Um método computadorizado reprodutível para quantificação da densidade capilar usando capilaroscopia periungueal

Summary

A capilaroscopia é uma metodologia não invasiva, eficiente, relativamente barata e fácil de aprender para visualizar diretamente os capilares na microcirculação. No entanto, apenas uma publicação até o momento descreve a confiabilidade de um programa de software complexo disponível para quantificar dados de capilaroscopia. Aqui, apresentamos um protocolo simples e confiável para quantificar capilares usando um algoritmo padronizado.

Abstract

A capilaroscopia é uma metodologia não-invasiva, eficaz, relativamente barata e fácil de aprender para visualizar diretamente a microcirculação. A técnica capilaroscopia pode fornecer insights sobre microvascular saúde de um paciente, levando a uma variedade de dermatológica potencialmente valiosa, oftalmológica, aplicações clínicas reumatológicas e cardiovasculares. Além disso, o crescimento de tumores pode ser dependente da angiogénese, que pode ser quantificada medindo a densidade de microvasos no interior do tumor. No entanto, não há atualmente pouca ou nenhuma padronização de técnicas, e apenas uma publicação a data relata a confiabilidade de um disponíveis atualmente algoritmos complexos baseados computador para quantificar dados capilaroscópicas. ¹ Este artigo descreve um algoritmo novo, mais simples, confiável, capilar padronizado contagem para quantificar dados capilaroscópicas das cutículas. Um algoritmo capilaroscopia simples, reprodutível informatizado como este iria facilitar maisuso generalizado da técnica entre pesquisadores e clínicos. Muitos pesquisadores atualmente analisar imagens capilaroscópicas com a mão, promovendo a fadiga do usuário e da subjetividade dos resultados. Este artigo descreve um romance, easy-to-use automatizado algoritmo de processamento de imagem, além de um algoritmo de contagem reprodutível, semi-automatizado. Este algoritmo permite a análise de imagens em minutos, reduzindo a subjetividade; apenas uma quantidade mínima de tempo de treinamento (em nossa experiência, a menos de 1 hora) é necessário para aprender a técnica.

Introduction

Imaging microvascular é um campo de rápido crescimento, com muitos potenciais aplicações clínicas. ² Por exemplo, os oncologistas estão usando imagens de microvasos para determinar a extensão da angiogénese tumoral, produzindo informações valiosas sobre o estado do tumor e insights sobre possíveis opções de tratamento. ^{3 4} Contudo, capilaroscopia periungueal é talvez a forma eficiente e amplamente aplicáveis ​​maioria de custo da imagiologia microvascular. Os pesquisadores estão usando o vídeo capilaroscopia periungueal para estudar as taxas de fluxo de sangue e investigar a morfologia capilar. ^{5 6} Ambos vídeo e de imagem estática capilaroscopia periungueal são adjuntos para cuidar de diagnóstico e tratamento de fenômeno e várias doenças do tecido conjuntivo de Raynaud, como a esclerose sistêmica. ²

A capilaroscopia periungueal tem várias aplicações potenciais cardiovasculares também. A pesquisa atual sugere usando capilaroscopia periunguealque diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2 pacientes apresentam uma elevada prevalência de morfologia capilar anormal, ainda têm densidades capilares inalteradas em comparação com indivíduos não-diabéticos. ^7-8 Capilaroscopia também tem sido estudada experimentalmente em hipertensão. Rarefação capilar estrutural que conduz a uma reduzida densidade capilar tem sido demonstrada em indivíduos hipertensos quando comparados com indivíduos não-hipertensos. ^9-10 Em contraste com estes pacientes hipertensos mais velhos que apresentam rarefação estrutural, a pesquisa mais recente tem demonstrado que (idade 40 e acima de média) pacientes hipertensos mais jovens (idade média de menos de 40 anos de idade) têm rarefação funcional sem rarefação estrutural. ¹¹ Isto sugere que a rarefação funcional ocorre antes e pode evoluir ao longo do tempo a rarefação estrutural.

