A microrreologia de rastreamento de partículas investiga a viscoelasticidade dos materiais. Aqui, a técnica é usada para determinar a viscoelasticidade, a fluência e as funções efetivas de reticulação de diferentes componentes da matriz de um biofilme bacteriano. A matriz consiste em substâncias poliméricas secretadas pela bactéria e seus componentes determinam a estrutura do biofilme e as propriedades mecânicas.
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Artigo de método
Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células bacterianas são capazes de formar comunidades de biofilme ligadas à superfície conhecidas como biofilmes, envolvendo-se em substâncias poliméricas extracelulares (EPS). O EPS serve como um andaime físico e protetor que abriga as células bacterianas e consiste em uma variedade de materiais que incluem proteínas, exopolissacarídeos e DNA. A composição do EPS pode mudar, o que remodela as propriedades mecânicas do biofilme para desenvolver ou suportar estruturas alternativas de biofilme, como serpentinas, como resposta a pistas ambientais. Apesar disso, existem poucas descrições quantitativas sobre como os componentes do EPS contribuem para as propriedades mecânicas e a função dos biofilmes. A reologia, o estudo do fluxo de matéria, é de particular relevância para os biofilmes, pois muitos biofilmes crescem em condições de fluxo e são constantemente expostos à tensão de cisalhamento. Ele também fornece medição e informações sobre a propagação do biofilme em uma superfície. Aqui, a microrreologia de rastreamento de partículas é usada para examinar a viscoelasticidade e os papéis efetivos de reticulação de diferentes componentes da matriz em várias partes do biofilme durante o desenvolvimento. Essa abordagem permite que os pesquisadores meçam as propriedades mecânicas dos biofilmes em microescala, o que pode fornecer informações úteis para controlar e projetar biofilmes.
Introdução
A maioria das células bacterianas são capazes de empregar tanto planctônicas (de vida livre) e (sésseis) modos ligado à superfície de crescimento 1. No modo ligado à superfície de crescimento, as células bacterianas e secretar encerrar-se em grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biofilmes. O EPS é constituído principalmente por proteínas, exopolissacarídeo, ADN extracelular e é essencial para a formação de biofilme 2. Ele serve como um andaime física através da qual as bactérias podem ser utilizadas para diferenciar espacialmente e protege as bactérias de condições ambientais prejudiciais e as respostas do hospedeiro. Diferentes componentes de EPS têm papéis distintos na formação de biofilme 3 e alterações na expressão de componentes EPS pode remodelar drasticamente estruturas biofilme 4. Componentes EPS também pode funcionar como moléculas sinalizadoras 5, e estudos recentes tem mostrado certos componentes EPS interagindo com células microbianas para orientar suas migração e biofilme differentiation 6-8.
A investigação sobre o EPS tem muito avançado com base nas análises morfológicas dos biofilmes produzidos por mutantes defeituosos em um componente específico do EPS 9,10. Além disso, o EPS é geralmente caracterizado na macro-escala (caracterização granel) 11. Morfológica analisa no entanto pode faltar detalhe caracterização quantitativa e grandes quantidades, o que devolve valores médios, perde o detalhe de que existe dentro da heterogeneidade do biofilme. Existe agora uma tendência crescente para avançar para caracterização em tempo real das propriedades mecânicas do EPS no micro-escala. Este protocolo demonstra como partícula-tracking microrheology é capaz de determinar os efeitos espaço-temporais de componentes da matriz Pel e exopolissacarídeos Psl sobre a viscoelasticidade e eficaz de reticulação de Pseudomonas aeruginosa 4 biofilmes.
Microrheology passivo é um rh simples e baratoeology método que fornece a maior velocidade de amostragem microrheological espacial de um material à data 12,13. Em microrheology passiva, esferas de sondas são colocados na amostra e o seu movimento Browniano, impulsionado por energias térmica (K) B T é seguido por microscopia de vídeo. Diversas partículas podem ser monitoradas simultaneamente, e as coordenadas dependentes do tempo das partículas seguem um passeio aleatório convencional. Portanto, em média, as partículas permanecem na mesma posição. No entanto, o desvio padrão dos deslocamentos ou o deslocamento quadrático médio (MSD) das partículas, não é zero. Uma vez que o fluxo de fluidos viscosos, a partícula MSD num fluido viscoso cresce linearmente à medida que o tempo avança. Em contraste, a ligação cruzada polimérico encontrado em viscoelástico ou substâncias elásticas para ajudar a resistir a fluir, e as partículas tornam-se limitada no seu deslocamento, levando a planaltos na curva MSD (Figura 1A). Esta observação segue a relação MSDαt α, onde α é o expoente difusivo que está relacionada proporção de contribuições elásticas e viscosas da substância. Para as partículas que se deslocam em fluidos viscosos a = 1, em substâncias viscoelásticas 0 <α <1, e em substâncias elásticas α = 0. A MSD também pode ser utilizado para calcular a conformidade fluência, que é a tendência do material para deformar permanentemente sobre tempo e estima quão facilmente um spread materiais.
