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Artigo de método

Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino

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DOI:

10.3791/53086

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20 de agosto de 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

Neste artigo

Resumo

As células Caco-2 podem servir como um modelo in vitro para estudar o transporte de lipídios por enterócitos e drogas/vitaminas lipossolúveis. O sistema de membrana permeável separa o compartimento apical do basolateral, enquanto o sistema de expressão de lentivírus oferece um método eficaz de superexpressão gênica. O isolamento das lipoproteínas é confirmado por TEM.

Resumo

Estudos de absorção de gordura na dieta são geralmente conduzidos usando um modelo animal equipado com uma cânula linfática. Embora esse modelo animal seja amplamente aceito como o modelo in vivo de absorção de gordura na dieta, as técnicas cirúrgicas envolvidas são desafiadoras e caras. A manipulação genética do modelo animal também é cara e demorada. O modelo alternativo in vitro é indiscutivelmente mais acessível, economiza tempo e é menos desafiador. É importante ressaltar que o modelo in vitro permite que os investigadores examinem os enterócitos como um sistema isolado, reduzindo a complexidade inerente ao modelo de todo o organismo. Este artigo descreve como as células de carcinoma de cólon humano (Caco-2) podem servir como um modelo in vitro para estudar o transporte de lipídios por enterócitos e medicamentos e vitaminas lipossolúveis. Explica a manutenção adequada das células Caco-2 e a preparação de sua mistura lipídica; e discute ainda a valiosa opção de usar o sistema de membrana permeável. Como as células Caco-2 diferenciadas são polarizadas, a principal vantagem de usar o sistema de membrana permeável é que ele separa o compartimento apical do basolateral. Consequentemente, a mistura lipídica pode ser adicionada ao compartimento apical, enquanto as lipoproteínas podem ser coletadas do compartimento basolateral. Além disso, a eficácia do sistema de expressão de lentivírus na regulação positiva da expressão gênica em células Caco-2 é discutida. Por fim, este artigo descreve como confirmar o isolamento bem-sucedido de lipoproteínas intestinais por microscopia eletrônica de transmissão (MET).

Introdução

Estudos de absorção intestinal de gordura da dieta, e drogas e vitaminas solúveis em lípidos pode ser realizada in vivo usando um modelo de fistula linfática 1-4. No entanto, as técnicas cirúrgicas envolvidas não são apenas um desafio, mas também caro. Embora abordagens in vivo com base na análise fecal podem ser utilizados, eles são utilizados principalmente para determinar a percentagem de absorção pelo tracto gastrointestinal 2,5. O modelo in vitro descrito neste trabalho é mais rentável, e as técnicas envolvidas são, indiscutivelmente, menos desafiador. Estudos de modificação genética são também mais económico e menos quando eles são conduzidos usando este modelo in vitro demorado.

Uma vez que os materiais solúveis em lípidos que são absorvidos por enterócitos são empacotados em lipoproteínas de 6,7, a eficácia deste modelo in vitro para a produção de lipoproteínas é crucial. Os dois intestina principall lipoproteínas são quilomicrons e lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL). Os quilomicrons, lipoproteínas como definidas com 80 nm ou mais de diâmetro, são produzidos de forma rigorosa o intestino delgado, quando lípidos estão abundantemente presentes no lúmen gastrointestinal. Uma vez que eles são os maiores lipoproteínas, chylomicrons são concebivelmente os transportadores lipídicos mais eficientes. Este modelo in vitro, que é capaz de produzir quilomicrons 8, pode ser usado para estudar a absorção de gordura dietética, a vitamina solúvel em lípidos absorção pelo intestino, e biodisponibilidade oral da droga lipofílica. A presença de moléculas solúveis em lípidos, vitaminas ou drogas na fracção de lipoproteínas é um indicador da sua absorção pelo intestino delgado. Como discutido anteriormente, este modelo pode ser usado para melhorar a biodisponibilidade oral da droga lipofílica 6.