Curiosamente, os pacientes hipertensos tratados com drogas anti-hipertensivas específicas, tais como perindopril / indapamida exibido normaal densidade capilar e função endotelial após o tratamento, enquanto aqueles tratados com ACE (conversora da angiotensina-enzima) inibidores ou diuréticos manteve uma baixa densidade capilar apesar do controle da pressão arterial comparável. ¹² Isto sugere que alguns medicamentos anti-hipertensivos podem normalizar a densidade capilar, invertendo o capilar rarefação causada por hipertensão. Além disso, outros pesquisadores demonstraram que uma redução no consumo de sal leva à reversão de ambos rarefação capilar funcional e estrutural em indivíduos hipertensos ^13.

Apesar das várias aplicações clínicas potenciais desta tecnologia, há pouca padronização da técnica para quantificar imagens densidade capilar. ² Até o momento, os pesquisadores descobriram que os resultados de densidade capilar são reprodutíveis tanto intra-observador e inter-observador perspectiva apenas se o exato mesma área está sendo contado cada vez que ^{1,14 15.} De nota, os pesquisadores anteriores já largamente executada contagens capilares manualmente usando a olho nu, ^{9 16 17 18, que} é um processo lento e subjetivo.

, Baseados em computador algoritmos padronizados para quantificação de imagens capilares, teoricamente, fornecer uma análise de dados mais eficiente e reprodutível com menos subjetividade, facilitando aplicações clínicas da capilaroscopia. Alguns pesquisadores têm realmente usado programas baseados em computador para quantificar os dados a partir das cutículas imagens capilaroscópicos. ^{1,6 19 20} No entanto, apenas uma publicação a data descreve a confiabilidade de um programa de software complexo disponíveis para quantificar dados ^{capilaroscópicas,} 1 e este programa é complicada como anteriormente mencionado acima pela exigência de contar no mesmo campo visual exata. Aqui, nós apresentamos, um protocolo simples para a quantificação fiável capilares utilizando um algoritmo normalizado que permitea utilização de vários campos visuais. A utilização de vários campos visuais não só simplifica o processo, mas também permite a avaliação da variação biológica normal em contagem capilar.

O objetivo deste estudo é descrever um algoritmo baseado em computador reprodutível e eficiente que padroniza o processo de quantificação capilar. Embora estes métodos não são totalmente automatizados que exigem entrada muito pouco do usuário e fornecer a quantificação rápida e confiável das imagens.

Protocol

Nota: O processo de aquisição para a obtenção de imagens capilares foi publicado anteriormente e é realizada usando uma câmera fotográfica digital com um programa de computador de aquisição e análise de imagem correspondente ^{11 21} Este laboratório utiliza imagens estáticas para análise, não vídeos, simplificando a aquisição de imagens para análise.. O que se segue descreve a nova técnica para a quantificação dos capilares a partir das imagens.

1. Processo de Aperfeiçoamento de Imagem

1. Obter imagens digitais com uma câmera digital monocromática. Calibrar as imagens para um objeto de tamanho conhecido por tirar uma foto de um objeto de comprimento conhecido como um governante com a câmera. Este processo permite que o programa de computador para medir com precisão e contar capilares após o processamento. O ideal para a mais alta precisão, deve ser usada uma retícula (peça cientificamente fabricados de vidro com uma régua gravada nela). Mede o número de pixels em um quadrado de 1 mmcaixa usando um programa de computador.
   Nota: A chave para a reprodutibilidade ea padronização desse protocolo depende em grande parte a colocação adequada da caixa de um milímetro ² que é contado.
2. Use ferramentas de aprimoramento de contraste para escurecer os capilares e clarear o fundo, que irá maximizar a visualização dos vasos capilares. Diferenciação inicial de capilares a partir do fundo é importante para o recorte da imagem adequada em etapas posteriores. Para fazer isso, o ajuste da imagem usando um Para fazer isso, clique em "melhor ajuste histograma.": Captura, intensidade, imagem histograma, melhor ajuste.
3. Cortar uma região de interesse (ROI) para a contagem capilar como uma nova imagem (selecionar, regiões de interesse). Use uma caixa de um milímetro ^{2, que} foi determinada pela calibração das imagens a 530 pixels igualando 1 mm. verifique se a imagem recortada coloca o ápice das alças capilares no topo da imagem.
4. Achatar a imagem para que todos os ajustes de imagem futuras será aplicado uniformementea imagem. Para isso, clique em: guia processo, filtros 2D, alise, BG intensidade ", brilhante" width objeto para "75", se aplicam.
5. Levante o contraste da imagem de forma capilares são maximamente visualizado. Para fazer isso, clique em: ajustar guia, exposição, levantar contraste com 75.
6. Despeckle a imagem para suavizar as bordas dos capilares, clicando na guia processo, filtros 2D, despeckle, tamanho do kernel 7 x 7, aplique.
7. Finalize o contraste da imagem de forma capilares são o preto eo fundo é branco. Execute esta etapa, ajustando o histograma para o "melhor ajuste" do modelo.
   Nota: Por favor, consulte a Figura 2 em resultados representativos para um exemplo do que a imagem processada deve ser semelhante a de seguir estes passos.