O tamanho, densidade e química da superfície da partícula são importantes para a aplicação correcta do experimento microrheological e são escolhidos com respeito ao sistema estudado (neste caso, os polímeros da matriz do biofilme, ver Figura 1B). Em primeiro lugar, a partícula mede a reologia da substância com as estruturas que são muito menores do que a própria partícula. Se as estruturas da substância são de dimensão semelhante à das partículas, o movimento do partigo é perturbado pela forma e orientação das estruturas individuais. No entanto, se as estruturas circundantes da partícula são muito menores, este efeito é pequena e média para fora, apresentando um ambiente homogéneo para a partícula (Figura 1B). Em segundo lugar, a densidade das partículas deve ser semelhante ao meio (1,05 g ml -1 de meios à base de água) de tal modo que a sedimentação é evitada e as forças de inércia são insignificantes. A maioria das partículas de poliestireno com treliças cumpram os critérios acima. Idealmente, a partícula não interage com os polímeros da matriz do biofilme como a interpretação reológico de partícula MSD só é válida se o movimento é aleatório, conduzido por energia térmica e de colisão com estruturas de substância. Isto pode ser observado através da verificação se a sonda de partículas tende a ligar-se ou saltar para fora da superfície de um biofilme de pré-adulto. No entanto, apesar da falta de atracção para o biofilme, as partículas devem ser capazes de ser incorporados na matriz.Além disso, a heterogeneidade físico-químicas do biofilme pode resultar em diferentes partículas sendo mais apropriados como sondas em diferentes regiões do biofilme. Assim, as partículas de diferentes tamanhos e química de superfície deve ser aplicado para o biofilme.
Como tal, a partícula MSD é capaz de fornecer informações úteis sobre como os diferentes componentes contribuem para a reologia e divulgação do biofilme. Além disso, a utilização de diferentes sondas permite a obtenção de informação sobre a heterogeneidade espacial físico-química do biofilme. Este método pode ser utilizado para testar o efeito do tratamento antimicrobiano sobre as propriedades mecânicas do biofilme, ou aplicado a biofilmes espécies mistas para investigar como as propriedades mecânicas do biofilme são alteradas de introdução de uma outra espécie. Partículas perturbações músculo-esqueléticas pode também ser útil para caracterizar a dispersão do biofilme. Tais estudos seriam úteis em nosso entendimento de biofilmes, melhorando potencialmente tratamentos biofilme umnd engenharia de biofilmes para atividades úteis.
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Protocolo
1. biofilme Cultivo
- Preparação de Estirpes Bacterianas
- 1 dia antes do cultivo biofilme, preparar culturas de bactérias planctónicas inoculando 2 ml de meio de crescimento adequado a partir da cultura bacteriana congelado. Use meio de Luria-Caldo (10 g L -1 de NaCl, 10 g L -1 extrato de levedura e 10 g L -1 triptona) para mucoid P. aeruginosa e as suas pel Δ e Δ psl mutantes defeituosos. Incubar durante a noite a 200 rpm agitação condições 37 ° C e. Dilui-se as culturas durante a noite para uma DO 600 de 0,40 usando um espectrofotómetro.
- Montar configuração da célula de fluxo, o que tem sido descrito anteriormente 14, de preferência em uma estação móvel ou carro que pode ser levado para a sala de microscópio para imagiologia da célula de fluxo, sem desmontagem.
- Prepare meio de crescimento estéril em 2 L ou L 5 frascos para cada célula de fluxo. Use meio mínimo M9 (48 mM de Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM de NH4CI, NaCl 9 mM, 2 mM de MgSO4, e 0,1 mM de CaCl2) suplementado com 0,04% de glucose (p / v) e 0,2% (peso / vol) de casaminoácidos) para P. aeruginosa fluir biofilmes celulares.
