A microrreologia de rastreamento de partículas investiga a viscoelasticidade dos materiais. Aqui, a técnica é usada para determinar a viscoelasticidade, a fluência e as funções efetivas de reticulação de diferentes componentes da matriz de um biofilme bacteriano. A matriz consiste em substâncias poliméricas secretadas pela bactéria e seus componentes determinam a estrutura do biofilme e as propriedades mecânicas.
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Artigo de método
Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células bacterianas são capazes de formar comunidades de biofilme ligadas à superfície conhecidas como biofilmes, envolvendo-se em substâncias poliméricas extracelulares (EPS). O EPS serve como um andaime físico e protetor que abriga as células bacterianas e consiste em uma variedade de materiais que incluem proteínas, exopolissacarídeos e DNA. A composição do EPS pode mudar, o que remodela as propriedades mecânicas do biofilme para desenvolver ou suportar estruturas alternativas de biofilme, como serpentinas, como resposta a pistas ambientais. Apesar disso, existem poucas descrições quantitativas sobre como os componentes do EPS contribuem para as propriedades mecânicas e a função dos biofilmes. A reologia, o estudo do fluxo de matéria, é de particular relevância para os biofilmes, pois muitos biofilmes crescem em condições de fluxo e são constantemente expostos à tensão de cisalhamento. Ele também fornece medição e informações sobre a propagação do biofilme em uma superfície. Aqui, a microrreologia de rastreamento de partículas é usada para examinar a viscoelasticidade e os papéis efetivos de reticulação de diferentes componentes da matriz em várias partes do biofilme durante o desenvolvimento. Essa abordagem permite que os pesquisadores meçam as propriedades mecânicas dos biofilmes em microescala, o que pode fornecer informações úteis para controlar e projetar biofilmes.
Introdução
A maioria das células bacterianas são capazes de empregar tanto planctônicas (de vida livre) e (sésseis) modos ligado à superfície de crescimento 1. No modo ligado à superfície de crescimento, as células bacterianas e secretar encerrar-se em grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biofilmes. O EPS é constituído principalmente por proteínas, exopolissacarídeo, ADN extracelular e é essencial para a formação de biofilme 2. Ele serve como um andaime física através da qual as bactérias podem ser utilizadas para diferenciar espacialmente e protege as bactérias de condições ambientais prejudiciais e as respostas ....
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Protocolo
1. biofilme Cultivo
- Preparação de Estirpes Bacterianas
- 1 dia antes do cultivo biofilme, preparar culturas de bactérias planctónicas inoculando 2 ml de meio de crescimento adequado a partir da cultura bacteriana congelado. Use meio de Luria-Caldo (10 g L -1 de NaCl, 10 g L -1 extrato de levedura e 10 g L -1 triptona) para mucoid P. aeruginosa e as suas pel Δ e Δ psl mutantes defeituosos. Incubar durante a noite a 200 rpm agitação condições 37 ° C e. Dilui-se as culturas durante a noite para uma DO 600 de 0,40 usando um espectrofotómetro.
- Montar configuração da célula d....
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Resultados
As propriedades viscoelásticas locais do biofilme em diferentes regiões do biofilme, que inclui os espaços vazios (médias acima do biofilme), planícies (camada plana de células indiferenciadas) e microcolônias (ver etiquetas na Figura 2A) foram investigados. As alterações temporais em propriedades viscoelásticas do biofilme durante a maturação dos dias 3 a 5 também foram determinadas. A MSD das partículas em espaços vazios foi usada como um controlo e comparável ao MSD de partículas em forma pura. Em co.......
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Discussão
Microrheology é uma ferramenta útil para medições reológicas locais em sistemas heterogêneos, como biofilmes microbianos. É uma técnica não destrutiva, o que permite o acompanhamento em tempo real das modificações reológicas dentro da mesma amostra biológica sobre vários pontos de tempo. Neste protocolo, de rastreamento de partículas microrheology foi aplicada a Pel e mutantes de exopolissacarídeo Psl a fim de investigar como eles afetam a elasticidade e reticulação eficaz da matriz do biofilme. Psl favorece o desenvolv.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Esta investigação é apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa e Ministério da Educação Singapura no âmbito do seu Centro de Pesquisa do Programa de Excelência, as ajudas à instalação (M4330002.C70) da Universidade Tecnológica de Nanyang, e ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) do Ministério da Educação, Cingapura. Os autores agradecem Joey Yam Kuok Hoong para participar na manifestação deste protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fluoresferas | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μ m microesferas fluorescentes vermelhas (580/605) com modificação de carboxilato |
| Zeiss Axio Imager M1 | Microscópio Epifluorescente | Carl Zeiss | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Bomba peristáltica |
| Câmaras de células de fluxo | Universidade Técnica da Dinamarca | ||
| Armadilha de bolhas | Universidade Técnica da Dinamarca | ||
| Tubo de Silicone | Dow Corning | 3 mm de diâmetro externo, 1 mm de diâmetro interno | |
| Conectores de plástico polipropileno transparente | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 pol. (1.588 milímetros) |
| Clips | Para Clamp Tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc & trade; | Seringa 50 x 24 mm | |
| 3 ml | Terumo | ||
| 27 Agulha G | Terumo | ||
| 2 - L Garrafas de Armazenamento/Mídia | VWR® | ||
| Carrinho | Para manter a configuração do biofilme |
Referências
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Yang, L., et al.
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Reimpressões e permissões