Este artigo descreve como células Caco-2 devem ser mantidas na membrana permeável ou regular pratos de cultura de tecidos, como os lipídios mixture para estimular a produção de lipoproteína deve ser preparado, como o sistema de expressão de lentivírus pode ser empregue para atingir a sobre-expressão eficaz, e como as lipoproteínas isolados devem ser analisados.

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Protocolo

1. A manutenção das células Caco-2

  1. Usando regulares pratos de cultura de tecidos
    1. Descongelar as células Caco-2 a partir de um frasco congelado colocando o frasco num banho de água a 37 C °, e adicioná-los imediatamente para uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio de crescimento (15% de soro bovino fetal pré-aquecido (FBS ) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM)).
      1. Quando as células Caco-2 atingiram 50-70% de confluência, dividi-los 1: 6 por incubação das células com 3 ml de 0,05% de tripsina / 0,53 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 ° C até que eles são destacados (15 min) . Para evitar aglomeração de células, mistura as células várias vezes por pipetagem suave. Adicionar 0,5 ml das células tripsinizadas a uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido.
    2. Agite ligeiramente os pratos várias vezes para a frente e para trás seguido por uma direção para a esquerda e para a direita. Evite rodar os pratosuma vez que pode resultar numa dispersão celular desigual.
    3. Colocar as cápsulas sobre uma superfície plana em uma incubadora a 37 ° C fornecido com 5% de CO 2. Superfícies inclinadas também podem resultar numa dispersão celular desigual.
    4. Troque a mídia de crescimento de um dia após o início da incubação.
    5. Monitorar as células e gravar no dia em que chegar a confluência. Isso levará cerca de uma semana para as células para alcançar confluência do dia eles estão divididos.
    6. Mudar o meio de crescimento, duas vezes por semana antes de as células atingirem confluência. Uma vez que as células atingiram a confluência, muda os meios de crescimento a cada dois dias. Depois que as células são 7-dias pós-confluentes, alterar a mídia de crescimento diário.
      Nota: As células estão prontas para experiências quando eles são de 13 dias pós-confluentes (Figura 1). Uma vez que as células acabará por se tornar menos eficaz na produção de lipoproteínas, utilização de células que se encontram entre 13 a 17 dias pós-confluentes 8. Vá para a etapa 3 sobre como conduzir o experimento.
  2. Usando o sistema de membrana permeável
    1. Semente as células Caco-2 no inserto membrana permeável tal como descrito no passo 1.1.1.1. acima. Evite o uso de células a partir de um frasco congelado porque o seu crescimento celular é normalmente mais lenta (período de recuperação). Resumidamente, adicionar 0,5 ml das células tripsinizadas para a câmara de apical (compartimento superior) que contém 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido. Além disso, adicionar 10 ml de meio de crescimento pré-aquecido para a câmara basolateral (compartimento inferior).
      Nota: Para as melhores práticas, adicione os meios de crescimento para a câmara apical primeiro e depois para a câmara basolateral. Ao remover a velha mídia, remova a mídia basolateral perante a mídia apical. Evitar picar a membrana de policarbonato, uma vez que pode romper a membrana.
    2. Devido à visibilidade pobre célula através da membrana de policarbonato, semear as células Caco-2 em um prato de cultura de tecidos regular com densidade semelhante, e usar este prato para julgar a confluência celular.
    3. Siga sPTE 1.1.2-1.1.6 acima.