- Aliquota microesferas fluorescentes em tubos de microcentrífuga e girar para baixo em H 2 O esterilizada durante 5 min numa centrífuga a 9,391.2 g. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de meio de crescimento para remover azida de sódio (desinfectante) antes da adição ao meio de crescimento em G 2 ou 5 frascos de meio L.
NOTA: Os tamanhos diferentes de microesferas vir em diferentes concentrações e deve ser diluída de acordo com as instruções. Por exemplo, dispersar 120 ul de microesferas de 1,0 um de diâmetro, 15 ul de microesferas de 0,5 um de diâmetro e 0,96 ul de microesferas de 0,2 um de diâmetro em 2 L de meio de crescimento para dar 2,18 x 10 6 ml -1 microesferas para cada tamanho de partícula. - Anexar meio garrafa para upstresma de célula de fluxo e permitir que o meio de crescimento a fluir através de instalação inteira. Pare o fluxo e injectar culturas durante a noite diluídas em câmaras de célula de fluxo. Permitir que as bactérias para anexar o substrato lamela durante 1 h antes de continuar o fluxo de meio de crescimento a uma taxa de fluxo de cerca de 5,5 x 10 -3 m s-1, ou 8 rpm com uma bomba peristáltica.
NOTA: Os biofilmes são normalmente cultivadas à temperatura ambiente (25 ° C) durante 3-7 dias. - Alternativamente, para a configuração cultura estática, dilui-se culturas de uma noite de 100 vezes em tubos de microcentrífuga adicionando 10 ul de cultura durante a noite a 1 ml de meio de crescimento com partículas. Aumentar a concentração de partículas no meio de crescimento para cultura estática de cerca de 500 vezes em comparação com a utilizada para biofilmes de fluxo (por exemplo, lavar e ressuspender 600 ul de 1,0 uM esferas de diâmetro em 10 ml de meio de crescimento) como biofilmes de células de fluxo estão constantemente reabastecido com partículas, mas as culturas não são estáticas.
- Adicionar 2001; l de cultura durante a noite diluiu-se com partículas para as câmaras de 8 lâminas bem. Incubar a 37 ° C em condições estáticas. Os biofilmes são normalmente cultivadas para 1 dia. Substitua meio de crescimento gasto diário com meio de crescimento fresco com partículas se biofilme é cultivado por mais de 1 dia.
2. Microscopia
- No dia 3 e 5, desligue o fluxo de bomba peristáltica e trazer configuração de célula de fluxo para a sala de microscopia. Tubulação braçadeira perto da entrada e saída das câmaras de célula de fluxo para evitar a deriva (a causa do erro sistemático por mudanças no ambiente de fluxo). Coloque a célula de fluxo para o estágio de microscópio de um microscópio vertical.
NOTA: Use um microscópio invertido para a imagem latente de micropoços. - Use microscopia fluorescente com 40X objetivo óleo para gravar vídeos de microesfera de movimento embutidos no biofilme em vários locais (microcolônias e camadas indiferenciadas plana) e em diferentes dias (dia 3 e 5) parainvestigações temporais e espaciais. Gravar vídeos curtos com maior taxa de quadros para investigar os eventos que ocorrem dentro de escalas de tempo curto (por exemplo, 1,5-3 mínimo de vídeos na taxa de quadros de 25-50 frames por segundo para uma dinâmica rápida), e mais vídeos com menor taxa de quadros para investigar eventos durante mais tempo escalas (por exemplo, 15-30 mínimo de vídeos na taxa de quadros de 2,5-5 frames / seg para uma dinâmica mais lentas).
NOTA: Um vídeo normalmente contém partículas de 5-10, e é tipicamente de 1,0-2,5 GB no tamanho do arquivo. Microcolônias maiores podem conter mais partículas. Leve 5-10 vídeos para cada categoria (por exemplo, 10/05 vídeos de diferentes microcolônias e de diferentes locais em camadas planas indiferenciados). O biofilme tem uma arquitectura heterogénea que pode consistir de microcolónias, canais, cavidades e indiferenciadas camadas planas. - Salvar vídeos em formato apropriado que podem ser lidos por Fiji / ImageJ (por exemplo CZI, tif).
