Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

Resumo

Neste estudo, foi descrito um método para sintetizar populações ultrapequenas de nanopartículas biocompatíveis, bem como vários métodos in vitro para avaliar suas interações celulares.

Resumo

Os veículos de entrega baseados em nanopartículas têm se mostrado muito promissores para aplicações de direcionamento intracelular, fornecendo um mecanismo para alterar especificamente a sinalização celular e a expressão gênica. Em uma investigação anterior, foi demonstrada a síntese de nanopartículas lipídicas sólidas ultrapequenas (SLNs) para aplicações tópicas de administração de medicamentos e detecção de biomarcadores. Os SLNs são um exemplo bem estudado de um sistema de entrega de nanopartículas que surgiu como um veículo promissor de entrega de medicamentos. Neste estudo, os SLNs foram carregados com um corante fluorescente e usados como modelo para investigar as interações partícula-célula. O método de temperatura de inversão de fase (PIT) foi utilizado para a síntese de populações ultrapequenas de nanopartículas biocompatíveis. Um ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilfeniltetrazólio (MTT) foi utilizado para estabelecer níveis de dosagem apropriados antes dos estudos de interação nanopartícula-célula. Além disso, fibroblastos dérmicos humanos primários e células dendríticas de camundongos foram expostos a SLN carregados com corante ao longo do tempo e as interações com relação à toxicidade e absorção de partículas foram caracterizadas usando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Este estudo demonstrou que SLNs ultrapequenos, como um sistema de entrega de nanopartículas, são adequados para o direcionamento intracelular de diferentes tipos de células.

Introdução

Veículos de entrega baseado em nanopartículas têm mostrado uma grande promessa para aplicações dirigidas intracelulares, fornecendo um mecanismo para alterar especificamente sinalização celular e expressão gênica. Estes veículos podem ser carregados com medicamentos, proteínas, ácidos nucleicos e concebidos para influenciar as respostas celulares e conseguir um efeito desejado em tecidos-alvo. Muitos tipos de nanocarriers têm sido exploradas para benefício terapêutico e de diagnóstico, incluindo lipidos, polímeros, silício e materiais magnéticos. Estes sistemas são atraentes devido ao seu potencial para a entrega da droga localizada, aumento da concentração terapêutica em tecidos-alvo e redução de toxicidade sistêmica.

Nanopartículas de lípidos sólidas (NLS) são um exemplo bem estudado de um sistema de entrega de nanopartículas que surgiu como um veículo de entrega de droga promissora nos últimos anos. SLNs pode ser facilmente formulado para várias aplicações, incluindo bio-sensor ^1, cosméticos ^2, e tentrega herapeutic ^3-7. A sua utilidade advém do facto de que eles são constituídos inteiramente de reabsorvíveis, lípidos não tóxicos, resultando em melhor biocompatibilidade. Durante a síntese, os fármacos lipofilicos podem ser incorporados em veículos SLN, aumentando assim a solubilidade do fármaco e da aptidão para administração parentérica. SLN veículos também ajudam a estabilizar terapêuticas encapsuladas, reduzindo sua degradação e depuração, e maximizando a ação terapêutica. Estes veículos são particularmente bem adequados para longa actuação, preparações de libertação controlada devido à sua estabilidade à temperatura do corpo ^3,4,8,9. Importante, a encapsulação de fármacos em nanopartículas de lípidos altera os perfis farmacocinéticos intrínsecas das moléculas de fármaco. Isto proporciona uma vantagem potencial de permitir a libertação controlada de fármacos com um índice terapêutico estreito. A taxa de libertação de agentes terapêuticos incorporados-NLS pode ser regulado com base na taxa de degradação do lípido ou a taxa de difusão da droga namatriz lipídica.

SLNs são muitas vezes modificados para se acumular nos tecidos alvo específicos. Por exemplo, o tamanho (tipicamente maior do que 10 nm) potencia a retenção na circulação, em que a vasculatura de tecido tumoral gotejante facilita a deposição. Além disso, a via de administração da partícula foi mostrado para alterar a biodistribuição com o potencial para segmentar estruturas fisiológicas específicas tais como os nódulos linfáticos ^10,11. Após a deposição nos tecidos alvo, conseguindo interacções celulares apropriados e eventual internalização de nanopartículas é um desafio devido à capacidade das membranas celulares para controlar selectivamente o fluxo de iões e moléculas para dentro e para fora da célula ^12. Para facilitar a absorção celular, é possível modificar nanocarriers com ligandos específicos, incluindo péptidos, moléculas pequenas, anticorpos monoclonais e ^13,14. Vários mecanismos incluindo tanto passiva penetração e transporte activo de nanopartículasatravés da membrana celular foram previamente descritos ^3,12,15. Em geral, demonstrou-se que as interacções célula-nanopartículas são influenciadas pelas propriedades físico-químicas das nanopartículas, incluindo o tamanho, forma, carga de superfície e a química de superfície, além de parâmetros específicos de células, tais como tipo de célula ou a fase do ciclo celular ^12.

