente para amostras que precisam de análise TEM
Tubo de ultracentrífuga de policarbonato		Fisher NC9696153	Reutilizá-lo várias vezes irá colapsar o tubo
Tampa para tubo de ultracentrífuga	Fisher	NC9796914	É necessária uma ferramenta para remover o tubo/tampa do rotor
Seringa	Fisher	50-949-261	Filtro de
seringa	Fisher	09-719C	Tamanho dos poros = 0,2 mm; nylon
Ácido fosfotúngstico	Fisher	AC208310250	Para preparar ácido fosfotúngstico a 2%, pH 6,0
Pinça	Fisher	50-238-62	Extra fino e pontas fortes
Formvar/grade de carbono	Fisher	50-260-34	Formvar/filme de carbono grade quadrada 400 Cobre

descartável