- Confira vídeos de tração, percorrendo vid acabadoEO e observando-se que as partículas não se movem na mesma direcção simultaneamente. A deriva pode ser causado pelo movimento Z-fase, as correntes na célula de fluxo, o desequilíbrio de mesa anti-vibração, pressão de ar ou mudanças de temperatura. Menor correta deriva usando técnicas de pós-processamento normalmente fornecidos com o software de microscópio. Descartar nenhum vídeo em que deriva não podem ser corrigidos. Grave os seguintes parâmetros, que são necessários durante Particle Analysis Tracking: resolução (px / um), número de quadros, Duração.
- Remover célula de fluxo de platina do microscópio e reiniciar a bomba peristáltica continuar a cultivar o biofilme.
3. Análise de Rastreamento de Partículas
- Obter trajetórias de partículas que usam o plug-in Trackmate em software de fonte aberta (ImageJ). Baixe Fiji em http://fiji.sc/Fiji. Abra o vídeo com Fiji e no menu Plugins, selecione Rastreamento e Trackmate.
- Verifique ou ajustar as definições em the janela sugerindo ajustes de calibração iniciais para combinar os parâmetros de vídeo como registrado no passo 2.4.
- Detectar partículas no Trackmate usando ImageJ.
- Selecione 'detector Log', diâmetro das partículas de entrada e valor limite (por exemplo, 1000). Percorra o vídeo enquanto clicando no botão 'Preview' para verificar se os círculos roxos siga as partículas ao longo do vídeo. Ajuste os valores de diâmetro e de limite, conforme necessário: aumentar o valor limite se círculos roxos aparecer no espaço vazio. Reduzir o valor limite se forem detectadas partículas não o suficiente. Clique no botão ao lado para completar a detecção de partículas.
- Clique no botão ao lado quando apresentado com a opção de adicionar ou remover as partículas detectadas no 'limiar Inicial', 'Selecione uma exibição' e 'Selecione um filtro' janelas para continuar sem ajuste se a detecção de partículas inicial foi satisfatório.
- Selecione 'rastreador simples LAP' na optina barra de 'Selecione um método rastreador "janela como partículas raramente mover fora de foco no biofilme e são facilmente controladas. Use os valores max distância ligando sugerido ou baixo e abertura-fechamento, e clique em Avançar.
- Verifique se rastreamento de partículas é satisfatória, percorrendo o vídeo para ver que as partículas de seguir as trilhas traçadas por Trackmate, e que não existem faixas indesejadas ou ausentes. Ir as várias etapas de filtragem. Ir para a última janela "Selecione uma ação '. Selecione 'faixas de exportação para arquivo xml' a partir do menu drop-down e clique em "Executar". Escolha uma pasta para salvar as faixas.
NOTA: Existem vários programas disponíveis no domínio público para a análise de trajetórias de partículas e uso de microrheology. msdanalyzer e TrackArt são exemplos de programas de análise de rastreamento de partículas que são executados no ambiente Matlab.
- Prepare Matlab para importar as trajetórias de partículas nos arquivos XML, selecionando no menu deArquivo Matlab> Set Path ... e adicione a pasta disponíveis os scripts com o pacote de Fiji.
- Para analisar as trajetórias de partículas com msdanalyzer, baixar o link para o arquivo zip ou o arquivo tar.gz at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- Extraia a pastamsdanalyzer 15 e soltá-lo em uma pasta que pertence ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings Meus Documentos Matlab). Comece Matlab e iniciar o analisador de digitação:
ma = msdanalyzer (2, 'um', 's')
onde hum e sec são as unidades de tempo e espaço físicos no vídeo.- Importe as trajetórias de partículas, digitando:
[faixas, md] = importTrackMateTracks ('FileName.xml', 'Clipz';, 'Scalet')
ma = ma.addAll (faixas);
onde 'Clipz' remove a dimensão z para um vídeo 2D, e 'Scalet'. - Traçar as trajetórias Onto gráfico usando:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Calcule os LME das partículas usando:
ma = ma.computeMSD;
ma.msd - Traçar as perturbações músculo-esqueléticas de cada partícula:
figura
ma.plotMSD - Combinar trajetórias de partículas de outros vídeos do mesmo categery (por exemplo, partículas incorporadas no tipo selvagem microcolônias no dia 3), repetindo 3.5.1.1 a 3.5.1.4).
- Traçar o conjunto médio ou a média sobre todas as curvas:
ma.plotMeanMSD
Alterar o Y e eixo-x de linear para escala logarítmica. Às vezes longas lag, as curvas MSD tornar-se barulhento devido a estatísticas insuficientes em prazos mais longos. As curvas MSD também pode subir abruptamente devido a erro dinâmico. Estas regiões da curva pode ser removida usando a ferramenta pincelpara selecionar o final da curva e da selecção de "Escovar '>' Remover unbrushed 'no menu Ferramentas.