Uma investigação anterior demonstrou a síntese de sub-10 SLNs nm para ¹⁶ tópicos e aplicações de detecção de biomarcadores ¹ utilizando o método de ¹⁷ temperatura de inversão de fase (PIT). Este é um método de síntese ² suave onde a composição permanece constante enquanto a temperatura é gradualmente alterado. Agitação contínua da solução aquecida, à medida que arrefece a resultados de RT em uma nanoemulsão. Este processo resulta na síntese de NLS com tamanho de partícula menor do que ¹ relatado anteriormente usando vários métodos para a síntese do lípido nanoparticles ^17-22. A escala de tamanho resultante, menos de 20 nm, proporciona uma vantagem para aplicações de segmentação intracelulares devido ao aumento da área superficial eo potencial para interações celulares avançados.

Um esquema de NLS, concebido para proporcionar um corante fluorescente ou terapêutico, é mostrado na Figura 1. Os SLNs consistem de um lípido interior (por exemplo, alcano linear), que permite a incorporação de compostos lipófilos (por exemplo, corantes ou agentes terapêuticos) e um exterior surfactante (surfactante não iónico por exemplo, linear) rodeada por água. Neste estudo, SLNs foram carregadas com um corante fluorescente e utilizado como um modelo para investigar interacções célula-partículas. Fibroblastos dérmicos humanos primários e células dendríticas de rato foram expostos a corante carregado-NLS ao longo do tempo, a fim de caracterizar as interacções com respeito à toxicidade e a absorção das partículas. Um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) foi utilized, a fim de estabelecer níveis de dosagem adequados. A microscopia de fluorescência e citometria de fluxo foram utilizados dois métodos para analisar a absorção de partículas in vitro.

Figura 1. Esquema da SLN mostrando os principais constituintes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Processamento de SLNs

1. Síntese de SLNs
   Nota: Use o método PIT ^1,17,20 para preparar os sub-20 SLNs ^NM 1.
   1. Utilizar técnicas assépticas, biorreagentes ou reagentes de grau de cultura de células, e materiais estéreis (isto é, pipetas, espátulas, ampolas, etc.).
   2. Usar uma cabine de segurança biológica para a síntese de NLS (Figura 2).
   3. Combinar 0,6 mg de corante fluorescente (Vermelho do Nilo (NIR), a concentração de NiR é de aproximadamente 0,3 mg / ml) e 0,10 g de heneicosano (lípido, 5% p / p de concentração de lípido) para um frasco (15 ml), o co-fundido a 90 ° C, e mexa.
   4. Adicionar 0,11 g de polioxietileno (10) éter oleilico (surfactante, 5,5% p / p de concentração de surfactante). A co-fundir a mistura resultante a 90 ° C e agitar.
   5. Adicionar 1,79 g de água estéril à mistura, aquecer a 90 ° C, e agita-se até que uma nanoemulsão transparente é formado.
      Nota: Sob agitação contínua e arrefecimento controlado, SLNs são criados. Estas condições causar a inversão da emulsão de água-em-óleo para uma emulsão óleo-em-água. Moléculas lipofílicas como partição NiR para as gotículas lipídicas.
   6. Prepara-se uma nanoemulsão em paralelo sem a adição do corante fluorescente, a fim de servir como amostra de controlo. Combinar 0,10 g de heneicosano e 0,11 g de polioxietileno (10) éter oleílico para um frasco (15 ml) co-fundido a 90 ° C, e agita-se.
      1. Adicionar 1,79 g de água estéril à mistura, aquecer a 90 ° C, e agita-se até que uma nanoemulsão transparente é formado.
   7. Além disso esterilizar cada nanoemulsão utilizando um filtro estéril de 0,2 um.
   