2. Gene Overexpression

  1. Usando a abordagem de transfecção regulares
    1. Semente as células Caco-2 em um prato de cultura de tecidos como descrito no 1.1.1.1.-1.1.4 supra.
      Nota: Quando as células são cerca de 40-50% confluentes, eles estão prontos para ser transfectada.
    2. Adicionar 67 ul de reagente de transfecção de 472 ul de meio de soro reduzido os num tubo de microcentrífuga. Evitar o contacto do reagente de transfecção não diluída com a parede do tubo.
    3. Adicionar 23 g de pLL3.7 reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) 9 para o reagente de transfecção / meio de soro reduzido mistura.
    4. Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente.
    5. Substituir o meio de crescimento das células Caco-2 'com 8 ml de 10% de FBS em meio DMEM.
    6. Adicionar a mistura de ADN / reagente de transfecção / meio de soro reduzido, gota a gota para o prato.
    7. Agite ligeiramente os pratos várias vezes em uma frente e badirecção ckward seguido por um sentido para a esquerda e para a direita.
    8. Coloque o prato no 37 ° C incubadora.
    9. Substitua a mídia no prato com 10 ml de meio de crescimento por dia após o início da incubação.
    10. Monitorar a expressão do gene.
      1. Monitorar a expressão de genes sem 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) coloração. Usando um microscópio de fluorescência, determinar a percentagem de células que são verdes. A percentagem representa a eficiência da transfecção.
      2. Monitorar a expressão gênica com coloração DAPI.
        1. Lavam-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) três vezes.
        2. Fixar as células por adição de 10 ml de formaldeído a 4% em PBS (10 minutos de incubação à TA).
        3. Lavam-se as células com PBS três vezes.
        4. Incubar as células no escuro durante 15 min à temperatura ambiente com 8 ml de PBS contendo 1: 500 DAPI, 1% de BSA, 0,01% de digitonina.
        5. Lavam-se as células com PBS três vezes.
        6. VCcante um microscópio de fluorescência, determinar o número de células que são verde / azul em relação àqueles que são azuis (Figura 2 painel superior). A percentagem calculada representa a eficiência da transfecção.
  2. Usando o sistema de sobre-expressão de lentivírus 10
    1. Rim embrionário (HEK) Semear as células em um humanos 293T 15 centímetros prato de cultura de tecidos (10% de FBS em DMEM como seu meio de crescimento).
      Nota: Quando as células são cerca de 60-70% confluentes, eles estão prontos para ser transfectada.
    2. Adicionar 162 ul de reagente de transfecção de 1133 ul de os meio de soro reduzido em um tubo de microcentrífuga de 11. Evitar o contacto do reagente de transfecção não diluída com a parede do tubo.
    3. Adicionar 24 g de pLL3.7 eGFP (ou outra construção), 15,6? G de elemento de resposta a Rev (RRE), 6,0 ug de REV, e 8,4? G de glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG) para o reagente de transfecção / reduced mistura meio de soro.
    4. Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente.
    5. Substituir o meio de crescimento com 16 ml de 10% de FBS em DMEM.
    6. Adicionar a mistura de ADN / reagente de transfecção / meio de soro reduzido, gota a gota para o prato.
    7. Agite ligeiramente os pratos várias vezes para a frente e para trás seguido por uma direção para a esquerda e para a direita. É normal ver algumas das células HEK293T destacadas neste momento.
    8. Coloque o prato na incubadora.
    9. Após 24 horas de incubação, substituir a mídia no prato com 25 ml de meio de crescimento.
    10. No dia seguinte, recolher o meio de crescimento contendo o lentivírus (primeira coleção).
    11. Repita o passo 2.2.10 para coletar mais lentivírus (a segunda cobrança).
    12. Reúnem-se os primeiro e o segundo recolha, e remover os detritos celulares por centrifugação (2500 xg durante 5 min).
    13. Filtrar a coleção com um filtro descartável garrafa-top (0,45 poro), econcentra-se o vírus por centrifugação a recolha a 31.400 xg durante 2 horas à temperatura ambiente (rotor JA-20). Marcar a parte inferior do tubo de centrifugação em que o pelete é localizado. Decantar o sobrenadante, e deixar o tubo invertido à TA durante cerca de 15 min.
    14. Ressuspender o sedimento contendo vírus com 100 ul de PBS 1X. Evite bolhas.
    15. Armazenar o vírus concentrada a -80 ° C. Evite ciclos de congelamento e descongelamento.
    16. Determinar a quantidade óptima de vírus necessária para transduzir as células Caco-2 por meio de titulação. Para poupar custos, utilizar uma placa de 24 poços (0,3 ml de meio de crescimento / poço) em vez de um 10 centímetros prato de cultura de tecidos para a titulação.
      1. Adicionar quantidades crescentes do vírus concentrado (0, 1, 2, 5, 10, 25, e 50 uL / ​​poço) suplementado com polibreno (concentração final = 5 ug / ml) para a 40-70% confluentes células Caco-2. Agitar a placa de 24 poços como descrito em suavemente 1.1.2.
      2. Monitore sua expressão gênica (Passo 2.1.10.) (Figura 2 fundo4 painéis).
    17. Desde a expressão de transgene é geralmente sustentado, manter as células transduzidas para experiências futuras e monitorar continuamente a sua expressão gênica (Passo 2.1.10.).