- Importe as trajetórias de partículas, digitando:
- Baixe Ezyfit em http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ e adicionar Ezyfit para uma pasta pertencente ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings Meus Documentos Matlab). Instale o menu Ezyfit digitando em Matlab espaço de trabalho efmenu instalar. Reinicie MATLAB com cardápio Ezyfit na janela de figura. Ajustar as curvas MSD para a lei de potência, selecionando no menu Ezyfit 'Show Fit'> 'Power'> 'a * x ^ n' eram n é o expoente α diffusive estimado.
NOTA: msdanalyzer requer o ajuste de curva Toolbox em Matlab para ajuste de curvas de MSD. Ezyfit é uma alternativa e software livre que pode executar ajuste de curva. - Limpar trajetórias de partículas atuais e LME para calcular os novos LME partículas em outros locais ou tempo:
Claro - Após o cálculo de várias curvas médias MSD de partículas no meio (controle), e microcolônias e áreas indiferenciadas de diversas estirpes, copie e cole as curvas em um gráfico para comparação. Rigidez da amostra e reticulação aumento com valores mais baixos MSD. Curvas planas têm α inferiores e amostra é mais elástica do que curvas mais íngremes com maior α.
- Selecione a curva e vá em "Ferramentas" olhar para as estatísticas de dados, como a mediana e intervalo. A MSD da pérola é proporcional à fluência conformidade, J (t) do material em que o grânulo é incorporado de acordo com a relação,
onde J = conformidade fluência, d = diâmetro da partícula, B k = constante de Boltzmann, T = temperatura e t = tempo.
- Extraia a pastamsdanalyzer 15 e soltá-lo em uma pasta que pertence ao caminho Matlab (por exemplo C: Documents and Settings Meus Documentos Matlab). Comece Matlab e iniciar o analisador de digitação:
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Resultados
As propriedades viscoelásticas locais do biofilme em diferentes regiões do biofilme, que inclui os espaços vazios (médias acima do biofilme), planícies (camada plana de células indiferenciadas) e microcolônias (ver etiquetas na Figura 2A) foram investigados. As alterações temporais em propriedades viscoelásticas do biofilme durante a maturação dos dias 3 a 5 também foram determinadas. A MSD das partículas em espaços vazios foi usada como um controlo e comparável ao MSD de partículas em forma pura. Em co...
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Discussão
Microrheology é uma ferramenta útil para medições reológicas locais em sistemas heterogêneos, como biofilmes microbianos. É uma técnica não destrutiva, o que permite o acompanhamento em tempo real das modificações reológicas dentro da mesma amostra biológica sobre vários pontos de tempo. Neste protocolo, de rastreamento de partículas microrheology foi aplicada a Pel e mutantes de exopolissacarídeo Psl a fim de investigar como eles afetam a elasticidade e reticulação eficaz da matriz do biofilme. Psl favorece o desenvolv...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Esta investigação é apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa e Ministério da Educação Singapura no âmbito do seu Centro de Pesquisa do Programa de Excelência, as ajudas à instalação (M4330002.C70) da Universidade Tecnológica de Nanyang, e ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) do Ministério da Educação, Cingapura. Os autores agradecem Joey Yam Kuok Hoong para participar na manifestação deste protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fluoresferas | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μ m microesferas fluorescentes vermelhas (580/605) com modificação de carboxilato |
| Zeiss Axio Imager M1 | Microscópio Epifluorescente | Carl Zeiss | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Bomba peristáltica |
| Câmaras de células de fluxo | Universidade Técnica da Dinamarca | ||
| Armadilha de bolhas | Universidade Técnica da Dinamarca | ||
| Tubo de Silicone | Dow Corning | 3 mm de diâmetro externo, 1 mm de diâmetro interno | |
| Conectores de plástico polipropileno transparente | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 pol. (1.588 milímetros) |
| Clips | Para Clamp Tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc & trade; | Seringa 50 x 24 mm | |
| 3 ml | Terumo | ||
| 27 Agulha G | Terumo | ||
| 2 - L Garrafas de Armazenamento/Mídia | VWR® | ||
| Carrinho | Para manter a configuração do biofilme |
Referências
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Reimpressões e permissões