   Figura 2. Esquema de síntese de SLNs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Tamanho da Partícula e Polydispersity
   1. Use dispersão de luz dinâmica (DLS) para medir o tamanho de partícula e polidispersidade dos NLS ¹ utilizando uma cuvete de vidro e um instrumento concebido para medir o tamanho de partícula.
   2. Antes das medições de amostras, medir as dimensões das partículas de dois padrões conhecidos seguindo o protocolo do fabricante para a preparação de padrões e de medição.
   3. Encher a cuvete de vidro com 1,5 ml de solução padrão e a medição da solução padrão, utilizando as mesmas condições de medida que as amostras.
      Nota: passo anterior foi repetido para cada padrão.
   4. Medem-se as amostras tal como preparado. Para cada, utilizar os seguintes parâmetros experimentais: um tempo de funcionamento de 100 seg, índice de refracção de água (1,33), a viscosidade da água a 20 ° C (1,002 mPa).
      Nota: Esta técnica utiliza uma frequência deslocada luz para medir o tamanho das nanopartículas.
   5. Relate o diâmetro médio das partículas e polidispersividade de partidistribuição de tamanho de cle.
3. Ponto de fusão e Calor Latente de fusão
   1. Use um calorimetria exploratória diferencial (DSC) equipado com um amostrador automático e fonte de resfriamento de nitrogênio líquido para investigar o comportamento térmico de SLNs ^1.
   2. Pipetar os SLNs como preparados em uma panela de alumínio de 40 l com uma massa de cerca de 25 mg e fechar hermeticamente a panela utilizando uma prensa crimper universal para minimizar a perda de umidade durante a varredura DSC.
   3. Medir cada nanoemulsão de 5 a 80 ° C.
   4. Indica-se a ponto de fusão e do calor latente de fusão de DSC a partir do lote, em que o vale representa o ponto de fusão e o integral da área sob a curva de DSC na trama dividida pela quantidade de material representa o calor latente de fusão.

2. SLNs Interação com fibroblastos e células dendríticas

1. Cultura de fibroblastos humanos primários
   1. Cultura primária fi humanafibroblastos de acordo com as instruções do fabricante em meio líquido para a cultura de fibroblastos dérmicos humanos (média 106), suplementado com o kit de suplemento de crescimento de soro baixo (LSGS). Manter as células numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO ₂ e subcultura, ao atingir 80% de confluência.
   2. Para tanto MTT e análise de imagem, as células de semente em uma placa de 96 poços, a uma densidade de 2 x 10 ⁴ culas por po, e deixar equilibrar a 37 ° CO / N antes da exposição SLN.
   3. No tempo zero, diluir SLNs em meio completo, conforme indicado (Figura 4), ​​com respeito à concentração de lípido, e adicionar 10 uL por poço para cada replicado poço na placa de 96 poços.
   4. Manter as células a 37 ° C, 5% de CO _2, durante o período de incubação.
2. MTT Toxicidade Assay
   1. Após 24 h de incubação com o NLS, determinar a viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT, de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Lave as células uma vez e adicionar meio fresco a cada poço (100 ul / poço). Matar poços de controlo por incubação numa solução de metanol a 70% durante 10 min antes de substituir com meio fresco.
   3. Adiciona-se reagente de MTT (10 ul por poço) a cada poço da microplaca e incube O / N a 37 ° C.
   4. Depois de O / N de incubação, os cristais de formazina solubilizar intracelulares com a solução detergente fornecida (100 ul por poço) de acordo com o protocolo do fabricante.
   5. Após 3 h de incubação à TA, obter valores de absorvância a um comprimento de onda de medição de 570 nm utilizando um leitor de microplacas.
      O MTT utilizado deve ser menor do que 1% (w / v) de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2) -2, brometo de 5-difenil-tetrazólio: Nota.
3. Microscopia de Fluorescência
   1. Em pontos de tempo após a dosagem específicos de fibroblastos com SLN, lavar os fibroblastos duas vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e fixar durante 10 min com metanol a 70% frio.
   2. Após 10 min, Substituir o metanol com PBS e capturar imagens usando um microscópio invertido, usando uma passagem de banda (PA) 690/50 nm conjunto de filtros.
4. Cultura de Medula Óssea de rato As células dendríticas
   1. Induzem as células dendríticas derivadas de medula óssea de ratinho (BMDC) como previamente descrito ^23,24. Resumidamente, suspensões de placa única de células de ratinhos C57BL / 10 de medula óssea em 100 mm de placas de Petri a 2 x 10 ⁶ / placa com factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos de murino recombinante (GM-CSF, 300 U / ml) e murino IL-4 recombinante (factor de células B, 200 U / ml de estimulante). Mudança de mídia a cada 3 dias.
   2. No dia 7, adicionar SLNs NiR-carregadas com os pratos a uma concentração final de 0,5 e 5,0 ug / ml de lípido e manter as células em uma temperatura de 37 ° C, _5% de CO2 para o comprimento desejado de exposição.
   3. Coletar as células dos pratos por aspiração de toda a mídia na placa, cobra-lo em um tubo de 50 ml, seguido de lavagem completa da placa (para desalojar anúncio vagamenteHerent células) com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 4 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Recolha a suspensão celular obtida no mesmo tubo de 50 ml.
5. Avaliação da SLNs Incorporação via Citometria de Fluxo
   1. Determinar a concentração da suspensão de células obtida no ponto 2.4.3 e distribuir 3x10 ⁵ células em um de 12 mm x 75 mm de fundo redondo tubo FACS.
   2. Lavam-se as células por adição de 1 ml de PBS e em seguida os tubos de centrifugação durante 5 minutos a 400 xg, à temperatura de 4 ° C.
   3. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 100 ul de PBS / EDTA 2 mM / 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) (tampão de coloração) contendo anticorpo monoclonal anti-CD11c-FITC (0,25 ug / mL de concentração final). Incubar durante 30 min em gelo no escuro.
   4. Lavam-se as células com 1 ml de PBS e, em seguida, centrifugar os tubos durante 5 min a 400 xg, à temperatura de 4 ° C.
   5. Descartar o sobrenadante e ressuspender cadasedimentar com 400 ul de tampão de coloração. As células estão agora prontos para a aquisição das amostras com um citômetro de fluxo (possivelmente equipado com lasers azuis e vermelhas).
   6. Utilizando um software de análise de citometria de fluxo, avaliar o nível de incorporação de NLS por DC por gating na população de células FITC CD11c + (positivo) e comparando a intensidade de fluorescência NLS-associados (medido nos canais PerCP-Cy5.5 ou APC).