3. Estimular o Lipoproteína Secreção

  1. Usando o prato de cultura de tecido normal
    1. Prepara-se uma mistura de lípidos de 100X através da mistura de 50 mg de ácido oleico, 40 mg de lecitina, e 48 mg de taurocolato de sódio. Levar o volume a 900 mL com PBS (o suficiente para pratos 8). Vortex vigorosamente a mistura de lípidos.
    2. Adicionar 900 ul da mistura de lípidos 100X em 89,1 ml de meio de crescimento. Misturar e filtrar a mídia contendo lípidos. As concentrações finais (1x) de ácido oleico, lecitina, e taurocolato de sódio é 2,0 mM, 1,36 mM e 1,0 mM, respectivamente.
    3. Adicionar 10 ml de meio contendo lípido para as células.
    4. Incubam-se as células com meio contendo o lípido durante 4 horas num 37° C incubadora.
    5. Lavam-se as células com PBS três vezes.
    6. Adicionam-se 10 ml do meio de crescimento para as células para recolher a secreção de lipoproteínas.
    7. Incubar durante 2 horas num banho a 37 ° C incubadora.
    8. Recolhe a mídia contendo lipoproteína.
  2. Usando o sistema de membrana permeável
    1. Siga os passos 3.1.1-3.1.2 para preparar a mistura de lípidos.
    2. Adicionar 10 ml de meio contendo lípido para a câmara de apical e 10 ml de meio de crescimento para a câmara basolateral.
    3. Incuba-se durante 4 horas numa incubadora de 37 ° C. Recolhe a mídia contendo lipoproteína na câmara basolateral.

4. Isolamento de lipoproteína (Figura 3)

  1. Remover os restos celulares do meio contendo lipoproteína por centrifugação (2000 xg durante 5 min).
  2. Decantar a mídia em um tubo de 50 ml.
  3. Adicionar 5,95 g de cloreto de sódio para a mídia.
  4. Se a sample serão analisados ​​pelo MET, adicionar um inibidor da protease de cocktail comprimido para manter a integridade das lipoproteínas.
  5. Levar o volume a 23 ml com água (1,2 g / ml de solução de NaCl a densidade).
  6. Dissolve-se os solutos completamente.
  7. Decantar a totalidade da solução para um tubo de ultracentrífuga policarbonato.
  8. Suavemente sobrepor a solução densidade 1,2 g / ml com 0,5 ml de água (1,0 g / ml de densidade).
  9. Equilibrar o tubo por peso e não por volume.
  10. Carregue suavemente os tubos no rotor T865.
  11. Rodar as amostras na ultracentrífuga a 429.460 xg durante 24 horas a 4 ° C.
  12. Isolar imediatamente o topo 0,5 ml de solução por pipetagem suave. Mantenha o tubo o mais imóvel possível.

5. Análise TEM

  1. Prepare 5 ml de ácido fosfotúngstico a 2% (w / v) e ajustar o pH a 6,0.
  2. Filtra-se o ácido fosfotúngstico a 2% com um filtro de seringa (tamanho de poro: 0,2 um).
  3. Gota de 20 ul da amostra em um prato de lipoproteína estéril.
  4. Gota de 20 ul de ácido fosfotúngstico a 2% filtrada ao lado da amostra no mesmo prato.
  5. Suavemente soltar uma grade EM com o lado maçante descansando na amostra.
  6. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
  7. Bater levemente o lado da grade de EM num papel de filtro para remover a amostra da rede.
  8. Suavemente soltar a grade EM com o lado maçante descansando no ácido fosfotúngstico 2%.
  9. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
  10. Bater levemente o lado da grade de EM num papel de filtro para remover o ácido fosfotúngstico a partir da rede.
  11. Usando uma ETM, capturar as imagens das lipoproteínas (Figura 4).