2. Executando Counts capilares / quantificação de densidade capilar

1. Em cada imagem, selecionar manualmente uma parte de um capilar bem definida usando o featur "target objeto"E para ser reconhecido como objectos a serem contados pelo programa. Em seguida, selecione uma pequena parte do fundo, usando o recurso de "base", como uma referência para as áreas que precisam ser desconsiderada pelo algoritmo de contagem.
   Nota: A combinação desses destaques faz com que todos os capilares a ser destacado ignorando o ruído de fundo. A (contagem) protocolo de quantificação utiliza as funções do computador para diferenciar partes da imagem com base na cor e morfologia.
2. Use a função de contagem para contar instantaneamente todos os capilares na imagem com o equipamento de imagem. Definir o diâmetro mínimo de objectos contados a 5 pixels, a fim de evitar a contagem de ruído de fundo como capilares.
3. Para cada indivíduo, a contagem média de 3 - 4 imagens, a fim de se obter uma avaliação mais fiável.
   Nota: Por favor, consulte a Figura 3 em resultados representativos para um exemplo do que a imagem deve ser semelhante durante o processo de contagem.

3. Criar e utilizar macros para automatizar Processamento de Imagem

Nota: Para economizar tempo, macros podem ser criados a fim de executar automaticamente uma seqüência específica de processos em uma ou várias imagens. Estas sequências podem ser personalizados, a fim de fazer as modificações imagem mais rápido. Em essência, esses macros lembrar de como as imagens são processadas, e executar todas as etapas de forma rápida e sem entrada do usuário. Realizando conta com 12 imagens capilares leva este laboratório entre 20 a 30 minutos com as macros (2 a 3 minutos por imagem), em oposição a cerca de 8 minutos por imagem sem as macros. Por conseguinte, utilizar as macros é 3 a 5 vezes mais eficiente do que o processamento manualmente cada imagem individual.

1. A fim de criar uma macro, selecione "Gravar Macro" e em uma imagem execute as etapas e processos desejado, conforme descrito nas etapas 1 e 2 acima. Nome da macro com base na qual a imagem de processamento etapas foram executadas para referência futura. Quando using a macro sobre as futuras imagens, basta clicar em "Executar macro" eo programa aplicará automaticamente as melhorias registadas para a imagem (s) desejada.
   Nota: Este laboratório usa uma macro para executar todos, mas um dos passos na Seção 1 dos métodos em poucos segundos. O único passo que requer entrada do usuário é escolher onde cortar a imagem, Passo 1.2.

Results

O objetivo deste procedimento de processamento de imagem é diferenciar os capilares a partir da imagem de fundo para que eles possam ser quantificados com precisão. Ambos processamento de imagem incompleta e processamento de imagem excessiva são prejudiciais para a capacidade do programa para quantificar os capilares. Como pode ser visto na Figura 3, o processamento de imagem incompleta faz com que os capilares difícil de distinguir do fundo. É fundamental que o usuário seja capaz de di...

Discussion

A capilaroscopia periungueal mostra promessa como uma ferramenta clinicamente útil no futuro para vários oncologia, cardiovascular, e aplicações de doenças reumatológicas. O processo de aquisição de imagem é bastante consistente entre os pesquisadores, ainda existem atualmente vários métodos de processamento e análise de imagem. Os métodos incluem atualmente contagens informatizados e manuais capilares. Contagens manuais são problemáticas como eles são demorados e sujeitos a subjetividade do usuário e fadiga. Métodos ba...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-Pro Premier	Media Cybernetics, Inc	9.1	Software de processamento de imagem