Resultados

O método PIT foi utilizado para sintetizar os NLS e a temperatura de inversão de fase foi determinada utilizando um banho de água. As amostras foram aquecidas lentamente e agitado suavemente até que a solução apareceu clara. A temperatura de inversão de fase para as SLNs feitas usando heneicosano lipídica é de 45 ° C. A Tabela 1 sumariza o tamanho de partícula, polidispersão, ponto de fusão e do calor latente de fusão para os NLS. Os NLS sintetizados utilizando as condições de processamento acima descri...

Discussão

Neste estudo, a síntese de NLS e a sua aplicabilidade para aplicações destinadas intracelulares foram exploradas. Estas nanopartículas biocompatíveis têm mostrado promissores como veículos de entrega para várias aplicações, incluindo a entrega de drogas, o silenciamento do gene, e tecnologias de vacina ^25-30. Ultra-pequenas SLNs foram sintetizados usando um processo fácil, e as suas interacções com células epiteliais primárias e células imunitárias primárias foram exploradas. SLNs foram concebidos para inclui...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vermelho Nilo (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, adequado para fluorescência, ≥ 98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polioxietileno (10) éter oleílico
Água	Sigma	W3500	Filtrado estéril, BioReagente, adequado para cultura de células
Filtro de seringa 0.2 µ m Supor Membrana de Baixa Ligação a Proteínas	Ciências da	PN4612	Não Pirogênico
Nanotrac Ultra	Número de série Microtrac	U1985IS	Instrumento
Calorímetro Exploratório Diferencial	Mettlet-Toledo		Instument
Fibroblastos humanos primários	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	Um meio líquido estéril para a cultura de fibroblastos dérmicos humanos.
Kit de Suplemento de Crescimento de Soro Baixo (Kit LSGS)	Life Technologies	S-003-K	Todos os componentes do Kit completo de
Ensaio de Proliferação de Células LSGS MTT	Trevigen	4890-025-K	Kit sensível para a medição da proliferação celular com base na redução do sal de tetrazólio, brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2- il]-2,5-difenil-tetrazólio (MTT)
Leitor de microplacas Safire2	Tecan	----	Instrumento
Fosfato tampolado salino	Sigma	P5493	Para biologia molecular
Recombinante murino GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, por SDS-PAGE em condições redutoras e visualizado por coloração de prata.
IL-4 murina recombinante;	Peprotech	214-14	>97%, por SDS-PAGE em condições redutoras e visualizado por coloração de prata.