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Resultados

Figura 1 apresenta normais de 13 dias pós-confluentes células Caco-2. O aparecimento de estruturas em forma de cúpula e gotículas lipídicas intracelulares são características diferenciadas de células Caco-2. Quando as células Caco-2 não são dispersos igualmente durante a sementeira, eles vão aglutinar-se e crescer demais em certas áreas do prato; e haverá algumas áreas no prato sem quaisquer células. Roda e colocando o prato numa superfície inclinada deve ser evitada. Também é importante notar que o pós...

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Discussão

Neste artigo, os dois sistemas que podem ser utilizados para manter células Caco-2 são descritos, a saber, o prato de cultura de tecidos normal e a membrana permeável. Os benefícios de usar o sistema de membrana permeável incluem a separação do apical e basolateral os compartimentos, e a capacidade de incubar a mistura de lípidos e recolher a secreção de lipoproteínas simultaneamente. No entanto, as pastilhas de membranas permeáveis ​​são caros, e a sua membrana de policarbonato não permite uma boa visibilidade celular....

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Divulgações

O autor não tem nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Seed Grant Award da California Northstate University College of Pharmacy (para AMN). Os autores gostariam de agradecer à Faculdade de Farmácia da California Northstate University por cobrir o custo de publicação deste artigo e a George Talbott por sua ajuda na edição deste manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMVWR16750-112Pré-aqueça o meio de crescimento em uma placa de cultura de tecidos individual antes de adicionar células
FBSFisher3600511Não inativamos nosso soro
TripsinaVWR45000-660As células podem ser lavadas com PBS antes do tratamento com tripsina 
Sistema de membrana permeávelFisher7200173placa de 10 cm, tamanho de poro de 3 mm, membrana de policarbonato
placa de 10 cmFisher08-772-EPlaca de cultura de tecidos
Placa de 15 cmFisher08-772-24Placa de cultura de tecidos
Placa de 24 poçosFisher12565163Placa
de cultura de tecidos Reagente de transfecção à base de lipídiosFisherPRE2691Pode ser substituído por outro reagente de transfecção
Meio de soro reduzidoInvitrogen11058021Para transfecção
pLL3.7 eGFPAddgene11795https://www.addgene.org/11795/
Filtro de topo de garrafaFisher9761120poro de 0,45 mm
PolybreneFisherNC984045410 mg/ml
Ácido oleicoSigma01383-5GPrevine o ciclo de congelamento e descongelamento
Lecitina Lecitina de ovoFisherIC10214625
Taurocolato de sódioFisherNC9620276Produto descontinuado; número de catálogo alternativo: 50-121-7956
Comprimido de coquetel inibidor de protease (sem EDTA)Fisher5892791001Usado principalmente para amostras que precisam de análise TEM
Tubo de ultracentrífuga de policarbonatoFisher NC9696153Reutilizá-lo várias vezes irá colapsar o tubo
Tampa para tubo de ultracentrífugaFisherNC9796914É necessária uma ferramenta para remover o tubo/tampa do rotor
SeringaFisher50-949-261Filtro de
seringaFisher09-719CTamanho dos poros = 0,2 mm; nylon
Ácido fosfotúngsticoFisherAC208310250Para preparar ácido fosfotúngstico a 2%, pH 6,0
PinçaFisher50-238-62Extra fino e pontas fortes
Formvar/grade de carbonoFisher50-260-34Formvar/filme de carbono grade quadrada 400 Cobre
descartável

Referências

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
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  12. Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
  13. Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
  14. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).

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